洪言情，王 平，朱雪珂，王 強(qiáng)，范雪榮

(江南大學(xué) 生態(tài)紡織教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122)

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基于酶法交聯(lián)的再生納米彈性蛋白膜構(gòu)建*

洪言情，王 平，朱雪珂，王 強(qiáng)，范雪榮

(江南大學(xué) 生態(tài)紡織教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122)

彈性蛋白有良好的彈性、穩(wěn)定性和生物相容性，可作為構(gòu)建組織工程復(fù)合材料的組成部分。本文以4種不同的酚類(lèi)物質(zhì)為介體，通過(guò)酪氨酸酶催化氧化介體從而對(duì)彈性蛋白進(jìn)行酶法交聯(lián)，并借助靜電紡絲方法制備納米纖維膜。結(jié)果表明，酪氨酸酶能催化氧化酚類(lèi)介體物質(zhì)，且酶催化效率與酚類(lèi)物質(zhì)的種類(lèi)有關(guān)；SDS-PAGE凝膠電泳和體積排阻色譜(SEC)表明彈性蛋白在酪氨酸酶/咖啡酸以及酪氨酸酶/兒茶素體系中發(fā)生了交聯(lián)反應(yīng)，生成了大分子蛋白聚合物。圓二色譜(CD)結(jié)果表明酶促交聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致彈性蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，α-螺旋結(jié)構(gòu)含量增多。酪氨酸酶/兒茶素催化體系改善了彈性蛋白的可紡性，制得的納米纖維粗細(xì)均勻，且膜材料有較好的生物相容性。

彈性蛋白；酪氨酸酶；介體；靜電紡絲；生物相容性

0 引 言

作為一種細(xì)胞外基質(zhì)中高度交聯(lián)的纖維狀蛋白質(zhì)，彈性蛋白(Elastin，簡(jiǎn)稱EL)極難溶于水，具有被動(dòng)伸縮的特性，能賦予器官和組織可逆形變的能力[1-3]。因此，在經(jīng)常拉伸而變形的器官和組織，如肺、大動(dòng)脈及韌帶中都有大量的彈性蛋白，對(duì)維持器官和組織的正常運(yùn)轉(zhuǎn)起重要作用[4]。同時(shí)，彈性蛋白還有著良好的生物相容性、穩(wěn)定性和自組裝性等，使其成為較友好的生物材料而運(yùn)用于組織工程中[5-6]。然而，彈性蛋白由于高度交聯(lián)而不溶于水，使其難以加工成型，不同程度上限制了其在生物材料中的應(yīng)用[7]。水溶性彈性蛋白作為彈性蛋白的水解產(chǎn)物，可通過(guò)與其它高分子交聯(lián)的方法，制備不溶性生物材料[8]。

生物酶法作為一種新型的改性方法，與化學(xué)改性相比，具有反應(yīng)條件溫和、高效、專一以及生態(tài)環(huán)保的優(yōu)點(diǎn)。酪氨酸酶(Tyrosinase，簡(jiǎn)稱TYR，EC 1.14.18.1)是一種含銅的金屬酶，也被稱作多酚氧化酶，廣泛存在于自然界的微生物、植物以及動(dòng)物體內(nèi)[9]。酪氨酸酶具有雙重生物催化特性，既有單酚酶活性又有二酚酶活性，能將單酚物質(zhì)氧化生成鄰苯二酚，并繼續(xù)氧化成鄰苯醌。作為活性物質(zhì)的鄰苯醌能自身發(fā)生鍵合，也能與氨基、巰基等親核試劑發(fā)生席夫堿和邁克爾加成反應(yīng)反應(yīng)[10]。國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者通過(guò)酪氨酸酶對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行酶法改性，如Sampaio等[11-13]以酪氨酸酶催化氧化絲素蛋白上的酪氨酸?；瑥亩鴮ぞ厶墙又υ诮z素表面，驗(yàn)證了酪氨酸酶對(duì)蛋白改性的可行性。然而，由于不同蛋白間存在著酪氨酸含量與空間可及度的差異，使得部分蛋白不能夠被酪氨酸酶直接催化交聯(lián)改性。Thalmann等[14]通過(guò)酪氨酸酶催化氧化作為外源“介體”的咖啡酸，實(shí)現(xiàn)了對(duì)乳清蛋白、乳球蛋白以及溶菌酶的化學(xué)交聯(lián)，其反應(yīng)機(jī)理如圖1所示。

圖1 蛋白在咖啡酸/酪氨酸酶體系中交聯(lián)機(jī)理

目前，對(duì)彈性蛋白材料的研究主要集中在以化學(xué)法與其它高分子材料復(fù)合上，采用生物酶法進(jìn)行水溶性彈性蛋白生物材料構(gòu)建方面的研究鮮有報(bào)道。本文以4種不同的酚類(lèi)物質(zhì)為介體，借助于酪氨酸酶催化氧化作用，進(jìn)行了酶促?gòu)椥缘鞍捉宦?lián)研究，并制備出彈性蛋白納米纖維膜材料。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

實(shí)驗(yàn)材料：水溶性彈性蛋白(美國(guó)Amresco)；酪氨酸酶(900 U/mg，美國(guó)Worthington)；鄰苯二酚(PC，國(guó)藥試劑)；咖啡酸(CA，阿拉丁試劑)；兒茶素(CAT，Sigma)；阿魏酸(FA，阿拉丁試劑)；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、甲酸(國(guó)藥試劑)。

實(shí)驗(yàn)儀器：JPB-607型溶解氧分析儀(上海雷磁有限公司)；BIO-RAD Mini-P TET蛋白質(zhì)凝膠電泳儀(美國(guó)伯樂(lè)公司)；ALLIANCE E2695高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司); MOS-450型圓二色光譜儀(美國(guó)Biologic公司)；Su1510型掃描電子顯微鏡(日本HITACHI公司)；JYB-1800型注射泵(長(zhǎng)沙健源醫(yī)療科技有限公司)；ELISA酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酪氨酸酶酶促交聯(lián)彈性蛋白

配制不同酚類(lèi)介體(鄰苯二酚、咖啡酸、兒茶素或阿魏酸)溶液，加入0.25%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))彈性蛋白和100 U/mL酪氨酸酶液，在30 ℃、pH值為7條件下反應(yīng)8 h；介體濃度分別為0，0.1，0.5，1，2，5和10 mmol/L。

1.2.2 彈性蛋白納米纖維膜材料的制備

將上述反應(yīng)后的彈性蛋白冷凍干燥后，以98%甲酸溶解，分別配制成20%和30%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的紡絲液，構(gòu)建納米纖維膜。靜電紡參數(shù)：注射器針頭內(nèi)徑為0.7 mm，針頭至纖維收集輥筒間距為10 cm，紡絲電壓為25 kV，注射速度為0.3 mL/h。

1.3 測(cè)試方法

1.3.1 酶促反應(yīng)體系溶解氧測(cè)試

在密封條件下使用溶解氧分析儀測(cè)量反應(yīng)體系中的氧濃度，記錄不同反應(yīng)時(shí)間條件下體系溶解氧，直至體系中的溶解氧含量穩(wěn)定。

1.3.2 SDS-PAGE凝膠電泳

將20 μL樣品與4 μL上樣緩沖液混合均勻，并在100 ℃水浴中沸煮10 min，取5 μL混合液上樣到10%～16%梯度膠上，然后進(jìn)行電泳實(shí)驗(yàn)，濃縮膠階段電壓100 V，分離膠階段電壓200 V。電泳結(jié)束后，蛋白膠在考馬斯亮藍(lán) R-250染色，最后進(jìn)行脫色。

1.3.3 體積排阻色譜(SEC)

采用0.22 μm的濾膜對(duì)彈性蛋白溶液樣品進(jìn)行過(guò)濾，在高效液相色譜儀中分析蛋白分子量的變化。用含有0.3 mol/L的NaCl的磷酸緩沖液(50 mm, pH值為7)為洗脫液，洗脫速度為0.5 mL/h，以檢測(cè)波長(zhǎng)為214 nm的紫外檢測(cè)器檢測(cè)洗脫蛋白質(zhì)。

1.3.4 圓二色譜(CD)

通過(guò)圓二色光譜儀研究彈性蛋白溶液二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，取蛋白樣品加入到1 mm比色皿中，檢測(cè)波長(zhǎng)范圍為 195～250 nm的CD光譜，掃描速度100 nm/min。

1.3.5 掃描電子顯微鏡(SEM)

使用SEM觀察所制備的納米纖維膜的表觀形態(tài)結(jié)構(gòu)，樣品經(jīng)過(guò)濺射鍍膜處理，掃描時(shí)加速電壓為5 kV。

1.3.6 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

采用CCK-8實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)彈性蛋白納米纖維膜材料的生物相容性，樣品經(jīng)過(guò)24 h的紫外消毒殺菌后，以10%胎牛血清高糖培養(yǎng)基浸泡3 d，去除樣品得到浸漬培養(yǎng)基，備用。將100 μL的NIH/3T3細(xì)胞懸浮液(5×104個(gè)/mL)注入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，在溫度為37 ℃、飽和濕度以及5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h，使細(xì)胞完全貼壁，然后去除培養(yǎng)基，添加浸漬培養(yǎng)基再培養(yǎng)24 h。最后向每孔加入10 μL的CCK-8溶液，在培養(yǎng)箱中孵育2 h，并在酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處吸光度，每個(gè)樣品做5個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶促反應(yīng)體系溶解氧測(cè)試

酪氨酸酶催化氧化底物的過(guò)程中，需消耗溶液中的氧氣。測(cè)反應(yīng)體系中溶解氧濃度變化，可了解酪氨酸酶對(duì)不同底物的催化效率。實(shí)驗(yàn)中在不同底物中加入100 U/mL酪氨酸酶，測(cè)定密封反應(yīng)體系中溶解氧含量變化，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 酪氨酸酶催化不同底物溶解氧含量的變化

由圖2可以看出，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，酪氨酸酶溶液中溶氧量變化較少；酪氨酸酶/介體體系中氧含量隨處理時(shí)間延長(zhǎng)而急劇下降，其中鄰苯二酚溶液中含氧量下降速率最快，含氧量下降較慢的兒茶素在8 min后溶解氧也趨于消耗殆盡。圖2中3種酚類(lèi)介體均較易被酶催化氧化，這可能與其結(jié)構(gòu)特性相關(guān)，三者均含有鄰苯二酚結(jié)構(gòu)，使得酪氨酸酶可直接氧化底物成鄰苯醌類(lèi)物質(zhì)，而未經(jīng)歷催化效率較慢的單酚物質(zhì)羥基化生成鄰苯二酚過(guò)程。此外，3種酚類(lèi)體系耗氧量的快慢也表明酶催化氧化速率與底物結(jié)構(gòu)有關(guān)，底物結(jié)構(gòu)越簡(jiǎn)單，其催化速率也越快。

2.2 蛋白分子量分析

考慮到小分子介體酶促氧化后，可作為彈性蛋白分子間的天然交聯(lián)劑。實(shí)驗(yàn)中考察了介體濃度為2 mmol/L條件下，酪氨酸酶催化彈性蛋白交聯(lián)的效果，借助SDS-PAGE凝膠電泳測(cè)定彈性蛋白體系蛋白分子量分布的變化，結(jié)果見(jiàn)圖3。

M-標(biāo)準(zhǔn)蛋白, 1-EL, 2-EL/TYR, 3-EL/PC, 4-EL/TYR/PC, 5-EL/CA, 6-EL/TRY/CA, 7-EL/CAT, 8-EL/TYR/CAT, 9-EL/FA, 10-EL/TYR/FA

圖3中彈性蛋白分子量主要集中在60 kD左右，經(jīng)酪氨酸酶處理后，其分子量并沒(méi)有發(fā)生變化，表明酪氨酸酶對(duì)彈性蛋白沒(méi)有催化作用。對(duì)于只加酚類(lèi)介體的彈性蛋白的分子量也幾乎沒(méi)有變化，表明僅介體處理并不能促進(jìn)彈性蛋白交聯(lián)。彈性蛋白在酪氨酸酶/咖啡酸、酪氨酸酶/兒茶素催化體系中分子量均明顯增大，表明彈性蛋白分子間發(fā)生了交聯(lián)。盡管鄰苯二酚較易被酪氨酸酶催化氧化，但圖3中酪氨酸酶/鄰苯二酚處理后彈性蛋白分子量并未增加，其原因可能與鄰苯二酚氧化產(chǎn)物趨于發(fā)生自聚相關(guān)[15]。

為考察酪氨酸酶/介體催化體系中介體濃度對(duì)交聯(lián)效果的影響，選用圖3中介體效果較明顯的兒茶素進(jìn)行研究。考察不同兒茶素體濃度條件下酶促?gòu)椥缘鞍椎慕宦?lián)效果，結(jié)果見(jiàn)圖4。

M-標(biāo)準(zhǔn)蛋白, 1-EL, 2-EL/TYR, 3-EL/TYR/0.1 mmol/L CAT, 4-EL/TYR/0.5 mmol/L CAT, 5-EL/TYR/1 mmol/L CAT, 6-EL/TYR/2 mmol/L CAT, 7-EL/TYR/5 mmol/L CAT, 8-EL/TYR/10 mmol/L CAT

圖4中可以看出，在一定濃度范圍內(nèi)，彈性蛋白分子量隨著兒茶素濃度增加而增大，其原因可能與兒茶素濃度增大，被催化生成的活性醌類(lèi)物質(zhì)增多，酶促?gòu)椥缘鞍捉宦?lián)效率隨之增加。當(dāng)兒茶素濃度繼續(xù)增加至10 mmol/L，泳道8的上方條帶深度不及泳道7，這可能是由于較高濃度的兒茶素氧化產(chǎn)物部分發(fā)生了自聚反應(yīng)所致[15]，使彈性蛋白分子間交聯(lián)效果不再進(jìn)一步增加。借助體積排阻法，測(cè)定不同兒茶素濃度催化條件下彈性蛋白酶促交聯(lián)后的分子量分布，結(jié)果如圖5。

圖5 不同兒茶素濃度條件下酶促反應(yīng)后彈性蛋白體積排阻色譜

圖5中可以看出，彈性蛋白分子在23.8 min時(shí)有一明顯的洗脫峰，表明彈性蛋白分子量比較集中。經(jīng)過(guò)酪氨酸酶和5 mmol/L兒茶素催化體系處理后，彈性蛋白樣品的洗脫時(shí)間和洗脫峰的峰型發(fā)生了明顯的變化，如圖5所示，t1與t2區(qū)間的蛋白出峰時(shí)間提前，原先23.8 min處洗脫峰強(qiáng)度減弱，表明明彈性蛋白分子發(fā)生了交聯(lián)反應(yīng)，形成了新的彈性蛋白大分子。此外，色譜圖中在28 min左右出現(xiàn)延遲峰，可能是由于兒茶素分子間發(fā)生聚合反應(yīng)引起的[15]。

2.3 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化

圓二色譜是研究溶液中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的快速、有效方法。實(shí)驗(yàn)中借助于圓二色譜，考察彈性蛋白在以兒茶素為介體的酶促交聯(lián)過(guò)程中二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 不同兒茶素濃度條件下酶促反應(yīng)后彈性蛋白圓二色譜圖

從圖6可以看到，彈性蛋白在208和220 nm處有負(fù)峰，這說(shuō)明彈性蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋為主。隨著兒茶素濃度的增加，彈性蛋白的交聯(lián)程度增大，彈性蛋白在208 nm處負(fù)峰基本消失，同時(shí)220 nm處負(fù)峰強(qiáng)度增大，表明彈性蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。通過(guò)計(jì)算得到彈性蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的分布，如表1所示。

表1 彈性蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)變化

表1結(jié)果表明，在酪氨酸酶/兒茶素催化體系中，彈性蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)隨著兒茶素濃度的增大而發(fā)生變化，其中α-螺旋結(jié)構(gòu)含量明顯增大，無(wú)規(guī)卷曲含量減少，即彈性蛋白交聯(lián)導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)更加完整，這為再生納米彈性蛋白膜材料構(gòu)建奠定了基礎(chǔ)。

2.4 彈性蛋白納米膜材料的形態(tài)

彈性蛋白經(jīng)酪氨酸酶和兒茶素(5 mmol/L)介質(zhì)體系處理后，以甲酸為溶劑制備20%和30%彈性蛋白的紡絲液，考察酶促改性對(duì)彈性蛋白可紡性的影響，并與空白樣對(duì)比，結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 彈性蛋白納米纖維膜材料SEM圖

從圖7可以看出，當(dāng)彈性蛋白濃度為20%時(shí)紡絲效果較差(圖7(a))，表現(xiàn)為全為串珠液滴，其原因與紡絲液粘度較低相關(guān)；當(dāng)彈性蛋白經(jīng)過(guò)酪氨酸酶/兒茶素催化處理后，納米纖維膜形貌發(fā)生變化，珠狀物減少(圖7(b))。增加紡絲液中彈性蛋白濃度至30%，未經(jīng)酶處理樣品制得的纖維珠狀物減少(圖7(c))；以酶法處理制備的納米纖維直徑略有增加(圖7(d))，纖維表面變得較光滑。

2.5 改性彈性蛋白毒理性的研究

在構(gòu)建彈性蛋白納米纖維膜基礎(chǔ)上，以CCK-8法測(cè)定NIH/3T3細(xì)胞的存活率評(píng)定該支架材料的生物相容性，結(jié)果如圖8。從圖中可以看出，細(xì)胞在彈性蛋白浸漬培養(yǎng)基中有著90%以上的存活率，說(shuō)明彈性蛋白有著很好的生物相容性，能夠作為一種優(yōu)良的生物材料運(yùn)用在組織工程中。同時(shí)，細(xì)胞在改性后的彈性蛋白納米支架的存活率與改性前的基本持平，這表明兒茶素與酪氨酸酶并沒(méi)有作為一種有毒物質(zhì)釋放到培養(yǎng)基中，即酪氨酸酶/兒茶素催化體系并沒(méi)有對(duì)彈性蛋白生物相容性產(chǎn)生影響，

圖8 NIH/3T3細(xì)胞在蛋白納米纖維膜表面的存活率

3 結(jié) 論

(1) 酪氨酸酶催化氧化彈性蛋白時(shí)，體系中溶氧量未明顯變化，彈性蛋白分子量也沒(méi)有增大，表明酪氨酸酶對(duì)彈性蛋白催化氧化作用較小。

(2) 應(yīng)用酪氨酸酶/兒茶素介體可使彈性蛋白分子間發(fā)生交聯(lián)，形成大分子蛋白聚合物；改性后彈性蛋白α-螺旋結(jié)構(gòu)含量增大，無(wú)定型結(jié)構(gòu)減少，表明經(jīng)酶催化交聯(lián)后蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)更趨于完整。

(3) 經(jīng)酪氨酸酶/兒茶素介體改性后，彈性蛋白可紡性增加，制得的納米纖維直徑趨于均勻，納米膜材料的生物相容性較好。

致謝：感謝江蘇省“青藍(lán)工程”項(xiàng)目的大力支持！

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Preparation of elastin nano-fiber membrane via enzyme-catalyzed cross-linking

HONG Yanqing, WANG Ping, ZHU Xueke, WANG Qiang, FAN Xuerong

(Key Laboratory of Eco-Textiles, Ministry of Education,Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

Elastin has excellent properties of elasticity, stability and biocompatibility, and it could be used as a major composite biomaterial for tissue engineering. In the present work, the enzyme-catalyzed cross-linking of elastin was carried out by using tyrosinase and four mediators of phenolic compounds, followed by preparation of elastin nano-fiber membrane by using electrospinning method. The results indicated that tyrosinase could oxidize the phenolic mediators and the oxidation efficiency was highly depended on the sort of phenolic compounds. SDS-PAGE and size exclusion chromatography (SEC) analysis demonstrated that elastin could be cross-linked by tyrosinase in the presence of catechin or caffeic acid, resulting in an increase of molecular weight of elastin. Circular Dichroism (CD) data revealed that the enzymatic cross-linking led to the changes of the secondary structures, the content of α-Helix was increased. Modification of elastin with tyrosinase/catechin improved elastin’s spinnability, and the obtained nano-fibers exhibited uniform fineness and good biocompatibility as well.

elastin;tyrosinase; mediator; electrospinning; biocompatibility

1001-9731(2016)10-10076-05

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(51373071)

2015-07-02

2016-01-14 通訊作者：王 平，E-mail: pwang@jiangnan.edu.cn

洪言情 (1989-)，男，江西景德鎮(zhèn)人，碩士，師承王平教授，從事紡織品生態(tài)染整加工技術(shù)研究。

TS195

A

10.3969/j.issn.1001-9731.2016.10.013