李小冬，蔡璐，李世歌，莫本田，韓永芬，王小利

(貴州省草業(yè)研究所, 貴州 貴陽 550006)

?

免預培養(yǎng)高效菊苣遺傳轉(zhuǎn)化方法

李小冬，蔡璐，李世歌，莫本田，韓永芬，王小利*

(貴州省草業(yè)研究所, 貴州 貴陽 550006)

轉(zhuǎn)基因技術對基因功能研究與農(nóng)作物種質(zhì)資源創(chuàng)新具有重要作用，在牧草類作物菊苣中相應的研究還處于初級階段。本研究改進了菊苣組織培養(yǎng)與遺傳轉(zhuǎn)化方法，采用暗光培養(yǎng)的菊苣子葉為外植體，經(jīng)農(nóng)桿菌侵染后置于光照條件下進行共培養(yǎng)，利用子葉細胞從暗光轉(zhuǎn)移到光照條件下細胞迅速分裂的特點，實現(xiàn)植物遺傳轉(zhuǎn)化。與已報道的轉(zhuǎn)化方法(光照條件下的真葉外植體先進行2～3 d預培養(yǎng)，再進行農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化與共培養(yǎng))相比，本方法出苗率與已報道方法相當，達90%以上；比不經(jīng)預培養(yǎng)方法的出苗率要高80%～90%，能極大節(jié)省人力物力。同時本研究發(fā)現(xiàn)，在愈傷誘導、植物分化以及生根培養(yǎng)中，依次遞減細胞分裂素的強度與濃度，能顯著降低愈傷和再生苗的玻璃化程度，與一直采用強細胞分裂素相比，改進方法愈傷玻璃化比率下降約9%，再生苗玻璃化比例下降約16%。

菊苣；組織培養(yǎng)；轉(zhuǎn)基因；玻璃化；子葉

菊苣(Cichoriumintybus)是菊科多年生草本植物，又稱咖啡草或咖啡蘿卜。其根、葉均可食，是一種重要制糖原料、香料、蔬菜及飼草作物[1]；同時是一種重要的制藥原料，富含倍半萜烯內(nèi)酯、糖苷、類黃酮、香豆素、花青素、有機酸與細胞分裂素等，具有治療腹瀉、發(fā)熱及嘔吐功效[2-3]。自從20世紀80年代引入我國后，在山西、陜西、浙江、河南等地推廣，現(xiàn)主要分布在西北、華北、東北等暖溫帶地區(qū)[4-5]。然而由于菊苣原產(chǎn)地在歐洲[6]，我國擁有的野生種質(zhì)資源比較匱乏，以常規(guī)育種的方法對菊苣遺傳改良受到極大的限制。同時其適宜性廣，在全國各地都有種植，但在各個區(qū)域可能面臨不同的制約條件，所以借助現(xiàn)代分子生物學手段實現(xiàn)種質(zhì)創(chuàng)新，是菊苣育種的一個重要環(huán)節(jié)[7]。轉(zhuǎn)基因方法能夠打破物種界限，快速定向的對目標性狀進行遺傳改良，加快育種進程，是一種高效、經(jīng)濟的新技術。

菊苣的體外再生體系從20世紀80年代就已經(jīng)開始研究，1985年Profumo等[8]首次利用懸浮細胞系成功誘導了體細胞胚，培育了再生植株，科學家們利用根結(jié)[9-10]、葉片[11-12]、葉柄[13]、莖[14]等不同外植體都成功培育了再生植株。在隨后的研究中，通過在培養(yǎng)基中添加甘油、七葉樹甙、硫酸腺嘌呤鹽等物質(zhì)提高菊苣組織培養(yǎng)過程中愈傷與體外再生植株形成的概率，但轉(zhuǎn)化效率仍然不高[15]。最近的研究主要集中在對組織培養(yǎng)過程的激素種類和濃度進行優(yōu)化，特別是強細胞分裂素噻苯隆(TDZ)和6-芐基腺嘌呤(6-BA)的應用，顯著提高了組織培養(yǎng)過程中愈傷誘導與植株分化的成功率[11,14]，組培體系的成功建立為轉(zhuǎn)基因研究奠定了基礎。

與其他農(nóng)作物相比，菊苣轉(zhuǎn)基因研究開展的相對較晚，涉及的目標基因主要包括抗性基因npt基因[6]，報告基因GUS[16]等，功能基因的遺傳轉(zhuǎn)化僅限于抗凍基因LOL1[17]、抗壞血酸過氧化物酶APX[18]、編碼Na+/H+轉(zhuǎn)運蛋白的基因AtNHX1[5]以及TaNHX2[19]等。這些遺傳轉(zhuǎn)化方法大都采用3～4周的植株葉片或者須根作為外植體，在農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化之前，外植體材料需先經(jīng)過一個預培養(yǎng)過程，以防止農(nóng)桿菌侵染殺死外植體，操作過程較為繁瑣。錯過外植體最佳取樣時期、預培養(yǎng)時間不合適以及農(nóng)桿菌侵染的毒副作用都可能導致轉(zhuǎn)化效率下降甚至轉(zhuǎn)化失敗[20]。因此，研究更加簡單、高效、穩(wěn)定的菊苣轉(zhuǎn)基因方法是實現(xiàn)對菊苣高通量遺傳轉(zhuǎn)化的前提與技術瓶頸。

1　材料與方法

1.1實驗材料與生長條件

本研究于2013年7月采用貴州省草業(yè)研究所育成的牧草品種黔引普那菊苣(Cichoriumintybuscv. Puna qianying)為試驗材料，植株培養(yǎng)條件參考[21]，具體為光照16 h，黑暗8 h，生長溫度22 ℃，光照強度為230～300 μE/(m2·s)。

1.2培養(yǎng)基的配方與準備

按照表1的配方準備菊苣遺傳轉(zhuǎn)化所需所有的培養(yǎng)基，并調(diào)整pH到5.8，滅菌備用，植物激素和抗生素在使用前加入。

1.3種子消毒與外植體制備

挑選300粒飽滿的菊苣種子，放入50 mL離心管中，用45 mL自來水浸泡10～15 min, 去除表面漂浮的劣質(zhì)種子與自來水。加入45 mL 75%的酒精，劇烈震蕩，消毒處理2～3 min。去除酒精，加入45 mL市售84消毒液，劇烈震蕩，消毒處理10 min。更換新鮮的84消毒液，重復該步驟一次。去除84消毒液，用45 mL滅菌水清洗種子3～5次。將消毒好的種子播種于M0培養(yǎng)基，置于22 ℃黑暗培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～5 d至種子萌發(fā)。子葉外植體制備：在超凈工作臺中，剪取新生的子葉，用手術刀將其分開并切成2～3個小塊，制備的外植體放置于暗光條件下備用。真葉外植體制備：取生長28 d的無菌苗的真葉用手術刀將其切成3～5 mm2的小塊備用。

1.4遺傳轉(zhuǎn)化載體的準備與農(nóng)桿菌的活化

轉(zhuǎn)化所用的載體為pBI121-AtmiR156過量表達載體(圖1)，農(nóng)桿菌菌株為GV3101，將保存的菌種在抗性平皿(LB+50 mg/L Gent+50 mg/L Km,LB配方:酵母提取物5 g/L,胰蛋白胨10 g/L, 氯化鈉10 g/L)上劃線活化，28 ℃培養(yǎng)3 d，挑取活化的含有目標質(zhì)粒的農(nóng)桿菌單菌落到5 mL LB+25 mg/L Gent+50 mg/L Km的液體培養(yǎng)基，28 ℃, 220 r/min搖床上活化24 h。按照1∶50的比例將活化的菌液接種到50 mL LB+25 mg/L Gent+50 mg/L Km的培養(yǎng)基中，28 ℃, 220 r/min轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)8～16 h，至菌液OD600=0.8。 取 20 mL新鮮培養(yǎng)的菌液，室溫5000 r/min 離心15 min。棄上清，加入20 mL DM培養(yǎng)基，用5 mL移液器輕輕將農(nóng)桿菌菌體懸浮于DM培養(yǎng)基里。去上清，用20 mL DM重新懸浮一次，取2 mL懸浮菌液稀釋到20 mL DM培養(yǎng)基中，農(nóng)桿菌準備完成，在2 h內(nèi)使用效果不受影響。

表1　菊苣遺傳轉(zhuǎn)化所需培養(yǎng)基的配方

DM：稀釋培養(yǎng)基;M0：種子萌發(fā)培養(yǎng);M1：共培養(yǎng)培養(yǎng)基;M2：愈傷誘導培養(yǎng)基;M3：分化培養(yǎng)基;M4：生根培養(yǎng)基。DM: Dilution medium; M0: Seed germination medium; M1: Co-culture medium; M2: Callus induction medium; M3: Differential medium; M4: Rooting medium.

圖1　pBI121-AtmiR156載體結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1　A schematic diagram of pBI121-AtmiR156

1.5菊苣遺傳轉(zhuǎn)化

將準備好的外植體與農(nóng)桿菌一起放到無菌培養(yǎng)皿中，浸染15～20 min,隔4～5 min輕輕搖晃培養(yǎng)皿一次,使農(nóng)桿菌與外植體充分接觸。去除轉(zhuǎn)化菌液，將侵染好的外植體轉(zhuǎn)到M1培養(yǎng)基中，每皿60～70個外植體，置于人工氣候室，24 ℃的條件下共培養(yǎng)2～3 d。用加100 mg/mL頭孢霉素的無菌水清洗共培養(yǎng)的外植體2～3次，然后將共培養(yǎng)的外植體均勻放置于M2培養(yǎng)基上培養(yǎng)至長出綠色愈傷。將綠色愈傷轉(zhuǎn)到M3培養(yǎng)基中，每星期繼代一次，直至綠芽長至2～5 cm。將再生植株從愈傷組織上切下，插入到M4培養(yǎng)基中生根培養(yǎng)15～20 d，直到根系發(fā)育完成。將培養(yǎng)瓶蓋打開，加入5～10 mL無菌水，在人工氣候室開蓋煉苗5～7 d，將無菌苗取出，洗凈根部的瓊脂，移栽到泥炭土∶蛭石=1∶1的基質(zhì)中，置于人工氣候室培養(yǎng)。

1.6轉(zhuǎn)基因菊苣鑒定

采用天根DNA提取試劑盒(DP305-2)提取轉(zhuǎn)化植株的DNA，采用上海生工 2×Taq PCR反應試劑盒檢測表達載體上NPT基因,上游引物NPTF [5′-GTGCCCTGAATGAACTGC-3′]，下游引物NPTR [5′-CAATATCACGGGTAGCCA-3′]組合進行PCR檢測。配制PCR反應混合物：2×Taq PCR Mixture，10 μL； NPTF(10 mmol/L)，1 μL； NPTR(10 mmol/L)，1 μL；DNA，2 μL；dd H2O，6 μL。反應程序如下：94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，30循環(huán)，72 ℃ 5 min。

1.7數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010進行實驗數(shù)據(jù)分析，P<0.05被認為是差異顯著，作圖采用Excel 2010 與PowerPoint 2010。

2　結(jié)果與分析

2.1遺傳轉(zhuǎn)化流程

將消毒好的菊苣種子均勻播種在1/2 MS培養(yǎng)基上黑暗培養(yǎng)5～7 d至2片子葉張開(圖2A)，挑選飽滿健壯的子葉從下胚軸處剪下，并用解剖刀將其中分為2份，加入準備好的農(nóng)桿菌菌液進行遺傳轉(zhuǎn)化(圖2B)，將轉(zhuǎn)化好的外植體均勻放置于共培養(yǎng)基上，光下培養(yǎng)2～3 d(圖2C)，將共培養(yǎng)組織轉(zhuǎn)移到愈傷誘導培養(yǎng)基上，每星期更換一次培養(yǎng)基，直到長成黃綠色綠色愈傷組織，并將其轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)2～3周，每周將愈傷轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基直到長出綠色芽點(圖2D)，將再生芽切下轉(zhuǎn)移生根培養(yǎng)基(圖2E)，待植物長出不定根后將培養(yǎng)瓶打開煉苗3～5 d(圖2F)，將轉(zhuǎn)基因材料移栽到花缽(圖2G)，通過PCR等分子手段對轉(zhuǎn)基因植株進行鑒定，將陽性植株轉(zhuǎn)移到大田進行加代繁殖(圖2H)。

圖2　菊苣轉(zhuǎn)基因流程圖，從播種到移栽陽性苗Fig.2　Pictures of transgenic chicory, from sowing seeds to planting the positive transgenic seedlings

2.2不同來源植物外植體

本實驗分別采用子葉與真葉兩種不同的外植體對菊苣進行遺傳轉(zhuǎn)化，其外植體制備的詳細過程參照材料與方法1.3。在未經(jīng)預培養(yǎng)直接進行農(nóng)桿菌侵染條件下，子葉外植體的出愈傷比例能達95.79%(表2)，而真葉直接侵染存活率只有0.86%(表2)。將外植體進行一個短暫的預培養(yǎng)(2 d)，以真葉為外植體的出愈傷的比例顯著提高達到93.31%(表2)，與子葉的效果相當。經(jīng)過2 d預培養(yǎng)的子葉外植體進行農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化時，愈傷誘導率與處理1相比略有下降，但差異不顯著(表2)。從愈傷誘導效果、實驗時間成本和經(jīng)濟成本綜合考慮，處理1以3～5 d子葉外植體直接進行農(nóng)桿菌侵染的轉(zhuǎn)化方法最好。

2.3不同強度的細胞分裂素對愈傷以及再生植株玻璃化的影響

在誘導愈傷以及再生苗分化過程中我們發(fā)現(xiàn)組培過程中再生組織玻璃化程度與細胞分裂素的強度密切相關，以子葉為外植體，在共培養(yǎng)階段采用強細胞分裂素0.01 mg/L TDZ+1.0 mg/L IAA快速誘導細胞分裂，在誘導愈傷以及分化過程分別采用不同強度的細胞分裂素進行誘導，包括0.01 mg/L TDZ+1.0 mg/L IAA，2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IAA，1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IAA 3種不同(濃度)的激素組合。其中，在愈傷和再生苗誘導過程中，采用低分化強度的細胞分裂素6-BA誘導能顯著減低玻璃化比例，最適宜的愈傷誘導激素組合為2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IAA，最適宜的再生苗誘導激素組合為1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IAA(表3)。

表2　不同外植體來源和處理方式對愈傷形成率的影響

不同字母差異達極顯著水平(P<0.01)。Different letters stands for a significance atP<0.01 level.

表3　不同激素組合對愈傷及再生苗玻璃化的情況

TDZ，噻苯?。?-BA，6-芐氨基嘌呤；IAA，生長素, 不同字母代表差異達極顯著水平(P<0.01)。

TDZ, Thidiazuron; 6-BA, 6-benzylaminopurine; IAA, Indole acetic acid. Different letters stands for a significance atP<0.01 level.

圖4　轉(zhuǎn)基因菊苣分子檢測，NPT (A)與35S+AtmiR156R檢測(B)Fig.4　Detections of transgenic chicory, NPT (A) and 35S+AtmiR156R detections (B) 　M為DNA maker;1～22：轉(zhuǎn)基因菊苣樣品代表；23:陰性對照(非轉(zhuǎn)基因菊苣)；24:陽性對照(A里面為pBI121質(zhì)粒，B為pBI121-AtmiR156)。M stands for DNA maker, 1-22 were the transgenic samples, 23 was negative control (wild chicory), 24 was positive control (pBI121 for A, pBI121-AtmiR156 for B).

2.4菊苣轉(zhuǎn)基因苗的鑒定與評價

采用檢測抗性標記的方法PCR擴增140個轉(zhuǎn)基因菊苣抗性標記NPT基因。并進行電泳分離，結(jié)果顯示132個單株(94.3%)能夠擴增出目的條帶，大小與陽性對照(以pBI121質(zhì)粒為模板)相同，而陰性對照(以非轉(zhuǎn)基因菊苣為模板)則無擴增，表明轉(zhuǎn)化材料中已經(jīng)含有外源基因DNA片段(圖4A)，隨機挑選22株陽性轉(zhuǎn)基因植株，與陽性對照(pBI121-AtmiR156)和陰性對照(非轉(zhuǎn)基因植株)一起，利用35S+AtmiR156R進行檢測擴增，所有挑選的植株都能擴增出目標條帶(圖4B)。

3　討論與小結(jié)

轉(zhuǎn)基因作物具有高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)等特點,是解決糧食短缺、環(huán)境破壞等世界性難題的主要手段之一，農(nóng)作物轉(zhuǎn)基因研究是未來農(nóng)業(yè)研究的一個熱點與重點領域[22]。以棉花(Gossypiumhirsutum)、油菜(Brassicacampestris)、玉米(Zeamays)以及木瓜(Chaenomelessinensis)為代表的農(nóng)作物的轉(zhuǎn)基因育種及推廣工作已經(jīng)取得了巨大的突破，通過轉(zhuǎn)基因技術已經(jīng)在農(nóng)作物產(chǎn)量、抗逆性、抗病蟲以及抗雜草等方面對傳統(tǒng)品種實現(xiàn)定向改良[12, 23]。然而，牧草類作物開展相關研究相對較少，在苜蓿(Medicagosativa)、飼用玉米等應用較廣的牧草品種已經(jīng)有成功報到，通過過量表達野生大豆(Glycinesoja)WRKY20能夠增強紫花苜蓿對干旱和鹽脅迫的抵抗力[24]。過量表達CBF基因能夠顯著提高飼用玉米對低溫的抵抗力[25]。然而對于應用相對較少的牧草開展基因工程研究相對滯后，制約轉(zhuǎn)基因研究的技術瓶頸就是高效率的遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立。

菊苣是一種優(yōu)質(zhì)的菊科牧草，在西南喀斯特地區(qū)，酸性土壤及高溫干旱氣候限制了紫花苜蓿應用推廣，菊苣重要性更加突出。前人對菊苣組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化早已展開，并建立多個以不同營養(yǎng)器官為外植體來源的組培再生體系，然而只有有限的轉(zhuǎn)基因研究被報道，主要原因之一是遺傳轉(zhuǎn)化效率不高，在趙龍等[4]的研究中，普那菊苣(Cichoriumintybuscv. Puna)陽性轉(zhuǎn)化率只有10%，將軍菊苣(Cichoriumintybuscv. Cmmadrhne)只有13%，不能滿足高通量遺傳轉(zhuǎn)化的需要。與已建立的方法相比，本研究的方法在遺傳轉(zhuǎn)化的多個環(huán)節(jié)都有技術革新[26]。在外植體準備方面，我們采用暗培養(yǎng)的子葉組織作為外植體，前人多用4周大的真葉葉片或葉柄等作為外植體，比較脆弱，承受不了酒精和84消毒液(對植物傷口損傷較大，對人危害較小)的毒害而只能用劇毒的升汞(對植物傷口損傷較小，對人危害較大)來滅菌。本發(fā)明采用的子葉外植體可以由消毒的種子萌發(fā)而來，而子葉由于有種皮保護，可以采用酒精和84消毒液滅菌方法，保護實驗操作者和環(huán)境免受升汞的危害。此外，本研究的方法簡化了實驗步驟、縮短了實驗時間、減少了實驗成本。以真葉為外植體的研究中，外植體準備需要4周，制備的外植體需要預培養(yǎng)2～3 d才能用于遺傳轉(zhuǎn)化[20]，本研究以子葉為外植體只要萌發(fā)3～5 d,即可直接用于遺傳轉(zhuǎn)化。由于子葉細胞貯存了豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，具有良好的分生能力。在黑暗條件下，子葉細胞分裂受到抑制，在恢復光照條件后能利用自身的營養(yǎng)物質(zhì)迅速分裂[21]。因此，不需要對外植體預培養(yǎng)可直接用于遺傳轉(zhuǎn)化，極大地減少了人力、物力與時間成本。

細胞分裂素的種類和濃度對組培再生苗具有重要影響[11]。在共培養(yǎng)時，希望能夠迅速誘導細胞分裂完成遺傳轉(zhuǎn)化，采用強細胞分裂素誘導細胞分化。在后續(xù)的愈傷誘導、植株分化以及生根培養(yǎng)等環(huán)節(jié)我們采用強度和濃度遞減的細胞分裂素進行培養(yǎng)，有效地降低了再生苗的玻璃化比例(圖5)。本研究建立的遺傳轉(zhuǎn)化方法成功率高，操作簡單，可以進行高通量操作。

[1]Bais H P, Ravishankar G A.CichoriumintybusL-cultivation, processing, utility, value addition and biotechnology, with an emphasis on current status and future prospects. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2001, 81(5): 467-484.

[2]Silva R. Use of inulin as a natural texture modifier. Cereal Foods World, 1996, 41(10): 792-794.

[3]Meyer D, Stasse-Wolthuis M. The bifidogenic effect of inulin and oligofructose and its consequences for gut health. European Journal of Clinical Nutrition, 2009, 63(11): 1277-1289.

[4]Zhao L, Chen D D, Liang M X,etal.Comparative study on regeneration and genetic transformation between puna chicory and commander chicory. Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica, 2012, 32(11): 2169-2176.

[5]Zhao Y W, Wang Y J, Bu H Y,etal. Transformation ofCichoriumintybuswith the AtNHX1 gene and salinity tolerance of the transformants. Acta Prataculturae Sinica, 2009, 18(3): 103-109.

[6]Matvieieva N, Shakhovsky A, Kvasko O,etal. High frequency genetic transformation ofCichoriumintybusL. usingnptll gene as a selective marker. Cytology and Genetics, 2015, 49(4): 220-225.

[7]Matvieieva N, Kishchenko O, Potrochov A,etal. Regeneration of transgenic plants from hairy roots ofCichoriumintybusL. var. Foliosum Hegi. Cytology and Genetics, 2011, 45(5): 277-281.

[8]Profumo P, Gastaldo P, Caffaro L,etal. Callus induction and plantlet regeneration inCichoriumintybusL.: II. Effect of different hormonal treatments. Protoplasma, 1985, 126(3): 215-220.

[9]Nandagopal S, Ranjitha Kumari B. Effectiveness of auxin induced in vitro root culture in chicory. Journal of Central European Agriculture, 2007, 8(1): 73-80.

[10]Maroufi A, Karimi M, Mehdikhanlou K,etal. Regeneration ability and genetic transformation of root type chicory (Cichoriumintybusvar. sativum). African Journal of Biotechnology, 2016, 11(56): 11874-11886.

[11]Yucesan B, Turker A U, Gurel E. TDZ-induced high frequency plant regeneration through multiple shoot formation in witloof chicory (CichoriumintybusL.). Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 2007, 91(3): 243-250.

[12]Doliński R, Olek A. Micropropagation of wild chicory (CichoriumintybusL. var. silvestre Bisch.) from leaf explants. Acta Scientiarum Polonorum, Hortorum Cultus=Ogrodnictwo, 2013, 12(6): 33-44.

[13]Park E, Lim H. Establishment of an efficient in vitro plant regeneration system in chicory (CichoriumintybusL. var. sativus). International Symposium on Vegetable Quality of Fresh and Fermented Vegetables, 1997, 483: 367-370.

[14]Abdin M, Ilah A. Plant regeneration through somatic embryogenesis from stem and petiole explants of Indian chicory (CichoriumintybusL.). Indian Journal of Biotechnology, 2007, 6(2): 250.

[15]Nandagopal S, Ranjitha Kumari B. Adenine sulphate induced high frequency shoot organogenesis in callus and in vitro flowering ofCichoriumintybusL. cv. Focus-a potent medicinal plant. Acta Agriculturae Slovenica, 2006, 87(2): 415-425.

[16]Pieron S, Watillon B. Expression of a chimericGUSgene construct as a tool to study nodule morphogenesis in chicory leaves. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 2001, 66(3): 159-165.

[17]Williams F M K, Davey M R, Power J B,etal. Chicory (CichoriumintybusL.) expressing the lol1 gene exhibits inhibition of ice recrystallisation[C]// EUCARPIA Leafy Vegetables 2003. Proceedings of the EUCARPIA Meeting on Leafy Vegetables Genetics and Breeding, Noordwijkerhout, Netherlands, 19-21 March 2003.

[18]Zhang L J, Cheng L M, Du J Z,etal. CottonAPXgene enhances stress tolerance ofCichoriumintybus. Acta Agrestia Sinica, 2012, 20(1): 152-158.

[19]Zhang L J, Cheng L M, Du J Z,etal. Introduction ofTaNHX2 gene enhanced salt tolerance of transgenic puna chicory plants. Acta Ecologica Sinica, 2011, 31(18): 5264-5272.

[20]Cheng L M, Sun Y, Wang Y X. A research of several elements that affect transformation ofCichoriumintybus[C]// The Abstract of Assembly of National Plant Growth Regulation Symposium, 2007.

[21]Li X, Yu E, Fan C,etal. Developmental, cytological and transcriptional analysis of autotetraploid Arabidopsis. Planta, 2012, 236(2): 579-596.

[22]Gilbert N. A hard look at GM crops. Nature, 2013, 497: 24-26.

[23]Brévault T, Heuberger S, Zhang M,etal. Potential shortfall of pyramided transgenic cotton for insect resistance management. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2013, 110(15): 5806-5811.

[24]Tang L, Cai H, Zhai H,etal. Overexpression ofGlycinesojaWRKY20 enhances both drought and salt tolerance in transgenic alfalfa (MedicagosativaL.). Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC), 2014, 118(1): 77-86.

[25]Xiang B J, Li C J, Zhang J,etal. Studies on cloning and transformation ofCBF1 gene of maize grass. Animal Husbandry and Feed Science, 2013, 5(4): 189.

[26]Song S F, Cao F, Yang P Z,etal. High efficient system establishment on plant regeneration and study on genetics transformation in puna chicory (CichoriumintybusL.). Molecular Plant Breeding, 2006, 4(4): 565-570.

[4]趙龍, 陳丹丹, 梁明祥, 等. 2 種菊苣再生體系及遺傳轉(zhuǎn)化效率的比較. 西北植物學報, 2012, 32(11): 2169-2176.

[5]趙宇偉, 王英娟, 步懷宇, 等.AtNHX1 基因?qū)哲牡霓D(zhuǎn)化和耐鹽性研究.草業(yè)學報, 2009, 18(3): 103-109.

[18]張麗君, 程林梅, 杜建中, 等. 導入APX基因提高了普那菊苣植株的抗逆性. 草地學報, 2012, 20(1): 152-158.

[19]張麗君, 程林梅, 杜建中, 等. 導入TaNHX2 基因提高了轉(zhuǎn)基因普那菊苣的耐鹽性. 生態(tài)學報, 2011, 31(18): 5264-5272.

[20]程林梅, 孫毅, 王亦學. 影響菊苣遺傳轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)幾種因素的研究[C]// 2007 年全國植物生長物質(zhì)研討會論文摘要匯編, 2007.

[26]宋書鋒, 曹鳳, 楊培志, 等. 普那菊苣高效再生體系建立和遺傳轉(zhuǎn)化研究. 分子植物育種, 2006, 4(4): 565-570.

An effective transformation method mediated by Agrobacterium in chicory (Cichorium intybus)

LI Xiao-Dong, CAI Lu, LI Shi-Ge, MO Ben-Tian, HAN Yong-Fen, WANG Xiao-Li*

Guizhou Institute of Prataculturae, Guiyang 550006, China

Transgenic technology plays an important role in gene function analysis and crop germplasm innovation. However, transgenic studies are relatively recent in chicory. In this study we sought to improve tissue culture and genetic transformation methodology in chicory. Cotyledons grown in the dark were collected as explants. After transformation mediated by Agrobacteria, these explants were grown under illuminated conditions. The cotyledon cells divided rapidly when they were transferred from dark to light. The emergence rate of regenerated seedlings was greater than 90%, similar to that of previous studies however, the germination rate could be improved by 80%-90% if the explants were not pre-cultured. Our results were time, money and labor-saving. We also found that during callus induction, plant differentiation and root growth, decreased intensity and concentration of cytokinin significantly reduced the vitrification of callus and regenerated plantlets. Compared with continuously applied cytokinin our method decreased vitrification of callus and regenerated plantlets by about 9% and 16% respectively.

chicory; tissue culture; transgenic; vitrification; cotyledon

10.11686/cyxb2016097

2016-03-09；改回日期：2016-04-19

貴州省聯(lián)合基金“利用AtmiR156培育高產(chǎn)耐刈菊苣種子新材料”(黔科合J LKN[2013]04),貴州省農(nóng)科院博士啟動基金“四倍體菊苣種質(zhì)創(chuàng)新應用研究”(黔農(nóng)科院人才啟動項目[2013]01)和農(nóng)科院自主創(chuàng)新科研專項“貴州主要優(yōu)良牧草種質(zhì)資源發(fā)掘與創(chuàng)新利用研究”(黔農(nóng)科院自主創(chuàng)新科研專項字[2014]010號)資助。

李小冬(1984-)，男，湖南邵陽人，副研究員，博士。 E-mail: lixiaodongzl@163.com

Corresponding author. E-mail: wangxiaolizhenyuan@126.com

http://cyxb.lzu.edu.cn

李小冬，蔡璐，李世歌，莫本田，韓永芬，王小利. 免預培養(yǎng)高效菊苣遺傳轉(zhuǎn)化方法. 草業(yè)學報, 2016, 25(10): 124-131.

LI Xiao-Dong, CAI Lu, LI Shi-Ge, MO Ben-Tian, HAN Yong-Fen, WANG Xiao-Li. An effective transformation method mediated by Agrobacterium in chicory (Cichoriumintybus). Acta Prataculturae Sinica, 2016, 25(10): 124-131.