宋慧芳，李應(yīng)龍，馬恩波，張建珍

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飛蝗--乙酰氨基葡萄糖苷酶基因的表達(dá)及酶學(xué)特性分析

宋慧芳1,2,3，李應(yīng)龍1,2,3，馬恩波1,3，張建珍1,3

（1山西大學(xué)應(yīng)用生物學(xué)研究所，太原 030006；2山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，太原 030006；3農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，太原 030006）

【目的】-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（--acetylglucosaminidase，NAG）是昆蟲幾丁質(zhì)降解過程中的重要酶類。研究旨在利用Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)獲得高純度LmNAG1蛋白并對(duì)其酶學(xué)特性進(jìn)行分析，探究該酶在飛蝗（）生長(zhǎng)發(fā)育過程中的生物學(xué)功能，為飛蝗綠色防控分子靶標(biāo)研發(fā)提供理論與實(shí)踐依據(jù)?！痉椒ā扛鶕?jù)的cDNA全長(zhǎng)序列（GenBank: JX888720.1）設(shè)計(jì)包含酶切位點(diǎn)HI、dIII和6×His標(biāo)簽的引物。采用PCR技術(shù)擴(kuò)增包含開放閱讀框的目標(biāo)片段，雙酶切后連接至pFastBacTM-Dual載體上。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞中，通過Tn7轉(zhuǎn)座子把目的基因轉(zhuǎn)座到桿狀病毒基因組上，用藍(lán)白斑結(jié)合抗生素篩選。挑取白斑用pUC/M13引物來擴(kuò)增目的條帶，挑選帶目的基因全長(zhǎng)的重組桿狀病毒質(zhì)粒（baculovirus plasmid，Bacmid）。用轉(zhuǎn)染試劑將重組Bacmid轉(zhuǎn)染至草地貪夜蛾（）卵巢細(xì)胞系Sf9中，72 h內(nèi)連續(xù)觀察細(xì)胞形態(tài)，當(dāng)出現(xiàn)感染跡象后收集細(xì)胞，離心，取上清得到P1代重組病毒粒子。用P1代病毒粒子去感染Sf9細(xì)胞，裂解并提取蛋白，western blot檢測(cè)目的蛋白是否成功表達(dá)。之后大量感染Sf9細(xì)胞，提取蛋白，利用Ni-NTA瓊脂糖親和層析柱和陰離子交換柱Q對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化，取最純的餾分用Bradford法測(cè)定蛋白濃度。采用4MU-GlcNAc為底物對(duì)重組目的蛋白LmNAG1的動(dòng)力學(xué)參數(shù)、最適溫度和最適pH進(jìn)行測(cè)定?！窘Y(jié)果】克隆得到包含1 845 bp全長(zhǎng)的pFastBac-重組質(zhì)粒，酶切驗(yàn)證與目標(biāo)條帶一致。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞中，PCR擴(kuò)增挑選出純白斑，成功將全長(zhǎng)序列構(gòu)建到桿狀病毒基因組上。將重組Bacmid轉(zhuǎn)染至Sf9細(xì)胞，72 h后在顯微鏡下觀察可見細(xì)胞膨大，邊緣不規(guī)則等感染跡象。離心收集重組病毒粒子感染新的Sf9細(xì)胞，72 h后收集細(xì)胞，western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在67 kD附近有明顯條帶，與LmNAG1的理論分子量一致，獲得帶6×His標(biāo)簽的融合蛋白。大量感染收集細(xì)胞提取蛋白，經(jīng)Ni-NTA瓊脂糖層析純化，進(jìn)一步透析除鹽后用陰離子交換柱Q二次純化，得到了高純度的目的蛋白。用Bradford法測(cè)定最純的E3組分的蛋白濃度為0.057 μg·μL-1。體外活性測(cè)定結(jié)果表明LmNAG1的最適pH為8.0，且在pH 6.0—8.0范圍內(nèi)具有較高的穩(wěn)定性；LmNAG1的最適溫度為40℃，在40℃以下具有很高的穩(wěn)定性，當(dāng)溫度高于45℃時(shí)熱穩(wěn)定性迅速下降；采用4MU-GlcNAc為底物測(cè)得LmNAG1具有水解-1,4糖苷鍵的活性，可以釋放出4MU，它的動(dòng)力學(xué)參數(shù)m值為（0.28±0.02）mmol·L-1，cat值為(902.88±38.15)s-1。【結(jié)論】成功獲得高純度且具活性的LmNAG1蛋白，其可水解-1,4糖苷鍵連接的幾丁質(zhì)寡糖，與已知昆蟲NAG1具有相似的生物學(xué)功能，即參與幾丁質(zhì)的降解。

飛蝗；-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（NAG）；幾丁質(zhì)降解；蛋白表達(dá)；酶學(xué)特性

0 引言

【研究意義】飛蝗（）是中國(guó)歷史上重要的農(nóng)業(yè)害蟲[1]，研發(fā)飛蝗綠色防控新技術(shù)是農(nóng)業(yè)植保領(lǐng)域的重要課題。如多種昆蟲一樣，飛蝗在生長(zhǎng)發(fā)育過程中也有周期性蛻皮的現(xiàn)象，而表皮的主要成分為幾丁質(zhì)。因此，在研發(fā)飛蝗等害蟲的綠色防控新技術(shù)領(lǐng)域——幾丁質(zhì)代謝途徑中，關(guān)鍵的功能基因如--乙酰氨基葡萄糖苷酶（-- acetylglucosaminidases，NAGs，EC 3.2.1.52）等可作為重要的分子靶標(biāo)[2-3]。而探索LmNAG1的生物學(xué)功能和酶學(xué)特性就具有重要的科學(xué)意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】幾丁質(zhì)是由-1,4糖苷鍵連接的-乙酰氨基葡萄糖線性多聚物[4]，在昆蟲表皮中主要以-型存在[5]。幾丁質(zhì)酶（chitinases，CHTs，EC 3.2.1.14）和NAGs參與昆蟲幾丁質(zhì)的降解[3,6]。NAGs為幾丁質(zhì)外水解酶，屬于糖基水解酶20家族，可水解位于非還原端的以糖苷鍵連接的-乙酰氨基葡萄糖，催化生成乙酰氨基葡萄糖單體（-acetylglucosamine，GlcNAc）。--乙酰氨基葡萄糖苷酶在昆蟲體內(nèi)由多個(gè)基因編碼，有研究者在褐飛虱（）中找到11個(gè)NAG基因，并進(jìn)行了進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)昆蟲NAGs可分為O-GlcNAcase、FDL（fused lobe gene）、NAG1、NAG2、Hex（Hexosaminidases）以及HexD-like 共6個(gè)亞家族[7]。NAG1最初發(fā)現(xiàn)于煙草天蛾（）的蛻皮液中，其能夠與CHTs發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)高效水解幾丁質(zhì)[8]，推斷其具有專一性地水解以-1,4糖苷鍵連接的幾丁質(zhì)寡糖的活性。利用RNAi技術(shù)對(duì)其功能進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)沉默了NAG1基因后昆蟲出現(xiàn)發(fā)育受阻，蛻皮困難死亡等現(xiàn)象，表明該基因在昆蟲的蛻皮過程中起至關(guān)重要的作用[9]。NAG2與NAG1不同，具有廣泛的底物譜，可水解不同類型的糖復(fù)合物[10]。NAG3可能參與精卵識(shí)別過程[11]。FDLs可能參與糖基化修飾[12-13]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】近年來，筆者課題組致力于研發(fā)飛蝗綠色防控新技術(shù)，不斷探索飛蝗幾丁質(zhì)代謝通路中的關(guān)鍵功能基因，開展了一系列的研究工作。例如，RONG等[14]克隆獲得全長(zhǎng)序列，利用RNA干擾（RNA interference，RNAi）技術(shù)沉默后發(fā)現(xiàn)若蟲發(fā)育受阻，出現(xiàn)蛻皮時(shí)間延遲、新舊表皮無法完全分離而死亡的表型。由此可見，可以作為飛蝗新型綠色防控的重要靶標(biāo)，但其酶學(xué)特性還未進(jìn)行深入研究。【擬解決的關(guān)鍵問題】利用Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)異源表達(dá)LmNAG1，進(jìn)一步分離純化得到高純度的重組蛋白，體外檢測(cè)該酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)、最適pH、最適溫度、以及pH和熱穩(wěn)定性等特性，為飛蝗綠色防控分子靶標(biāo)研發(fā)提供理論與實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2014—2015年在山西大學(xué)應(yīng)用生物學(xué)研究所完成。

1.1 主要試劑

Taq酶、T4連接酶、DNA Marker均購(gòu)于TaKaRa公司；限制性內(nèi)切酶HI和dIII購(gòu)于美國(guó)New England Biolabs公司；膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)于美國(guó)OMEGA公司；SFX-INSECT培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Hyclone公司；Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Invitrogen公司；標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；His單克隆抗體購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司；羊抗鼠免疫球蛋白G購(gòu)于北京中杉金橋公司；BCIP/NBT-AP顯色試劑盒購(gòu)于碧云天生物公司；4MU-GlcNAc購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；Ni-NTA瓊脂糖柱購(gòu)于德國(guó)QIAGEN公司；引物合成和測(cè)序由生工生物工程（上海）有限公司完成。

1.2 構(gòu)建重組載體及轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞

的編碼區(qū)已經(jīng)在飛蝗中成功擴(kuò)增并保存為Blunt-菌株，保存于山西大學(xué)應(yīng)用生物學(xué)研究所。引物中設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)拿盖形稽c(diǎn)HI和dIII（下劃線表示），將的編碼區(qū)克隆到pFastBacTM-Dual載體上。在下游引物中引入6×His標(biāo)簽，引物序列見表1。在37℃條件下，對(duì)編碼區(qū)PCR擴(kuò)增片段和pFastBacTM-Dual載體同時(shí)雙酶切2 h后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并回收純化。用T4 DNA連接酶對(duì)回收產(chǎn)物進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化至Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞中，挑單克隆測(cè)序驗(yàn)證，獲得重組的pFastBac-質(zhì)粒。

DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞中包含有一個(gè)具有mini- attTn7靶位點(diǎn)和輔助質(zhì)粒的桿粒，將重組的pFastBac-質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，重組質(zhì)粒可以重組到桿狀病毒穿梭載體桿粒中，用pUC/M13引物PCR擴(kuò)增挑選陽性克隆，獲得重組Bacmid。將重組Bacmid轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，獲得重組桿狀病毒。

表1 PCR引物序列

帶下劃線的為限制性酶切位點(diǎn)，粗體表示轉(zhuǎn)錄起始和終止密碼子，斜體表示6×His標(biāo)簽

Restriction enzyme sites were underlined. Translation start and termination codons were in bold. 6×His tag was in italic

Sf9細(xì)胞的培養(yǎng)條件為27℃，使用含有2%—5%胎牛血清的SFX-INSECT培養(yǎng)基。被重組Bacmid轉(zhuǎn)染的Sf9細(xì)胞培養(yǎng)72 h后到達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期，細(xì)胞密度為1.5×106—2.5×106cells/mL，500 ×離心5 min，在上清液中收集到第1代病毒（P1 virus）。P1代病毒感染Sf9細(xì)胞后，重組目的蛋白大量表達(dá)。收集細(xì)胞之前用無血清的培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞進(jìn)行清洗。

1.3 western blot分析

目的蛋白經(jīng)12%的SDS-PAGE電泳，然后轉(zhuǎn)膜到硝酸纖維素膜上（100 V，100 min）。用含5% w/v牛血清白蛋白（BSA）的TBST緩沖液（20 mmol·L-1pH 7.4的Tris-HCl，150 mmol·L-1NaCl，0.05% Tween-20）在室溫下封閉2 h，然后與His單克隆抗體4℃孵化過夜。TBST洗膜3次，每次10 min，將膜與堿性磷酸酶共價(jià)結(jié)合的羊抗鼠免疫球蛋白G孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min。使用BCIP/NBT-AP顯色試劑盒進(jìn)行顯色。

1.4 純化由Sf9細(xì)胞表達(dá)的重組蛋白

重組目的蛋白LmNAG1的C-端含有6×His標(biāo)簽，用Ni-NTA瓊脂糖層析進(jìn)行純化。通過500 ×離心6 min收集被病毒感染的密度約為2×106cells/mL的100 mL Sf9細(xì)胞，加入10 mL Sf9細(xì)胞裂解緩沖液（20 mmol·L-1pH 8.0的磷酸鈉緩沖液， 1 mmol·L-1EDTA，1 mmol·L-1MgCl2，10% Glycerin，200 mmol·L-1NaCl，0.5% NP-40）和100 μL 1 mmol·L-1的蛋白酶抑制劑（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）進(jìn)行超聲破碎。裂解產(chǎn)物置于冰上30 min，4℃條件下14 000 ×離心90 min。10 mL裂解產(chǎn)物加1 mL Ni-NTA瓊脂糖柱和19 mL His-bind緩沖液（20 mmol·L-1pH 8.0的磷酸鈉緩沖液，500 mmol·L-1NaCl，20 mmol·L-1咪唑，10%甘油和1% pH 8.0的TritonX-100）。將過柱前混合物（Bc）與Ni柱在室溫下孵育2 h后過柱，4℃ 1 503 ×離心8 min收集流出組分（Ft），20 mL His-wash緩沖液（His-bind緩沖液）清洗Ni-NTA柱。結(jié)合在Ni-NTA柱上的目的蛋白用20 mL His-elution緩沖液（20 mmol·L-1pH 8.0的磷酸鈉緩沖液，500 mmol·L-1NaCl，20—500 mmol·L-1咪唑，10%甘油和1% pH 8.0的TritonX-100）進(jìn)行洗脫，收集洗脫液共20管（E1—E20），每管1 mL。洗脫組分通過12%的SDS-PAGE后用考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)。

將含目的蛋白的一些餾分合并，放入透析袋中，置于500 mL透析緩沖液（20 mmol·L-1pH 8.0的磷酸鈉緩沖液，10%甘油）中4 h。透析后的目的蛋白樣品用不含NaCl的透析-A緩沖液到含1 mol·L-1NaCl的透析-B緩沖液梯度洗脫（各10 mL），收集洗脫液共20管（E1—E20），每管1 mL。洗脫組分通過12%的SDS-PAGE后用考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)。

使用Bradford法[15]測(cè)定蛋白濃度。

1.5 酶活測(cè)定

最適pH的測(cè)定：100 μL反應(yīng)體系包括0.1 μg的LmNAG1、16 μL 0.1 mmol·L-1的4MU-GlcNAc底物以及適當(dāng)體積不同pH（pH 3—11）的BR緩沖液[16]。37℃條件下，避光反應(yīng)10 min，加100 μL 0.5 mmol·L-1pH 10.3的Glycine-NaOH終止反應(yīng)。在酶標(biāo)儀（Bio Tek，Synergy Mx，Winooski，VT，USA）中測(cè)定A365/460熒光值。產(chǎn)物的生成量通過4MU標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行測(cè)定。以熒光值最大的為100%，相對(duì)活性為縱坐標(biāo)，不同pH為橫坐標(biāo)繪制曲線。pH穩(wěn)定性的測(cè)定和最適pH測(cè)定的體系相同，酶與底物反應(yīng)之前先將酶加到不同pH的BR buffer中，37℃孵育2 h，之后加入底物反應(yīng)同上。

最適溫度的測(cè)定：100 μL反應(yīng)體系包括0.1 μg的LmNAG1、16 μL 0.1 mmol·L-1的4MU-GlcNAc底物以及適當(dāng)體積最適pH的BR buffer。在不同溫度梯度（30、35、40、45、50、55、60℃）條件下，避光反應(yīng)10 min，加100 μL 0.5 mmol·L-1pH 10.3的Glycine-NaOH終止反應(yīng)。在酶標(biāo)儀中測(cè)定A365/460熒光值。以熒光值最大的為100%，相對(duì)活性為縱坐標(biāo)，不同溫度為橫坐標(biāo)繪制曲線。熱穩(wěn)定性的測(cè)定和最適溫度測(cè)定的體系相同，酶與底物反應(yīng)之前先將酶加到不同溫度梯度（30、35、40、45、50、55、60℃）的最適pH的BR buffer中，孵育2 h，之后加入底物反應(yīng)同上。

在最適溫度和最適pH條件下，利用4MU-GlcNAc底物對(duì)LmNAG1的動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行測(cè)定。100 μL反應(yīng)體系包括0.1 μg LmNAG1酶、不同體積（0、1、2、4、8、16 μL）0.1 mmol·L-1的4MU-(GlcNAc)3寡聚底物以及適當(dāng)體積最適pH的BR buffer。在37℃條件下，避光反應(yīng)10 min，加100 μL 0.5 mmol·L-1pH 10.3的Glycine-NaOH終止反應(yīng)。根據(jù)Lineweaver-Burk plots雙倒數(shù)作圖法[17]測(cè)定m和cat值，重復(fù)3次，數(shù)據(jù)表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤。

2 結(jié)果

2.1 重組桿狀病毒表達(dá)載體的構(gòu)建

用實(shí)驗(yàn)室保存的Blunt-菌株做模板，用表1中的LmNAG1-F/R引物，PCR擴(kuò)增得到的目的條帶大約1 863 bp，的開放可讀框?yàn)? 845 bp，加上18 bp的His標(biāo)簽等，與序列（GenBank： JX888720.1）長(zhǎng)度一致。將目的片段雙酶切連接至pFastBacTM-Dual質(zhì)粒上，得到重組pFastBac-質(zhì)粒（圖1-A）。重組pFastBac-質(zhì)粒經(jīng)HI和dIII雙酶切后鑒定結(jié)果如圖1-B所示，pFastBacTM-Dual質(zhì)粒全長(zhǎng)為5 238 bp，與圖中相應(yīng)條帶位置一致，測(cè)序結(jié)果也顯示重組質(zhì)粒pFastBac-構(gòu)建成功。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞中后，利用藍(lán)白斑和抗生素篩選重組的Bacmid，挑選白斑進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，PCR產(chǎn)物大小約為4 423 bp，包括1 863 bp的目的片段以及2 560 bp的載體序列。如圖1-C所示，7號(hào)克隆為藍(lán)斑做對(duì)照，只擴(kuò)增出來pUC/M13上下游引物中間約300 bp的片段。1、5、6號(hào)克隆沒有目標(biāo)條帶，3、4號(hào)克隆雖然有目標(biāo)條帶，但在300 bp左右的位置有條帶，說明這個(gè)克隆不是純白斑。2號(hào)克隆既有目標(biāo)條帶，且在300 bp沒有條帶，視為純白斑，提取Bacmid轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

A：重組桿狀病毒表達(dá)載體的構(gòu)建示意圖 Map of the recombinant Bacmid；B：重組pFastBac-LmNAG1質(zhì)粒雙酶切鑒定 Recombinant pFastBac-LmNAG1 digested with BamH I and Hind III。M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物DNA standard size markers；1：pFastBacTM-Dual質(zhì)粒雙酶切Empty vector pFastBacTM-Dual digested with BamH I and Hind III；2：重組質(zhì)粒雙酶切pFastBac-LmNAG1 digested with BamH I and Hind III；C：重組Bacmid的PCR驗(yàn)證 Verification of recombinant Bacmid by the bacteria liquid PCR。1—6：白斑 White clones；7：藍(lán)斑 Blue clones。箭頭指示為目的條帶 The arrow pointed to the target band

2.2 目的蛋白LmNAG1的異源表達(dá)及純化

目的蛋白LmNAG1通過Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)，并通過western blot進(jìn)行鑒定（圖2），結(jié)果顯示在67 kD附近有明顯的單一條帶出現(xiàn)，表明目的蛋白LmNAG1表達(dá)成功。經(jīng)Ni-NTA瓊脂糖層析純化后的LmNAG1通過12% SDS-PAGE進(jìn)行分析（圖3-A），結(jié)果顯示在67 kD附近有明顯的目的條帶出現(xiàn)，但還有其他雜帶。透析后采用陰離子交換柱Q純化，檢測(cè)結(jié)果如圖3-B所示，雜蛋白較少，顯示純化成功。選取純度最高的E3組分進(jìn)行酶活性測(cè)定，Bradford法測(cè)定該組分的蛋白濃度為0.057 μg·μL-1。

2.3 pH和溫度對(duì)LmNAG1催化活性的影響

以4MU-GlcNAc作為底物，LmNAG1在pH 8.0條件下具有最高的水解活性（圖4-A），在pH 6.0—8.0范圍內(nèi)具有較高的穩(wěn)定性（圖4-B）。LmNAG1在40℃時(shí)具有最高的水解活性（圖5-A），在40℃以下具有高穩(wěn)定性，當(dāng)溫度高于45℃時(shí)熱穩(wěn)定性迅速下降（圖5-B）。

M：標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker standard size protein markers；1：Sf9細(xì)胞裂解上清 Sf9 cells lysate；2：感染空Bacmid的Sf9細(xì)胞裂解上清 Sf9 cells lysate transfected by Bacmid；3：感染重組Bacmid的Sf9細(xì)胞裂解上清Sf9 cells lysate transfected by recombinant Bacmid。箭頭指示為目的蛋白 The arrow pointed to the target protein

2.4 LmNAG1蛋白的動(dòng)力學(xué)參數(shù)

以4MU-GlcNAc為底物，采用Lineweaver-Burk plots雙倒數(shù)作圖法測(cè)得LmNAG1的動(dòng)力學(xué)參數(shù)m和cat，其中m值為（0.28±0.02）mmol·L-1，cat值為（902.88±38.15）s-1，cat/m值為（3 215.12± 61.98）mmol·L-1·s-1。

A：經(jīng)鎳柱純化的LmNAG1 SDS-PAGE電泳檢測(cè)SDS-PAGE analysis of LmNAG1 purified by Ni-NTA；B：經(jīng)陰離子交換柱Q純化的LmNAG1 SDS-PAGE電泳檢測(cè)SDS-PAGE analysis of LmNAG1 purified by Q。M：標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker standard size protein markers；Bc：Ni-NTA柱或Q柱純化前的粗蛋白組分 Before column fraction；Ft：未與柱結(jié)合的組分 Flow through column fraction；W：洗脫液洗脫雜蛋白的組分 Wash fraction；E1—E19：含不同濃度咪唑或NaCl的洗脫液對(duì)結(jié)合有目的蛋白LmNAG1進(jìn)行洗脫的組分 Eluted fractions washed by different concentrations of imidazole/NaCl。箭頭指示為目的蛋白 The arrow pointed to the target protein

3 討論

飛蝗是重要的農(nóng)業(yè)害蟲，筆者課題組一直致力于探索飛蝗綠色防控的分子靶標(biāo)。昆蟲表皮的主要成分為幾丁質(zhì)，且高等動(dòng)物不具幾丁質(zhì)，這意味著在幾丁質(zhì)代謝過程中涉及的關(guān)鍵基因可以作為重要的分子靶標(biāo)。--乙酰氨基葡萄糖苷酶是昆蟲幾丁質(zhì)降解過程中的重要酶類，在不同的昆蟲中都由多個(gè)基因編碼。最新的研究發(fā)現(xiàn)該基因家族在褐飛虱中多達(dá)11個(gè)，可分為6個(gè)亞家族[7]。因此，研究不同亞家族的NAGs在生物學(xué)功能上的分化具有重要的科學(xué)意義。編碼NAG的基因首次在煙草天蛾中報(bào)道[8]，發(fā)現(xiàn)該基因主要在表皮和中腸組織高表達(dá)，且在蛻皮前的1—2 d表達(dá)量最高，推測(cè)可能參與幾丁質(zhì)降解過程且受蛻皮激素（20-hydroxyecdysone，20E）的誘導(dǎo)。之后在埃及伊蚊（）中也發(fā)現(xiàn)了NAGs的存在[18]，主要存在于圍食膜中，其活性會(huì)隨著喂食人工合成的無蛋白質(zhì)食物或血液而迅速增加。Hogenkamp等[19]對(duì)赤擬谷盜（）NAGs進(jìn)行了研究，克隆了4條NAG序列，發(fā)現(xiàn)與以及相比，的mRNA水平表達(dá)量最高，在中腸和表皮組織均有分布。利用RNAi技術(shù)沉默后，赤擬谷盜的幼蟲-幼蟲、幼蟲-蛹、蛹-成蟲3個(gè)階段蛻皮時(shí)都會(huì)出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，表明該基因在昆蟲蛻皮過程中起著關(guān)鍵作用。Kokuho等[20]在家蠶（）中發(fā)現(xiàn)兩個(gè)NAGs基因，在蛹期高表達(dá)而在蛹期無可檢測(cè)的表達(dá)，暗示NAG1和NAG2可能在不同時(shí)期發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能；Liu等[9]利用RNAi技術(shù)沉默了亞洲玉米螟（）的NAG1后也發(fā)現(xiàn)幼蟲不能成功蛻至蛹期；Xi等[7]利用RNAi技術(shù)對(duì)褐飛虱中11個(gè)Hexs的功能進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)只有屬于NAG1亞家族的會(huì)影響昆蟲的蛻皮；rong等[14]對(duì)NAGs進(jìn)行的聚類分析結(jié)果表明，與其他昆蟲的NAG1歸為一個(gè)亞家族，利用RNAi技術(shù)沉默了該基因后飛蝗的發(fā)育受阻，不能順利地蛻至下一齡期，表明該基因在飛蝗蛻皮發(fā)育過程中的重要性，推測(cè)LmNAG1蛋白可能具有水解以-1,4糖苷鍵連接的幾丁質(zhì)寡糖的活性，為進(jìn)一步闡明該蛋白的酶學(xué)特性，有必要對(duì)LmNAG1進(jìn)行異質(zhì)性表達(dá)和酶學(xué)特性展開深入的研究。

A：最適溫度 Optimum temperature；B：熱穩(wěn)定性Thermal stability。用4MU-GlcNAc作為酶活力測(cè)定的底物，在A365/460處讀取4MU的熒光值，在pH 8.0條件下反應(yīng) The enzyme activity was determined by using the substrate, 4MU-GlcNAc, the liberation of 4MU was measured at the excitation wavelength of 365 nm and the emission wavelength of 460 nm. The reactions were performed at pH 8.0

目前，將NAG1進(jìn)行異源表達(dá)、純化以及酶學(xué)特性分析的工作開展較少。已有報(bào)道用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)獲得了云杉卷葉蛾（）的NAG1，酶學(xué)分析發(fā)現(xiàn)該蛋白可作用于p-nitrophenyl--D-GlcNAc[21]，但同時(shí)用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)出來的蛋白不具活性。Liu等[22]采用酵母真核表達(dá)系統(tǒng)異源表達(dá)了亞洲玉米螟的NAG1融合蛋白，并對(duì)其酶學(xué)特性進(jìn)行了研究，包括最適pH和最適溫度等，發(fā)現(xiàn)該酶可以作用于4MU--GlcNAc和(GlcNAc)2等以-1,4糖苷鍵連接的幾丁質(zhì)寡糖。

Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)可以高效快速表達(dá)具活性的蛋白，被廣泛應(yīng)用于外源基因的過表達(dá)。本研究利用Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，成功將LmNAG1進(jìn)行了異源表達(dá)，在細(xì)胞裂解液上清中得到大量的重組蛋白，經(jīng)western blot檢測(cè)，結(jié)果顯示在67 kD處有一條清晰的特異性條帶。利用在線ProtParam工具（http://web.expasy.org/protparam/）分析，該蛋白的理論分子量應(yīng)該為70 kD左右，但由于該蛋白在翻譯后可能存在有一些修飾等原因?qū)е聦?shí)際分子量比理論分子量小3 kD左右。Yang等[23]在亞洲玉米螟蛻皮液中分離純化到OfNAG1的分子量為67 kD，并經(jīng)分子篩處理，結(jié)果顯示該蛋白在昆蟲體內(nèi)可形成二聚體形式。本文異源表達(dá)飛蝗LmNAG1蛋白，其是否在飛蝗內(nèi)也形成二聚體形式尚有待深入研究。

為了得到高純度的LmNAG1目的蛋白，首先利用Ni-NTA瓊脂糖層析柱進(jìn)行親和層析（圖3-A），結(jié)果顯示，隨著咪唑濃度的升高，大量目的蛋白被洗脫下來，在E9餾分中達(dá)到最高濃度，但從圖中可見E9餾分的目的蛋白下方有一條雜蛋白未能成功去除。利用在線ProtParam工具預(yù)測(cè)的目的蛋白等電點(diǎn)為5.6左右，為得到純度更高的目的蛋白，進(jìn)一步利用陰離子交換柱Q對(duì)E9餾分進(jìn)行了二次純化，得到了較高純度的E3餾分（圖3-B），為進(jìn)一步酶學(xué)特性的分析奠定基礎(chǔ)。

本研究發(fā)現(xiàn)LmNAG1可作用于4MU-GlcNAc，且在pH 8.0，40℃時(shí)酶活性最高。在pH 6.0—8.0范圍內(nèi)以及40℃以下具有較高的穩(wěn)定性。飛蝗體液的pH為7.0左右，表明LmNAG1在飛蝗體內(nèi)擁有合適的pH環(huán)境。此外，飛蝗的最適生長(zhǎng)溫度為28—30℃，表明在飛蝗正常的生長(zhǎng)條件下，可為L(zhǎng)mNAG1提供良好的溫度環(huán)境，合適的pH和溫度條件滿足了飛蝗生長(zhǎng)發(fā)育中LmNAG1的需求。在亞洲玉米螟中的研究中發(fā)現(xiàn)OfNAG1的最適pH為7.0，最適溫度為30℃[22]；埃及伊蚊AgNAG1最適pH為7.0—8.0[18]；家蠶BmNAG1最適pH為5.5[21]。由此可見，不同種昆蟲的NAG1酶學(xué)特性不盡相同，可能是由于昆蟲體液環(huán)境不同導(dǎo)致的結(jié)果。在LI等[24]的研究中指出飛蝗幾丁質(zhì)酶5（Chtinase，LmCHT5）主要作用于4MU-(GlcNAc)3等多聚形式的幾丁質(zhì)，而本研究中的LmNAG1作用于4MU-GlcNAc低聚形式的糖類，推測(cè)兩者在飛蝗幾丁質(zhì)降解的過程中可發(fā)揮協(xié)同作用。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)亞洲玉米螟OfCht5﹕OfNAG1在摩爾濃度比為9﹕1—15﹕1范圍內(nèi)降解膠狀幾丁質(zhì)的效率最高，兩者發(fā)揮協(xié)同作用[25]。Yang等[23]曾采用(GlcNAc)2等低聚物對(duì)亞洲玉米螟OfNAG1進(jìn)行動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定，結(jié)果表明其m值為（0.30±0.04）mmol·L-1，cat值為（934±79）s-1，本研究中得到的飛蝗LmNAG1的動(dòng)力學(xué)參數(shù)與之很接近，表明飛蝗LmNAG1和亞洲玉米螟OfNAG1具有相似的酶學(xué)特性和生物學(xué)功能。

4 結(jié)論

成功構(gòu)建了重組載體pFastBac-，轉(zhuǎn)染至Sf9細(xì)胞得到重組病毒，大量感染Sf9細(xì)胞，提取蛋白并純化，獲得高純度且具活性的LmNAG1蛋白。對(duì)其酶學(xué)特性進(jìn)行分析表明，LmNAG1蛋白的最適pH為8.0，最適溫度為40℃，可水解-1,4糖苷鍵連接的幾丁質(zhì)寡糖，屬幾丁質(zhì)外水解酶，與其他昆蟲的NAG1具相似的生物學(xué)功能。

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（責(zé)任編輯 岳梅）

The Heterogenous Expression and Enzymatic Characteristics of--acetylglucosaminidase from

SONG Hui-fang1,2,3, LI Ying-long1,2,3, MA En-bo1,3, ZHANG Jian-zhen1,3

(1Institute of Applied Biology, Shanxi University, Taiyuan 030006;2College of Life Science, Shanxi University, Taiyuan 030006;3Shanxi Key Laboratory of Integrated Pest Management in Agriculture, Taiyuan 030006)

【Objective】--acetylglucosaminidase (NAG) is a key enzyme involved in degradation of chitin. The objective of this study is to obtain the high purified enzyme, and to analyze the enzymatic characteristics. It will be helpful for the biological function study of LmNAG1 during locust development, and will provide a theoretical and practical basis for developing molecular target of pest control. 【Method】The primers withHI,dIII restriction sites and 6×His tags were designed according to the complete cDNA sequence deposited in GenBank (No. JX888720.1). The target sequence consisting of ORF was amplified by PCR, and then ligated to pFastBacTM-Dual vector after double enzyme digestion. The recombinant plasmid was transformed intoDH10Bac competent cells, and the target gene was transposed to baculovirus genome through Tn7 transposon. The white clone was selected by blue-white selection combined with antibiotics screening and then the recombinant baculovirus plasmid (Bacmid) was verified by bacteria liquid PCR with the pUC/M13 primers. The recombinant Bacmid was transfected intoovary cell line Sf9 using transfection reagent. The morphology of cell was observed within 72 h continuously. Once the infected phenomenon occurred, the P1generation recombinant virions were obtained from the supernatant after cell collection and centrifugation, and then used to infect Sf9 cells again. The proteins obtained after lysing were performed western blot to examine whether the target protein was expressed or not. After that, large amounts of Sf9 cells were infected to extract proteins. The recombinant proteins were purified using Ni-NTA agarose beads and Q ion-exchange chromatography, and the protein concentration was determined according to the method of Bradford. The kinetic parameters of purified enzyme, the optimal pH and temperaturewere determined using the substrate, 4MU-GlcNAc. 【Result】 The recombinant plasmid pFastBac-consisting of a full-length cDNA of(1 845 bp) was verified by double enzyme digestion. Furthermore, it was transformed into DH10Bac competent cells, then combined into the baculovirus genome. The correct recombinant Bacmid selected by PCR was used for Sf9 cell transfection. The signs of transfection including cell enlargement and border irregularity were observed under the microscope after 72 h. The recombinant virions were collected after centrifugation, and used to infect Sf9 cells again. The infected Sf9 cells were collected for protein extraction. From western blot, an obvious band around 67 kD, which was in accordance with the molecular mass of LmNAG1. The fusion protein with 6×His tags was obtained successfully. Large amounts of protein were obtained from the infected cells and purified using Ni-NTA agarose beads followed by Q ion-exchange chromatography after dialysis to collect high purified target proteins. The top protein concentration of E3 fraction was 0.057 μg·μL-1determined using Bradford method. Theactivity detection showed that LmNAG1 exhibited the maximum activity at pH 8.0, and possessed higher stability when pH at 6.0-8.0. The optimum temperature for LmNAG1 was 40℃, the thermostability was high between 30-40℃. However, the enzyme activity was decreased rapidly when the temperature was higher than 45℃. Them=(0.28±0.02) mmol·L-1,cat= (902.88±38.15) s-1, and the results showed that LmNAG1 could efficiently hydrolyze-1,4 linked chitin oligosaccharide.【Conclusion】 The purified LmNAG1 was obtained in this study, and it has been shown that LmNAG1 is able to degrade-1,4 linked chitin oligosaccharide. LmNAG1 is involved in chitin degradation, which exhibited the similar biological functions with NAG1 of other insects.

;--acetylglucosaminidase (NAG); chitin degradation; protein expression; enzymatic characteristics

2016-07-19；接受日期：2016-09-02

國(guó)家自然科學(xué)基金（31272380，31672364）、山西省科技基礎(chǔ)條件平臺(tái)項(xiàng)目（2015091010）

聯(lián)系方式：宋慧芳，E-mail：songhuifang88@126.com。通信作者張建珍，E-mail：zjz@sxu.edu.cn