徐義剛 邱索平 王 昱 高會江 高慎陽

(1.海南出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心，海南 ?？?570311；2. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動醫(yī)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150001；3. 從化出入境檢驗檢疫局，廣東 從化 510900；4. 重慶出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心，重慶 404100；5. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所牛遺傳育種研究室，北京 100193；6. 遼寧醫(yī)學(xué)院畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧 錦州 121001)

?

基于vvhA基因檢測創(chuàng)傷弧菌實時熒光PCR方法的建立

徐義剛2邱索平3王 昱4高會江5高慎陽6

(1.海南出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心，海南 ?？?570311；2. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動醫(yī)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150001；3. 從化出入境檢驗檢疫局，廣東 從化 510900；4. 重慶出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心，重慶 404100；5. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所牛遺傳育種研究室，北京 100193；6. 遼寧醫(yī)學(xué)院畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧 錦州 121001)

為建立創(chuàng)傷弧菌(VV)的快速檢測方法，根據(jù)vvhA基因序列設(shè)計合成引物和探針，建立實時熒光PCR方法。結(jié)果顯示：所建立的方法能特異擴增出VV標(biāo)準(zhǔn)陽性菌株，而對其它14種菌株沒有擴增；該方法的靈敏度為15 CFU/mL；穩(wěn)定性和重復(fù)性試驗結(jié)果表明，同一樣品重復(fù)檢測4次Ct 值(循環(huán)閾值)的變異系數(shù)均小于2%；利用該檢測方法對采集的156份樣品進行檢測，共計檢出2份VV陽性樣品，與行標(biāo)法(SN/T 1870—2007)檢測結(jié)果一致。該檢測方法靈敏度高、特異性強，具有良好的實用性。

創(chuàng)傷弧菌；vvhA基因；實時熒光定量PCR

創(chuàng)傷弧菌(vibrio vulnificus，VV)是一種有莢膜的革蘭氏陰性菌，廣泛分布于蟹、蝦、牡蠣等水生動物中，如果人類食用VV污染的食品會引發(fā)胃腸炎，嚴(yán)重時還會引發(fā)敗血癥[1-2]，病死率高達到50% 以上[3-4]，是對人類身體健康危害很嚴(yán)重的一種食源性致病菌。近幾年來，中國沿海地區(qū)由VV感染引起的人類食物中毒事件頻繁發(fā)生[5-7]。所以，建立一種能夠快速、準(zhǔn)確檢測VV的方法刻不容緩。

實時熒光PCR方法由于靈敏度、特異性和精準(zhǔn)度都比較高，現(xiàn)今已成為病原體檢測的重要方法，并且發(fā)展迅速，在生命科學(xué)研究的各個領(lǐng)域都得到了廣泛應(yīng)用[8]9-11。針對檢測靶基因的選擇，溶細(xì)胞素被認(rèn)為是VV感染的主要致病因子之一[9]，是由結(jié)構(gòu)基因vvhA編碼的一種細(xì)胞外蛋白質(zhì)，vvhA基因具有良好的種特異性和保守性[10-11]，因此本研究選擇vvhA基因作為檢測的靶基因，建立檢測VV的實時熒光PCR檢測方法，并確定反應(yīng)的最佳條件。為了提高VV的檢測效率和檢測的準(zhǔn)確度，本研究根據(jù)VV 的vvhA基因設(shè)計合成探針和引物，建立了檢測VV的實時熒光PCR方法，并對反應(yīng)體系進行優(yōu)化，對方法的特異性、敏感性、穩(wěn)定性以及重復(fù)性進行驗證實驗，最終建立一種行之有效的檢測方法，旨在為快速準(zhǔn)確檢測VV提供有力的技術(shù)支持。與已有的相關(guān)報道對比，本研究有針對性的注重了引物和探針的設(shè)計，使檢測方法的特異性在整體上有所提高。

1 材料與方法

1.1 菌種及臨床樣品

創(chuàng)傷弧菌、霍亂弧菌、溶藻弧菌、空腸彎曲菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌等14種常見的致病菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株：美國典型菌種保藏中心(ATCC)；

沙門氏菌：中國醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心(CMCC)；

156份水產(chǎn)品(包括海魚、鮑魚、泥螺、蝦、蟹、海水、蟶子、蛤蜊等)：來自于水產(chǎn)品養(yǎng)殖場和水產(chǎn)品流通市場。

1.2 試劑和儀器

增菌培養(yǎng)基BPW和細(xì)菌培養(yǎng)基：北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司；

核酸提取試劑盒：北京天根生化科技有限公司；

Taq酶、MgCl2和dNTP：北京合生基因科技有限公司；

實時熒光PCR儀：7500型，美國ABI公司。

1.3 方法

1.3.1 引物和探針設(shè)計 根據(jù)GenBank中已經(jīng)發(fā)表的VVvvhA基因序列(KC821520.1) 進行引物和探針的設(shè)計并且參考吳增輝[8]11-15的研究進行設(shè)計。

引物： F: TGTTTATGGTGAGAACGGTGACA

R: TTCTTTATCTAGGCCCCAAACTTG

探針：Fam- CCGTTAACCGAACCACCCGCAA -TAMRA1.3.2 實時熒光PCR反應(yīng)模板的制備 將15種標(biāo)準(zhǔn)菌株分別接種到5 mL的增菌培養(yǎng)基中進行增菌，在37 ℃下培養(yǎng)12 h，各取1 mL菌液提取細(xì)菌基因組DNA，根據(jù)試劑盒說明書的步驟進行，核酸提取后放入-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。臨床樣品的細(xì)菌核酸的提取采用煮沸法進行。

1.3.3 反應(yīng)體系中基本參數(shù)的優(yōu)化 對rTaq酶、Mg2+、dNTPs、引物、探針濃度進行優(yōu)化。在Mg2+(25 mmol/μL) 用量范圍2～5 μL，以每0.5 μL遞增；在rTaq酶(5 U/μL) 用量范圍0.25～1.00 μL，以每0.25 μL遞增；在dNTP (2.5 mmol /μL )用量范圍1.0～3.0 μL，以每0.50 μL遞增；探針(20 μmol/μL)用量范圍0.1～0.5 μL，以每0.1 μL遞增；引物(10 pmol/μL)用量范圍0.5～1.0 μL，以每0.1 μL遞增；每個參數(shù)的用量重復(fù)3次，最后計算出Ct平均值，確定這5個反應(yīng)參數(shù)的最佳用量。

1.3.4 特異性檢測試驗 采用試劑盒法提取1.1.1節(jié)中菌株的核酸作為模板，進行實時熒光PCR 擴增，評價試驗檢測的特異性。

1.3.5 敏感性檢測試驗 10倍梯度稀釋菌液并且按核酸提取試劑盒要求分別提取每級稀釋度細(xì)菌DNA，各取2.00 μL作為模板按優(yōu)化好的體系條件進行實時熒光PCR檢測。

1.3.6 穩(wěn)定性和重復(fù)性試驗 取3個不同濃度的樣品作為模板進行重復(fù)性試驗，每個濃度做3個平行，重復(fù)4次。收集數(shù)據(jù)，計算組內(nèi)、組間變異系數(shù)，評價試驗的穩(wěn)定性和重復(fù)性。1.3.7 樣品檢測 將采集來的水海產(chǎn)品156份，經(jīng)過勻漿機研磨處理后，用營養(yǎng)肉湯在37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6 h，利用煮沸法提取核酸，然后利用實時熒光PCR方法進行檢測，檢測結(jié)果用行標(biāo)法(SN/T 1870—2007)進行再一次的檢驗，驗證所建立的實時熒光PCR方法檢測的實用性和準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 VV實時熒光PCR檢測方法的建立

rTaq酶、Mg2+、dNTPs、引物、探針濃度直接影響實時熒光PCR反應(yīng)的擴增效果，尤其是Mg2+的濃度是影響Taq酶活性發(fā)揮的主要因素，濃度過高會增加實時熒光PCR反應(yīng)的非特異性擴增，濃度過低會影響Taq酶活性發(fā)揮。所以，PCR反應(yīng)體系中每種物質(zhì)濃度的選擇都是非常重要的。經(jīng)過反應(yīng)體系的優(yōu)化建立如下反應(yīng)體系：rTaq酶(5 U/μL)0.50 μL，Mg2+(25 mmol)2.50 μL，dNTP(2.5 mmol)2.00 μL，探針(20 μmol/μL)0.30 μL，VVF/VVR(10 pmol/μL)1.00 μL，DNA 模板2.00 μL，DEPC水補充至25 μL。具體的反應(yīng)過程：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性3 s，60 ℃退火40 s(此步驟收集熒光信號)，72 ℃延伸30 s，進行40個循環(huán)。

1. VV 2. 陰性對照

Figure 1 Determine the reaction system and the reaction conditions of a dual real-time PCR

2.2 特異性檢測試驗

應(yīng)用建立的實時熒光PCR檢測方法對15株標(biāo)準(zhǔn)菌株進行擴增試驗顯示，只有VV出現(xiàn)了特異性的擴增曲線，其他菌株和空白對照都沒有出現(xiàn)特異性熒光信號。說明本研究所建立的檢測方法具有很好的特異性(見圖2)。

2.3 敏感性檢測試驗

10倍梯度稀釋菌液并且按核酸提取試劑盒要求分別提取每級稀釋度細(xì)菌DNA，各取2.00 μL 作為模板按優(yōu)化好的體系條件進行實時熒光PCR檢測。檢測結(jié)果顯示，菌體濃度在1.50×101CFU/mL時依然可以出現(xiàn)擴增曲線，在其濃度以下都沒有出現(xiàn)特異性熒光信號(圖3)，因此，本研究所建立的檢測方法的靈敏度為15 CFU/mL，表明該方法具有很高的靈敏度；本研究VV檢測的靈敏度與金玉娟等[12]和張晶等[13]建立的實時熒光定量PCR方法檢測的靈敏度進行比較，這3種實時熒光PCR檢測方法的靈敏度相當(dāng)，都具有較高的靈敏度。

圖2 VV實時熒光PCR特異性試驗擴增曲線

Figure 2 Specificity test curve of a dual real-time PCR

1. VV 2～15. 腸侵襲性大腸桿菌、霍亂弧菌、空腸彎曲菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、變形桿菌、阪崎腸桿菌、單增李斯特氏菌、志賀菌、副溶血弧菌、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、腸出血性大腸埃希菌O157:H7、粘質(zhì)沙雷菌1～7. 菌體濃度分別為1.5×106，1.5×105，1.5×104，1.5×103，1.5×102，1.5×101，1.5×100CFU/mL

圖3 VV菌液稀釋法實時熒光PCR靈敏度試驗擴增曲線

Figure 3 Sensitivity test curve of a dual real-time PCR

2.4 穩(wěn)定性和重復(fù)性試驗

選取1.50×107，1.50×105，1.50×103CFU/mL 3個濃度的陽性模板進行組內(nèi)和組間重復(fù)性試驗，計算出組內(nèi)和組間CT 值的變異系數(shù)分別為0.34%～1.05%，0.38%～0.76% (表1)，均小于2%，表明所建立的方法具有比較好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

表1 穩(wěn)定性和重復(fù)性試驗

2.5 臨床樣品的檢測試驗

分別對156份采集來的樣本用本研究建立的實時熒光PCR檢測方法和行標(biāo)法(SN/T 1870—2007)進行檢測，檢出2份陽性樣本，兩種方法所得的檢測結(jié)果的一致(圖4、5)，表明該方法具有很強的應(yīng)用性。

3 結(jié)論

本研究所建立的基于vvhA基因特異性檢測VV實時熒光PCR方法，靈敏度高、特異性強、重復(fù)性好，具有良好的實用性，適合在食品微生物檢測部門推廣應(yīng)用。該方法與普通PCR方法相比，提高了檢測的靈敏度和特異性，并且不需要對PCR擴增產(chǎn)物進行后處理，有效地解決了PCR產(chǎn)物易污染造成的假陽性和不能準(zhǔn)確定量的問題。該方法的建立為VV的快速檢測提供了新的技術(shù)手段。

圖4 VV實時熒光PCR對樣品檢測試驗擴增曲線

圖5 VV行標(biāo)法對樣品檢測試驗擴增曲線

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Establishment of a quantitative real-time PCR for detecting vvhA gene in Vibrio vulnificus

XUYi-gang2QIUSuo-ping3WANGYu4GAOHui-jiang5GAOShen-yang6

(1.AnimalQuarantineLab,Inspection&QuarantineTechnologyCenterofHainanEntry-ExitInspection&QuarantineBureau,Haikou,Hainan570311,China; 2.CollegeofVeterinaryMedicine,NortheastAgriculturalUniversity,Harbin,Heilongjinag150001,China; 3.ConghuaEntry-ExitInspection&QuarantineBureau,Conghua,Guangdong510900,China; 4.AnimalQuarantineLab,Inspection&QuarantineTechnologyCenterofChongqingEntry-ExitInspection&QuarantineBureau,Chongqing404100,China; 5.LaboratoryofBovineGeneticsandBreeding,InstituteofAnimalScience,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100193,China; 6.DepartmentofAnimalHusbandry&VeterinaryMedicine,LiaoningMedicalUniversity,Jinzhou,Liaoning121001,China)

To establish a rapid assay forVibriovulnificus(V.vulnificus) detection, a quantitative real-time PCR (qRT-PCR) method was developed targetingvvhAgene ofV.vulnificus. The results showed that the tests for 15 strains of different bacteria by using this method, only the ones ofV.vulnificuswere positive, indicating high specificity of qRT-PCR. Moreover, the sensitivity of this specific method was 15 CFU/mL. Further stability and reproducibility test results showed that the coefficient of variation of Ct values of four duplicates were less than 2%. In addition, a total 2 positive samples forV.vulnificuswere detected from 156 clinical samples by this method, and the results were in accordance with those by SN/T 1870-2007 standard detections. Therefore, the qRT-PCR method provides a novel rapid and sensitive detection method forV.vulnificusinfection.

vvhAgene; quantitative real-time PCR

海南省社會發(fā)展科技專項(編號：2015SF29)；國家質(zhì)檢總局科技項目(編號：2013IK031，2013IK051，2015IK089)；重慶市科技計劃項目(編號：cstc2014yykfA80017)；海南省應(yīng)用技術(shù)研究與開發(fā)專項項目(編號：ZDXM20130025)；廣東檢驗檢疫局科技計劃項目(編號：2013GDK04，2015GDK53)

李丹丹，女，海南出入境檢驗檢疫局高級獸醫(yī)師，博士。

徐義剛(1978-)，男，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)教授，博士。

E-mail: 108074182@qq.com

2016-01-06