范巖巖，劉倩倩，張廷榮，孫金海

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東 青島 266109）

轉(zhuǎn)pGH IGF-1基因?qū)ωi生長(zhǎng)和繁殖性能的影響

范巖巖，劉倩倩，張廷榮，孫金海

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東 青島 266109）

為了解轉(zhuǎn)雙基因在豬生長(zhǎng)發(fā)育中作用及意義，選取23頭健康仔豬，其中轉(zhuǎn)pGH、IGF-1雙基因豬4頭，轉(zhuǎn)pGH基因豬12頭，非轉(zhuǎn)基因豬7頭，研究pGH、IGF-1基因?qū)ωi生長(zhǎng)和繁殖性能的影響。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)pGH、IGF-1雙基因豬個(gè)體均重比轉(zhuǎn)pGH單基因豬高2.83%，差異顯著（P＜0.05）；轉(zhuǎn)雙基因豬比非轉(zhuǎn)基因豬高7.37%，差異顯著（P＜0.05）。轉(zhuǎn)雙基因豬體重達(dá)100 kg的日齡比轉(zhuǎn)單基因豬少8.93 d，差異顯著（P＜0.05），轉(zhuǎn)雙基因豬比非轉(zhuǎn)基因豬少12.23 d，差異顯著（P＜0.05），轉(zhuǎn)單基因豬比非轉(zhuǎn)基因豬少3.30 d，差異不顯著（P＞0.05）；轉(zhuǎn)雙基因公豬的精液量，分別比轉(zhuǎn)pGH單基因公豬與非轉(zhuǎn)基因公豬提高27.61%、18.31%，差異均顯著（P＜0.05）；精子密度，三者之間差異均不顯著（P＞0.05）；轉(zhuǎn)雙基因公豬與非轉(zhuǎn)基因豬的精子活力之間差異不顯著（P＞0.05）；轉(zhuǎn)單基因公豬畸形率分別比轉(zhuǎn)雙基因公豬、非轉(zhuǎn)基因豬高23%、18%，差異均顯著（P＜0.05）。為進(jìn)一步分析pGH-IGF-1生長(zhǎng)軸對(duì)家豬生產(chǎn)性能的具體影響提供參考依據(jù)，也為轉(zhuǎn)基因技術(shù)的推廣與應(yīng)用提供有力依據(jù)。

豬；生長(zhǎng)激素（GH）；胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGF）；生長(zhǎng)性能；繁殖性能

動(dòng)物生長(zhǎng)通過促生長(zhǎng)激素軸控制，由生長(zhǎng)激素釋放因子（GHRH）、胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGFs）、生長(zhǎng)激素（GH）構(gòu)成，各激素之間發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，共同調(diào)控機(jī)體的整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過程［1］。pGH能夠減少脂肪組織對(duì)葡萄糖的利用，降低Co A羧化酶和脂肪合成酶的活性，抑制脂肪的合成［2］。同時(shí)，pGH還能有效促進(jìn)脂肪組織的分解［3］，從而使豬的背膘厚和胴體脂肪含量下降。IGFs是GH-IGF中的重要調(diào)控因子，是pGH發(fā)揮生物學(xué)作用的主要介導(dǎo)者［4］。Davies等［7］研究發(fā)現(xiàn)，IGF-1無功能變異小鼠因?yàn)槿狈GF-1導(dǎo)致其成年后間質(zhì)細(xì)胞不能成熟，導(dǎo)致類固醇分泌的減少，IGF-1基因控制著睪丸的功能［5］，生長(zhǎng)軸對(duì)動(dòng)物繁殖起著至關(guān)重要的作用。

2013年本實(shí)驗(yàn)室，姚延珠等［6］將雙基因重組真核表達(dá)載體用納米材料包裹后轉(zhuǎn)染長(zhǎng)白豬精子，通過人工授精導(dǎo)入受體母豬。待其產(chǎn)仔后，經(jīng)檢測(cè)其中4頭仔豬為轉(zhuǎn)雙基因豬，轉(zhuǎn)雙基因陽性率為30.76%，成功制備出轉(zhuǎn)（pGH-IGF-1）雙基因豬。本試驗(yàn)從生產(chǎn)數(shù)據(jù)角度進(jìn)一步分析pGHIGF-1生長(zhǎng)軸對(duì)家豬生產(chǎn)性能的具體影響。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物的選擇試驗(yàn)于2013年10月至2014年10月在青島農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)基地種豬場(chǎng)進(jìn)行。選取同品種2頭轉(zhuǎn)雙基因母豬與正常公豬雜交，得到23頭健康仔豬并取耳組織樣，檢測(cè)后代中轉(zhuǎn)雙基因、轉(zhuǎn)單基因的子代個(gè)數(shù)，測(cè)得數(shù)據(jù)。

引物的設(shè)計(jì)與合成：根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中豬pGH基因序列（GenBank=M17704.1）和IGF-1基因序列（GenBank=M31175.1），利用Prime Premier5.0分別設(shè)計(jì)上、下游引物：

pGH F：5′-ATGCCCTTGTCCAGCCTAT R：AGGTATGTCTCAGCCTTGTGC-3′；

IGF-1 F：5′-TGCCCTTGTCCAGCCTATTT R：GCAGGTATGTCTCAGCCTTGTG-3′。

1.2測(cè)定項(xiàng)目

1.2.1測(cè)定體重測(cè)定豬不同日齡試驗(yàn)豬體重和3月齡、5月齡、6月齡體尺及體重100 kg時(shí)等指標(biāo)。對(duì)體重在85～105 kg范圍的試驗(yàn)豬，記錄實(shí)測(cè)日齡和體重，按加拿大校正公式轉(zhuǎn)換成體重達(dá)100 kg的日齡。

校正日齡=測(cè)定日齡-［（實(shí)測(cè)體重-100）/CF］

其中：（公豬）CF=（實(shí)測(cè)體重/測(cè)定日齡）× 1.826；（母豬）CF=（實(shí)測(cè)體重/測(cè)定日齡）×1.715。

前文不避瑣贅，對(duì)清初傳記散文中遺民形象書寫的道德范式做四個(gè)方面的梳理，然尚有一個(gè)重要的問題，亦需做出系統(tǒng)的解釋，即這些傳記散文中遺民道德范式的實(shí)現(xiàn)途徑。茲試作粗略之解如下。

1.2.2射精量測(cè)量精液量主要用電子天平稱量法。按1 g=1 mL計(jì)，精液量（g）=（精子的質(zhì)量+集精杯的質(zhì)量）集精杯子的質(zhì)量。盡量避免用量筒轉(zhuǎn)移精液造成精子的死亡。

1.2.3精子活力檢測(cè)方法：用100 μL移液器準(zhǔn)確吸取50 μL樣品，取0.95 mL的3.0%氯化鈉溶液與精液混合均勻。將備好的血球計(jì)數(shù)板用血蓋片將計(jì)數(shù)室蓋好，用小吸管吸取，滴一滴于血蓋片邊緣，使精液自行流入計(jì)數(shù)室，均勻充滿，避免氣泡和液層過厚，然后用顯微鏡觀察計(jì)數(shù)。計(jì)算方法：3個(gè)視野活力評(píng)價(jià)值的平均數(shù)。如下：式中：M 表示活力；n1表示第一視野活力；n2表示第二視野活力；n3表示第三視野活力。

1.2.4精子密度檢測(cè)正常情況下公豬的精子密度為3～5億/mL，有的可高達(dá)7億/mL。檢測(cè)精子密度的方法主要有估測(cè)法、精子密度儀法、血細(xì)胞計(jì)數(shù)方法等。本試驗(yàn)使用精子密度儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5精子畸形率檢測(cè)制作精子抹片，用姬姆薩染料對(duì)精子進(jìn)行染色，用普通顯微鏡進(jìn)行觀察，計(jì)算畸形百分率。具體方法如下：（1）抹片：在載玻片的一端滴一滴精液，然后取另一載玻片與有樣品的載玻片呈35°夾角，輕輕推動(dòng)載玻片，將精液均勻地涂抹于載玻片上，靜置約10 min風(fēng)干，每組樣品制作兩個(gè)精子抹片；（2）固定：取1.0 mL～2.0 mL中性福爾馬林固定液，滴在已風(fēng)干的抹片上，靜置15 min，用清水將固定液吹去，待吹干或自然風(fēng)干后染色；（3）染色：將配好的姬姆薩染液滴在固定好后的抹片，染色2 h后沖去染液，涼干待檢；（4）鏡檢：在顯微鏡下觀察制備好的精子抹片，每個(gè)抹片觀察精子200個(gè)以上，記錄抹片上畸形精子個(gè)數(shù)，取兩片的平均值，如兩片的畸形率相差大于6則認(rèn)為不符合要求應(yīng)重新檢測(cè)。

精子畸形率計(jì)算公式如下：

2　結(jié)果與分析

2.1仔豬轉(zhuǎn)基因數(shù)的測(cè)定仔豬轉(zhuǎn)基因豬的PCR檢測(cè)，1%瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)出轉(zhuǎn)pGH、IGF-1雙基因豬4頭，轉(zhuǎn)pGH基因豬12頭，非轉(zhuǎn)基因豬7頭，如圖1、2所示：

2.2仔豬不同日齡體重的分析對(duì)23頭試驗(yàn)豬不同日齡進(jìn)行體重生長(zhǎng)的測(cè)定，比較同期轉(zhuǎn)

圖2　IGF-1基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

pGH、IGF-1雙基因豬、轉(zhuǎn)pGH單基因豬與非轉(zhuǎn)基因豬生長(zhǎng)性能，結(jié)果如表1所示。

由表1統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果可以看出，除30日齡和90日齡體重外，轉(zhuǎn)雙基因豬與非轉(zhuǎn)基因豬各月齡均差異顯著（P＜0.05），在30日齡時(shí)，轉(zhuǎn)單基因豬的體重高于轉(zhuǎn)雙基因豬和非轉(zhuǎn)基因豬。其后，轉(zhuǎn)雙基因豬生長(zhǎng)迅速，60日齡體重超過轉(zhuǎn)單基因和非轉(zhuǎn)基因豬?？偟膩碚f，轉(zhuǎn)雙基因豬分別比轉(zhuǎn)單基因豬、非轉(zhuǎn)基因豬高2.83%、7.37%，差異顯著（P＜0.05）。

2.3F1代的轉(zhuǎn)基因豬與非轉(zhuǎn)基因豬生長(zhǎng)分析

表1仔豬不同日齡的體重　　單位：kg

2.3.1不同時(shí)期轉(zhuǎn)基因豬的體尺對(duì)比對(duì)23頭試驗(yàn)豬3月齡、5月齡、6月齡進(jìn)行體尺生長(zhǎng)的測(cè)定，比較同期轉(zhuǎn)pGH、IGF-1雙基因豬、轉(zhuǎn)pGH單基因豬與非轉(zhuǎn)基因豬，結(jié)果如表2所示。

表2　不同時(shí)期仔豬體尺

從表2可以看出，5月齡時(shí)，轉(zhuǎn)雙基因豬、轉(zhuǎn)單基因豬和非轉(zhuǎn)基因豬的體高均差異顯著（P＜0.05）；轉(zhuǎn)雙基因豬和轉(zhuǎn)單基因豬的胸圍差異不顯著（P＞0.05），但都顯著高于非轉(zhuǎn)基因豬。6月齡時(shí)，3者之間在體高、體長(zhǎng)兩個(gè)指標(biāo)上均差異顯著（P＜0.05）?？偟膩碚f，在體尺指標(biāo)上，無論是體高、體長(zhǎng)還是胸圍，轉(zhuǎn)雙基因豬優(yōu)于轉(zhuǎn)單基因豬，轉(zhuǎn)單基因豬優(yōu)于非轉(zhuǎn)基因豬。

2.3.2仔豬體重達(dá)100 kg的日齡控制試驗(yàn)豬的體重在80～110 kg范圍之內(nèi)，轉(zhuǎn)雙基因豬體重達(dá)100 kg的日齡為171.07 d，轉(zhuǎn)單基因?yàn)?80.00 d，非轉(zhuǎn)基因?yàn)?83.30 d。轉(zhuǎn)雙基因豬比轉(zhuǎn)單基因豬少8.93 d，差異顯著（P＜0.05），轉(zhuǎn)雙基因豬比非轉(zhuǎn)基因豬少12.23 d，差異顯著（P＜0.05），轉(zhuǎn)單基因豬比非轉(zhuǎn)基因豬少3.3 d，差異不顯著（P＞0.05）。由此可見，轉(zhuǎn)雙基因豬的的生長(zhǎng)潛力最大，其次為轉(zhuǎn)單基因豬，非轉(zhuǎn)基因豬的生長(zhǎng)潛能最弱小。

2.3.3檢測(cè)精液量、精子密度、精子活力和畸形率采集6月齡公豬（轉(zhuǎn)雙基因2頭，轉(zhuǎn)單基因6頭，非轉(zhuǎn)基因3頭）精液，在光鏡下統(tǒng)計(jì)計(jì)算精子品質(zhì)如圖3，分別測(cè)定數(shù)據(jù)，如表3所示：

表3　不同公豬精液品質(zhì)

圖3　光鏡下精子活力圖?。?0×）

經(jīng)測(cè)量對(duì)比可以看出，就精液量而言，轉(zhuǎn)雙基因公豬分別與轉(zhuǎn)單基因公豬、非轉(zhuǎn)基因豬提高27.61%、18.31%，均差異顯著（P＜0.05）；精液密度，三者之間差異不顯著（P＞0.05）；精子活力，轉(zhuǎn)雙基因公豬與非轉(zhuǎn)基因公豬之間差異不顯著（P＞0.05）；畸形率，轉(zhuǎn)單基因公豬畸形率分別與轉(zhuǎn)雙基因公豬、非轉(zhuǎn)基因公豬高23%、18%，差異均顯著（P＜0.05）。

3　討論

3.1IGF-1基因與家豬生長(zhǎng)繁殖的相關(guān)性IGF-1是一類多肽，調(diào)控著骨骼肌的生長(zhǎng)發(fā)育，有研究表明，將IGF-1注入高齡或肌肉損傷的動(dòng)物肌肉中，能夠促進(jìn)成肌細(xì)胞快速增殖分化形成肌細(xì)胞，并且明顯增加肌肉重量［8］。Rhoads R.P.等［9］研究表明，降低營養(yǎng)水平使羊IGF-1基因表達(dá)量下降。IGF-1促進(jìn)大鼠和豬初情期前支持細(xì)胞的增殖［10］，IGF-I促進(jìn)未成熟間質(zhì)細(xì)胞有絲分裂。IGFs促進(jìn)精原細(xì)胞DNA合成，體外培養(yǎng)時(shí)維持大鼠有絲分裂前DNA合成。IGF-1促進(jìn)睪酮生產(chǎn)，對(duì)未成熟細(xì)胞的作用比成熟細(xì)胞明顯［11］。

結(jié)合本試驗(yàn)數(shù)據(jù)，轉(zhuǎn)雙基因豬生長(zhǎng)和繁殖優(yōu)于轉(zhuǎn)單基因豬優(yōu)于非轉(zhuǎn)基因豬，與其他動(dòng)物得到的結(jié)果一致。

3.2GH基因與家豬生長(zhǎng)繁殖的相關(guān)性GH直接作用于肝臟、脂肪、肌肉等組織。有研究表明，注射入提純的南方黑鯛GH的歐亞魚盧表現(xiàn)出明顯的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，大麻哈魚也顯現(xiàn)出額外的生長(zhǎng)特性［12］。GH參與雄性動(dòng)物的生殖調(diào)節(jié)，雄性動(dòng)物的繁殖狀態(tài)伴隨著GH分泌水平的變化［13］。GH缺乏的雄性動(dòng)物模型顯示多個(gè)內(nèi)分泌靶腺功能低下，生長(zhǎng)和性發(fā)育障礙，精子形成受阻，GH替代治療可取得明顯效果［14］。從生產(chǎn)上測(cè)得的轉(zhuǎn)基因公豬精子的數(shù)據(jù)，可知轉(zhuǎn)基因的公豬精液體積和密度優(yōu)于非轉(zhuǎn)基因公豬，但在精子活力方面非轉(zhuǎn)基因豬要優(yōu)于轉(zhuǎn)基因豬，特別是轉(zhuǎn)單基因豬與非轉(zhuǎn)基因豬差異顯著（P＜0.05），可能是GH過量表達(dá)對(duì)精子活力產(chǎn)生一種阻礙，其原理有待進(jìn)一步深入研究。

3.3pGH-IGF-1生長(zhǎng)軸與家豬生產(chǎn)性能的相關(guān)性生長(zhǎng)軸在動(dòng)物的生長(zhǎng)其中扮演了十分重要的角色，由動(dòng)物體內(nèi)下丘腦-垂體-靶器官的一系列激素及其受體所組成的神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)［15］。GH經(jīng)血液循環(huán)至肝臟，與細(xì)胞膜表面的GH結(jié)合，促進(jìn)IGFs的表達(dá)；IGFs通過血液循環(huán)到達(dá)機(jī)體的局部組織，促進(jìn)組織細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化［16］。由GH刺激的肝臟及肝外組織中IGF-1 mRNA升高，IGF-1的合成與分泌增加。本試驗(yàn)通過數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，轉(zhuǎn)雙基因豬要比非轉(zhuǎn)基因豬體重增長(zhǎng)快，差異顯著（P＜0.05），轉(zhuǎn)雙基因要比轉(zhuǎn)單基因在生長(zhǎng)更有優(yōu)勢(shì)，說明GH與IGF-1基因之間具有穩(wěn)定的聯(lián)系，兩者在家畜生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮著重要的作用。

［1］王子榮，趙茹茜，陳杰.通過生長(zhǎng)軸調(diào)控動(dòng)物生長(zhǎng)［J］.草食家畜，1999，01：41-45.

［2］Etherton T D，Bauman D E.Biology of somatotropin in growth and lactation of domestic animals［J］.Physiol Rev，1998，78：74-761.

［3］Pell J M，Bates P C.The nutritional regulation of growth hormone action［J］.Nutr Res Rev，1990，3：169-192.

［4］Perrini S，Laviola L，Carreiram C，et al.The GH/IGF1axis and signaling pathways in the muscle and bone：mechanisms underlying age-related skeletal muscle wasting and osteoporosis［J］.J Endocrinol，2010，205（3）：201-210.

［5］Roser J F.Regulation of testicular function in the st al lion：an intricate network of endocrine，paracrine and autocrine systems［J］. Anim Reprod Sci，2008，107（3-4）：179-196.

［6］姚延珠.轉(zhuǎn)雙基因（pGH-IGF-1）豬的制備及檢測(cè)［J］.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，03：39-62.

［7］Davies J S，Thompson N IM，Christian H C，et al.Hypothalamic expression of human growth hormone induces post-pubertal hypergonadotrophism in male trans genic growth rectarded rats［J］.Neuroendocrinol，2006，18（10）：719-731.

［8］Tapscoot S J，Davis R L，Thayer M J，et al.Myo D1：a nuclear phosphoprotein requiring a Myc homology region to convert fibroblasts to myoblasts［J］.Science，1988，242：405-411.

［9］Rhoads R P，Greenwood P L，Bell A W，et al.Nutritional regulation of the genes encoding the acid-labile subunit and other components of the circulating insulin-like growth factor system in the sheep［J］.J Animal Sci，2000，78（10）：2681-2689.

［10］Jaillard C，Chatelain P G，Saez J M.In vitro regulation of pig Sertoli cell growth and function：effects of fibroblast growth factor and somatomedin-C［J］.Biol Reprod，1987，37：665-674.

［11］胡義潔.轉(zhuǎn)基因豬pGH與IGF-1雙基因差異表達(dá)的研究［J］.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，01：15-45.

［12］Gnessi L，F(xiàn)abbri A，Spera G.Gonadal peptides as mediators of development and functional control of the testis：an Integrated system with hormones and local environment［J］.Endocrine Reviews，1997，18（4）：541-609.

［13］Bunter K L，Cai W，Johnston D J，et al.Selection to reduce residual feed intake in pigs produces a correlated response in juvenile insulin-like growth factor-I concentration［J］.J AnimSci，2010，88（6）：1973-1981.

［14］Hartke J L，Monaco M H，Wheeler M B，et al.Effect of a shortterm fast on intestinal disaccharidase activity and villus morphology of piglets suckling insulin-like growth factor-I transgenic sows［J］.J Anim Sci，2005，83（10）：2404-2413.

［15］Li Z，Wu Z，Ren G，et al.Expression patterns of insulin-like growth factor system members and their correlations with growth and carcass traits in Landrace and Lantang pigs during postnatal development［J］.Mol Biol Rep，2013，40（5）：3569-3576.

［16］王開云，張國生，曾檢華，等.利用生長(zhǎng)軸各激素調(diào)控動(dòng)物生長(zhǎng)［J］.江西畜牧獸醫(yī)雜志，2008，06：4-6.

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A

0529-6005（2016）09-0015-04

2016-01-26

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)投資項(xiàng)目（SDAIT-08-13）；科技部轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項(xiàng)（2014ZX08006-003）

范巖巖（1990-），男，碩士，主要從事動(dòng)物遺傳育種學(xué)研究，E-mail：1013844827@qq.com

張廷榮，E-mail：zhangtr2006@126.com；孫金海，E-mail：sunjihai00528@sina.com