劉立品，吳桂玲，李文浩，張偉，邢靜亞，張國權

（西北農林科技大學食品科學與工程學院，陜西楊凌712100）

堿性蛋白酶酶解青稞蛋白質的動力學研究

劉立品，吳桂玲，李文浩，張偉，邢靜亞，張國權*

（西北農林科技大學食品科學與工程學院，陜西楊凌712100）

為深入了解與調控堿性蛋白酶水解青稞蛋白過程，準確控制其水解程度，獲得定向肽組成的酶解產物。采用堿性蛋白酶在溫度55℃、pH10.0條件下酶解青稞蛋白，分析酶濃度、底物濃度對青稞蛋白水解度的影響，并建立可控酶解動力學方程。結果表明：青稞蛋白水解度隨著初始底物濃度S0的上升而下降，隨著初始蛋白酶濃度E0的增加而上升，水解速率隨著水解時間的延長而下降。模型的驗證結果顯示，預測值與實測值基本吻合，通過對E0/S0、反應時間的調節(jié)可有效控制水解程度，為利用酶解制備青稞活性肽的產業(yè)化實踐提供指導。

青稞蛋白；堿性蛋白酶；動力學；水解度

青稞（Hordeum Vulgare L.var.nudum Hook.f）是青藏高原的獨有物種和最具高原特色的農作物。其蛋白質含量為6.35％～23.40％，平均值為12.43％，低于燕麥和小麥，但高于其他谷類作物［1］。同時青稞中含有18種氨基酸，人體必需的氨基酸齊全［2-3］，對于補充機體每日必需氨基酸的需要有重要意義。因此青稞作為一種優(yōu)質的蛋白質來源開始受到越來越多的關注。

酶解是提高食物蛋白質營養(yǎng)價值、改善各種功能特性和擴大蛋白質應用領域的一種有效手段。酶解后的蛋白質具有良好的溶解性、乳化性、貯藏穩(wěn)定性及風味特性等，同時還可獲取具有生物活性的肽，能廣泛應用于食品、醫(yī)藥保健品、飼料產品等行業(yè)［4］。然而過度酶解會造成蛋白質某些功能特性減弱甚至完全喪失［5］。所以控制蛋白酶解程度對于獲得理想的目標產物至關重要。近年來，國內外關于蛋白質酶解的動力學的研究，主要集中在以小麥蛋白［6］、大米蛋白［7-8］為主的植物蛋白以及以乳蛋白［9］和魚蛋白［10-11］為主的動物蛋白。但少見青稞蛋白質的酶解動力學的報道。因此，本文以青稞中提取的青稞蛋白為原料，研究了堿性蛋白酶水解青稞蛋白質的動力學機制，并建立其水解過程的動力學模型，以期為青稞蛋白質的深度開發(fā)利用提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

北青6號（青海地區(qū)主要青稞品種）青稞籽粒由西藏農牧科學院研究所提供；堿性蛋白酶（酶活力＞10 000 U/g，實測酶活105U/g）：英國BDH公司；福林酚：美國sigma試劑公司；鹽酸、氫氧化鈉、甲醛等化學試劑均為分析純。

1.2儀器與設備

TDL-5-A臺式離心機：上海安亭科學儀器廠；PB-10 pH計：賽多利斯科學儀器有限公司；UV-1700紫外分光光度計：日本島津公司；KJELTE2100半自動凱氏定氮儀：瑞典富斯-特卡脫公司；79-1型磁力加熱攪拌器：江蘇榮華儀器制造有限公司。

1.3試驗方法

1.3.1青稞蛋白的提取及酶解

以青稞全粉為原料，采用堿溶酸沉法［12］提取。

取適量青稞蛋白，按一定底物濃度加水配成懸浮液，加1mol/L氫氧化鈉溶液將體系pH值調至10.0，加入適量堿性蛋白酶，55℃恒溫水解，達到酶解時間后，沸水浴滅酶5min，待冷卻至室溫后，4 000 r/min離心10min，取上清液放入冰箱冷藏備用。

1.3.2蛋白質含量的測定

粗蛋白含量測定：參照GB/T 5511-2008《谷物和豆類氮含量測定和粗蛋白質含量計算凱氏法》，凱氏定氮法。

1.3.3堿性蛋白酶酶活力的測定

采用Folin-酚法，參照SB/T 10317-1999《蛋白酶活力測定法》和白正晨等［13］的方法。

1.3.4酶解動力學模型的推導

堿性蛋白酶為一種絲氨酸型的內切蛋白酶，水解過程中可生成多種產物，符合雙底物順序反應機理［14-15］。其反應式可表示為：

其中k1、k-1、k2分別為酶與底物的結合常數、解離常數和產物生成常數。

根據李湘等［16］、林偉鋒等［17］的數學推導，蛋白酶有限水解蛋白質的動力學模型可用下式表示：

蛋白質酶解過程中水解速率的動力學模型：V=aS0exp［-b（DH）］，exp是指以e為底的指數函數（1）

蛋白質酶解過程中水解度的動力學模型：

式中：DH為水解度，％；V0為空白試驗加入甲醛后消耗的氫氧化鈉標準溶液體積，mL；V1為測定樣品加入甲醛后消耗的氫氧化鈉標準溶液體積，mL；V2為水解液總體積，mL；V3為滴定用水解液的體積，mL；c為氫氧化鈉標準溶液的濃度，mol/L；m為水解液中氨基氮的總量（凱氏定氮法），g。

1.3.6數據分析

采用軟件origin8.5對水解度與水解時間的方程式（2）進行非線性擬合；模型預測值與實測值之間的擬合程度通過平均相對誤差（E）進行評估。

式中：V表示反應速率，g/（L·min）；DH為水解度，％；E0為初始蛋白酶濃度，g/L；S0為初始底物濃度，g/L；c0為與底物濃度有關的堿性蛋白酶被鈍化的量的大?。籯2為反應速率常數，min-1；km為米氏常數，min-1，代表酶促反應中底物與酶之間結合力的強弱，km值大則其結合力弱，km值小則底物與酶之間親和力強［18］。

從動力學模型可知，若a≤0（即E0/S0≤c0），則V≤0，此時蛋白質水解無法實現。因此蛋白酶催化水解蛋白質，在初始底物濃度S0固定時，其初始蛋白酶濃度存在一個最低的臨界酶濃度，即初始蛋白酶濃度應滿足E0＞c0S0；同理，當初始蛋白酶濃度E0處于一定值時，初始底物濃度也存在一個最大的閾值，即初始底物濃度應滿足S0＜E0/c0。

由方程（3）可知，a的大小與酶解體系初始底物濃度S0和初始蛋白酶濃度E0有關，隨著S0的上升而減小，隨著E0的上升而增大；由于k2與水解溫度有關，因此，a的大小也隨著水解溫度的變化而變化。b的大小則與S0和E0無關，但與水解溫度的高低有關。因此在恒溫水解反應中，b的大小應為一個常數；a的大小只與酶解體系初始底物濃度和初始蛋白酶濃度有關。

1.3.5水解度的測定

采用甲醛滴定法［19］。水解度按下式進行計算：

2　結果分析

2.1酶解動力學參數的確定

為了確定動力學模型中的各個參數，研究水解體系中初始底物濃度S0和初始蛋白酶濃度E0對水解度的影響。在pH 10.0、反應溫度55℃條件下，以青稞蛋白為底物，堿性蛋白酶為催化劑進行水解。初始酶濃度為1.2 g/L時，不同底物濃度（5、10、20、30、40 g/L）對水解度的影響見圖1。初始底物濃度為10 g/L時，不同酶濃度（0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 g/L）對水解度的影響見圖2。

圖1　初始底物濃度S0對水解度的影響Fig.1 Effectsof the initialsubstrate concentration on the degreeof hyd rolysis

圖2　初始酶濃度E0對水解度的影響Fig.2 Effectsof the initialenzyme concentration on thedegreeof hydrolysis

由圖1、圖2中可知，在一定初始底物濃度和蛋白酶濃度下，蛋白質水解度隨酶解時間的增加而升高，在同一處理時間下，水解度隨初始底物濃度的增加而下降，隨初始蛋白酶濃度的增加而上升。這表明底物對酶的活力可能存在抑制作用［11］；而酶用量的增加可以大大增加酶與底物結合的幾率，從而增加水解度。對于同一初始底物濃度，水解速率隨著水解時間的延長而下降，并趨向于一個極限值，極限值隨初始底物濃度的增大而呈下降趨勢。由此推測在反應體系中，底物可能對酶有抑制作用，當底物濃度達到一較大值后，這種抑制作用增強。另外，過高的底物濃度易造成水解液黏度增大，影響蛋白酶擴散，從而對水解反應產生抑制作用［20］。對于同一初始酶濃度，水解速率隨著水解時間的延長而下降，并趨向于一個極限值，極限值隨初始酶濃度的增加而提高。即體系水解速率隨反應時間和水解度的增加而減小，這可能歸因于：1）隨著酶解反應的進行，水解體系中可作用肽鍵的濃度下降；2）產物中的某些組分可能與酶的活性部分結合，對酶產生抑制作用，導致體系整體反應速率較之反應初始階段有明顯的下降趨勢；3）隨著底物濃度的增加，體系中有效底物與酶結合時阻礙作用增大［16］。

利用軟件origin8.5對水解度與水解時間的方程式進行非線性擬合，求得動力學參數a和b，結果如表1所示。

表1　青稞蛋白質酶解動力學參數Table1 Valuesof kinetic param eters for hyd rolysisof hulless barley protein

由表1可知，動力學參數a隨著初始底物濃度S0的增加而減小，隨著初始蛋白酶濃度E0的增大而增大。動力學參數b在不同的初始底物濃度和初始蛋白酶濃度條件下，其數值都相差很小，接近一個常數。因此在一個恒溫水解反應中，b可以看作是一個常數，取其平均值0.490，這與模型推導所得結論一致。

2.2酶解反應速率常數的確定

由方程（3）可知，參數a依賴于酶解反應速率常數k2，對a值與E0/S0值作圖，確定k2，并驗證方程的擬合情況，如圖3所示。

圖3　參數a值與初始酶濃度/初始底物濃度的線性關系Fig.3 Linear relationship between parameter a and thevaluesof initialenzym e concentration/initialsubstrate concentration

由圖3得到的線性關系式可知，a值隨著E0/S0值關系曲線所對應的方程為

酶解反應速率常數k2=8.935 8min-1；c0=2.34×10-3。由此可知，在溫度55℃、pH10.0條件下，不同初始底物濃度所對應的臨界初始蛋白酶濃度為E0=2.34× 10-3S0，不同初始酶濃度所對應的臨界初始底物濃度為S0=427.55E0。即當E0≤2.34×10-3S0或S0≥427.55E0時，水解速率為負數，水解反應不會發(fā)生。因此，堿性蛋白酶可控酶解青稞蛋白的水解反應需滿足：E0＞2.34×10-3S0；S0＜427.55E0。

將a值和b值代入方程V=aS0exp［-b（DH）］中，可得到堿性蛋白酶酶解青稞蛋白的動力學模型分別為：

水解速率的動力學模型：V=（8.935 8E0-0.020 9S0）exp（-0.49DH）

水解度的動力學模型：DH=2.041ln［1+（4.38E0/S0-0.010 2）t］

從動力學模型可知，水解速率隨著初始蛋白酶濃度的增加而上升，但隨著水解度的上升而下降，這與圖1和圖2中的試驗結果相符。由圖3可知，a值與E0/S0值有良好的線性關系，與由反應機理推導所得的公式一致，再次證明動力學模型的有效性。

2.3蛋白酶失活速率常數的確定

將a與b相乘得到關系式：

式中：k4為水解反應過程中堿性蛋白酶的失活常數。參數ab值與k4呈線性關系，對ab值與E0/S0值作圖得到的線性關系式為：

青稞蛋白水解過程中堿性蛋白酶的失活常數為k4=3.564 7min-1，失活常數越小，底物及產物抑制作用越強［21］。為提高蛋白酶的酶解效率，可通過分析堿性蛋白酶酶解產物組成，分離出抑制性強的產物來實現。

圖4　參數ab值與初始酶濃度/初始底物濃度的線性關系Fig.4 Linear relationship between parameter ab and thevaluesof initialenzyme concentration/initialsubstrate concentration

2.4動力學模型驗證

把可控酶解的動力學模型的計算結果與實際水解結果進行對比，可以驗證動力學模型的實際應用價值。圖中選擇初始底物濃度10 g/L、初始酶濃度分別為0.6、0.8 g/L條件下獲得的水解度與酶解動力學模型計算得到的水解度進行作圖比較，結果見圖5。

圖5　水解動力學模型的驗證Fig.5 Validation on kinetic hydrolysismodel

如圖5所示，動力學模型的計算值與實測值在酶解初始階段相當吻合，但隨著反應的進行，其計算值與實測值有一定的差異。這可能是由不同肽鏈長度的酶解產物對反應速率的抑制作用大小存在差異引起的。采用平均相對誤差對實測值與模型預測值之間的擬合程度進行評估，結果表明，當初始底物濃度為10 g/L、初始酶濃度為0.6 g/L時，實測值與預測值之間的平均相對誤差為4.31％；初始底物濃度為10 g/L、初始酶濃度為0.8 g/L時，實測值與預測值之間的平均相對誤差為3.62％。兩體系所考查數據的總平均相對誤差為3.97％，動力學模型預測結果與實驗結果相當吻合，這說明所建立的動力學模型具有很高的實際應用價值。

3　結論

采用堿性蛋白酶在溫度55℃、pH10.0條件下對青稞蛋白進行水解，水解度隨著初始底物濃度S0的上升而下降，隨著初始酶濃度E0的增加而上升。水解速率動力學模型為：V=（8.935 8E0-0.0209S0）exp（-0.49DH）；水解度的動力學模型為：DH=2.041ln［1+（4.38E0/S0-0.010 2）t］。

堿性蛋白酶水解青稞蛋白過程中，不同初始底物濃度所對應的初始蛋白酶濃度應滿足：E0＞2.34×10-3S0；不同初始酶濃度所對應的初始底物濃度應滿足：S0＜427.55E0；可控酶解過程中堿性蛋白酶的失活常數k4= 3.371 3min-1，水解動力學模型的預測值與實驗值相比較，總平均相對誤差為3.97％，預測值與實測值非常吻合，可用來指導和優(yōu)化酶解反應。

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Kinetic Studies on Hulless Barley Protein Hydrolysis by Alkaline Protease

LIU Li-pin，WUGui-ling，LI Wen-hao，ZHANG Wei，XING Jing-ya，ZHANG Guo-quan*
（College of Food Scienceand Engineering，North west A＆amp;FUniversity，Yangling 712100，Shaanxi，China）

In order to understand and control the hydrolysis process of alkaline protease on hulless barley protein，and obtain the targetpeptides from enzymolysis productsby controlling the degree ofhydrolysis accurately，effects of enzyme concentration and substrate concentration on the degree of hydrolysis of hulless barley proteinwere studied，and the kineticsequation of limited hydrolysiswasalso established through the enzymatic hydrolysisofhullessbarley protein by alkaline protease at55℃and pH10.0.The results showed thathydrolysis degreeofhullessbarley proteinwas increasedwith the initialenzyme concentration（E0）increasing，while decreased alongwith the initial substrate S0concentration increasing.Hydrolysis rate was decreased with the extension ofhydrolysis time.The verification of themodelshowed thatpredicted valuesagreedwellwith theexperimentaldata.Therefore，hydrolysisdegree can beeffectively controlled through theadjustmentof E0/S0ratio and reaction time.These results could be used as the guidance to industrial production ofhullessbarley active peptidesbymeansofenzymatic technology.

hullessbarleyprotein；alkalineprotease；kinetic；degreeofhydrolysis

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.18.005

西藏農牧科院農業(yè)研究所委托項目（CARS-05-05B）

劉立品（1989—），女（漢），碩士研究生，研究方向：糧食、油脂及植物蛋白工程。

張國權（1968—），男（漢），教授，博士，研究方向：谷物品質評價及淀粉工程技術。

2015-12-23