張 玉，楊 先，姜麗萍，劉桂波，王雙雙

·實驗論著·

BMP-2在C57BL/6小鼠形覺剝奪性近視眼鞏膜中表達的變化

張 玉，楊 先，姜麗萍，劉桂波，王雙雙

Department of Ophthalmology，the Affiliated Hospital of Qingdao University，Qingdao 266003，Shangdong Province，China

Correspondence to:Xian Yang.Department of Ophthalmology，the AffiliatedHospitalofQingdaoUniversity，Qingdao266003，Shangdong Province，China.yangxian_zhao@126.com

·AIM:Toidentifythepresencechangeofbone morphogenetic protein-2（BMP-2）in sclera of form deprivation myopic（FDM）eyes in C57BL/6 mice and to investigate its role in sclera remodeling.

·METHODS:A total of 64 C57BL/6 mice which were 3～4wk were randomized into FDM-21d group（n=16），a normal control group（n=16）；FDM-28d group（n=16）and a normal control group（n=16）.FDM models were established by sutured 0.5mL PCR plastic caps to the skin surrounding the right eye for 21 days and 28 days in experimental group，and the fellow eyes served as the self-control eyes.Diopter and axial length of all eyes was tested by retinoscopy optometry and vernier calipers before and after the form deprivation.As the models established，the sclera of the mice were obtained and hematoxylin and eosin（H-E）staining were used for observingthemorphologicalchangeinthetissue. Immunohistochemicalstainingandfluorescence quantificational real-timepolymerasechainreaction（QRT-PCR）were applied to investigate the expression of BMP-2 protein and mRNA.

·RESULTS:After 21 and 28d，the diopter of the deprived eyes was-1.60±1.03D and-3.10±1.19D and the axial length wasprolongedby 16±12μmand 21±13μm respectively.The differences were statistically significant，compared to self-control eyes and to normal control groups（P＜0.05）.After stained by H-E，the sclera from the deprived eyes became thinner and the sequence of collagenous fiberdisappeared.Theresultsfromthe immunohistochemical staining and QRT-PCR showed that mRNA and protein of BMP-2 decreased significantly，and the differences were statistically significant，compared to self-control eyes and to normal control groups（P＜0.05）. ·CONCLUSION:The expressions of the BMP-2 in sclera down-regulate significantly in FDM eyes，which suggests that BMP-2mayplayanimportantroleinsclera remodeling during myopia development.

目的：觀察C57BL/6小鼠形覺剝奪性近視（formdeprivation myopia，F(xiàn)DM）鞏膜中BMP-2表達的變化，研究其在鞏膜重塑中發(fā)揮的作用。

方法：選擇3～4周齡的C57BL/6小鼠64只，以隨機數(shù)字表法隨機分為形覺剝奪21d組（16只）、同齡對照組（16只）；形覺剝奪28d組（16只）、同齡對照組（16只）。形覺剝奪前后對所有小鼠進行帶狀光剪影驗光檢測小鼠眼球的屈光狀態(tài)，游標卡尺測量小鼠的眼軸長度，造模后分別于21d和28d取小鼠的鞏膜組織，蘇木素-伊紅（HE）染色觀察小鼠鞏膜組織形態(tài)學(xué)變化，用熒光定量RT-PCR和免疫組織化學(xué)檢測各組小鼠鞏膜BMP-2 mRNA和其蛋白的表達水平。

結(jié)果：小鼠形覺剝奪21d和28d后，剝奪眼分別誘導(dǎo)出-1.60±1.03D和-3.10±1.19D的相對近視，眼軸分別拉長16±12μm和21±13μm，與自身對照組和正常對照相比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。HE染色行鞏膜形態(tài)學(xué)觀察，可觀察到剝奪眼鞏膜變薄，膠原纖維排列紊亂。熒光定量RT-PCR和免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示實驗眼BMP-2 mRNA和蛋白的表達明顯下調(diào)，與自身對照和正常對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

結(jié)論：C57BL/6小鼠形覺剝奪眼鞏膜中BMP-2呈下調(diào)趨勢，BMP-2可能參與了近視發(fā)展過程中的鞏膜重塑作用，其具體機制有待進一步研究。

C57BL/6小鼠；骨形態(tài)發(fā)生蛋白；形覺剝奪性近視；鞏膜

引用：張玉，楊先，姜麗萍，等.BMP-2在C57BL/6小鼠形覺剝奪性近視眼鞏膜中表達的變化.國際眼科雜志2016；16（3）: 423-427

0　引言

目前普遍認為，近視的發(fā)生受遺傳和環(huán)境等多因素的綜合影響［1］，但確切的發(fā)病機制仍不清楚。在近視的發(fā)展過程中，鞏膜膠原聚集減少，降解增加，這些改變導(dǎo)致鞏膜干重的下降，以及鞏膜后極部膠原纖維平均直徑變小，膠原纖維分布紊亂［2］。關(guān)于鞏膜細胞外基質(zhì)（extracellar matrix，ECM）的改變已經(jīng)有了相關(guān)的研究，McBrien［3］發(fā)現(xiàn)BMP/TGF-β信號通路有調(diào)控鞏膜ECM的作用。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs）是轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）超家族中的一員。BMPs超家族在細胞的許多功能當中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，其與多種組織的形態(tài)發(fā)育和細胞外基質(zhì)重塑相關(guān)，被稱為“體形態(tài)發(fā)生蛋白”。研究證明，BMP-2可以促進體外培養(yǎng)的人類鞏膜成纖維細胞（human scleral fibroblasts，HSFs）中ECM的合成［4］。王青等［5］發(fā)現(xiàn)豚鼠近視模型中，14d后近視眼鞏膜中BMP-2的表達明顯下降。Liu等［6］發(fā)現(xiàn)BMP2K基因異常與高度近視密切相關(guān)，說明BMP-2與近視的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本文通過建立C57BL/6小鼠形覺剝奪性近視模型，研究BMP-2在鞏膜中的變化，探討其在鞏膜重塑中的作用。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 選用3～4周齡C57BL/6雄性小鼠64只（購自常州卡文斯實驗動物有限公司，由青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗中心飼養(yǎng)），體質(zhì)量10～13g，排除患有眼疾及雙眼屈光參差＜1.5D的小鼠，每籠4只，室溫控制在20℃～25℃，光照/黑暗周期為14h/10h，室內(nèi)控制照明調(diào)節(jié)在250～350Lu。給予小鼠專用飼料，并每日給予新鮮蔬菜水果，自由飲水，動物的飼養(yǎng)及處理經(jīng)青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物倫理委員會審批通過。

1.1.2主要試劑與儀器 帶狀光剪影鏡（蘇州六六）、兔抗鼠多克隆抗體BMP-2（BA0585-1）購于武漢博奧森公司，SP試劑盒購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，Ver.3.0型RNA PCR試劑盒（100次量）購于大連寶生物試劑公司，SYBY（日本，TaKaRa）、實時熒光定量PCR儀（德國Eppendorf），PCR引物由大連寶生物工程有限公司合成。

1.2方法

1.2.1小鼠形覺剝奪性近視模型的建立 64只3～4周齡雄性近交系C57BL/6小鼠，隨機分為形覺剝奪組（n=32）和正常對照組（n=32）:（1）形覺剝奪組選取右眼為剝奪眼，佩戴0.5mL EP管蓋子，左眼作為自身對照眼，依據(jù)形覺剝奪時間21d、28d不同時間建立近視動物模型。（2）正常對照組，在頸部佩戴塑料項圈，雙眼不做任何處理，年齡與實驗組相同。小鼠用5%枸櫞酸芬太尼注射液以4mg/kg麻醉后，將0.5mL EP管蓋子用5-0縫線縫4～6針在小鼠眼周，被遮眼能瞬目，不壓迫眼球，頸部佩戴項圈，防止小鼠將眼罩抓脫。每天用棉簽擦拭小鼠對側(cè)眼及眼周，防止感染，每天3次檢查小鼠眼罩是否掉針，脫落，以保證小鼠被遮眼一直處于被遮狀態(tài)。誘導(dǎo)21d和28d后，分別檢查所有動物的屈光度和眼軸長度，并取鞏膜組織進行檢測。

1.2.2屈光度及眼軸長度的測量 小鼠在清醒的狀態(tài)下，用復(fù)方托吡卡胺散瞳，每5min 1次，連續(xù)3次后，驗光由有經(jīng)驗的驗光師在暗室條件下，手持帶狀光檢影鏡檢測屈光度，每只小鼠測3次，取平均值并記錄屈光值（D）。脫頸法處死小鼠后，迅速取出眼球，在顯微鏡下去除多余筋膜及肌肉組織，用生理鹽水沖洗后，用電子游標卡尺測量眼軸的長度（角膜的前頂點到眼球后極部之間的直線距離），精確到0.01mm，測量3次后取平均值并記錄。

1.2.3標本的處理 所有操作均在顯微鏡觀察下在冰床上進行，取出眼球后，用眼科鑷和眼科剪剝離眼球周圍筋膜，沿角膜緣將眼球剪開，去除眼球內(nèi)的玻璃體，并將視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜分離，取鞏膜組織，隨機各組取6只小鼠眼球置于4%甲醛固定48h，行常規(guī)HE染色及免疫組織化學(xué)染色，各組另10只小鼠眼球的鞏膜組織置于500mL Trizolz液中，并立即震蕩充分裂解后，保存于-80℃以提取RNA，進行實時熒光定量PCR反應(yīng)。

1.2.4HE染色觀察小鼠鞏膜組織形態(tài)學(xué)變化和免疫組織化學(xué)染色法檢測BMP-2蛋白的表達 在各個實驗組中取6只小鼠眼球，予以常規(guī)石蠟包埋，所有組織塊于后極部以3μm的厚度連續(xù)切片4張，一張用于蘇木素-伊紅（HE）染色，1張用做陰性對照，2張用于免疫組織化學(xué)染色:（1）石蠟切片置于60℃溫箱中烤片過夜；（2）行常規(guī)梯度酒精脫蠟至水；（3）高壓抗原修復(fù):0.01mol/L檸檬鈉溶液500mL于高壓鍋中煮沸后，放入石蠟切片，中火至冒氣，再改為小火2min，然后冷卻至室溫，蒸餾水沖洗3遍；（4）3%H2O2室溫孵育15min，蒸餾水沖洗，PBS漂洗3min ×3次；（5）正常山羊血清工作液封閉，室溫孵育15min，傾去血清，勿洗，滴加1∶100稀釋兔抗鼠多克隆抗體BMP-2單克隆抗體工作液，37℃濕盒孵育2h；（6）滴加生物素化二抗工作液，室溫孵育15min，PBS漂洗5min×3次；（7）滴加PV-6001工作液，室溫孵育15min，PBS漂洗5min×3次；（8）DAB顯色5min，在顯微鏡下掌握染色程度，自來水沖洗終止染色；蘇木素復(fù)染細胞核10s，1%鹽酸酒精分化脫色，自來水洗1遍；（9）60℃溫箱中烤干后，樹膠封固，顯微鏡下觀察、拍片。光鏡下分別觀察各組標本中BMP-2的顯色程度、分布范圍及密度，以細胞核或細胞漿然染成棕黃色為陽性。使用Image-Pro Plus 6.0軟件分析檢測圖像，用平均光密度值表示BMP-2的相對蛋白表達量。以PBS代替一抗為陰性對照。

1.2.5實時熒光定量PCR檢測小鼠鞏膜中BMP-2 mRNA表達 提取總RNA:從-80℃冰箱內(nèi)取出凍存的小鼠鞏膜組織，用Trizol法提取總RNA。目的基因應(yīng)用primer design基因分析軟件設(shè)計引物，并由TaKaRa生物公司合成。BMP-2上下游引物分別為:5'-TGACTGGATCGTGGCACCTC-3'，5'-CAGAGTCTGCACTATGGCATGGTTA-3'，產(chǎn)物片段長為156bp；內(nèi)參β-action上、下游引物分別為:5'-GATTACTGCTCTGGCTCCTAGC-3'，5'-GACTCATCGTACTCCTGCTTGC-3'，產(chǎn)物長度301bp。常規(guī)提取總RNA，采用紫外分光光度計分別測定光密度OD260與OD280，OD260與OD280比值在1.8～2.0之間，表明提取的RNA蛋白污染少，純度較好。逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以cDNA為模板擴增BMP-2目的基因，Syber Green熒光定量PCR檢測:PCR熱循環(huán)參數(shù)為95℃30s，95℃5s，然后第二步反應(yīng)60℃30s，95℃15s，進行40個循環(huán)，于每個循環(huán)的第二步（95℃15s）收集熒光信號。擴增結(jié)束后，進入分析結(jié)果界面，以β-actin作為內(nèi)參照基因，與對照組相比較得到目的基因的相對定量值RQ（RQ=2-△△Ct）。

統(tǒng)計學(xué)分析:應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)SPSS 17.0軟件對結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以±s表示，實驗眼與自身對照眼相比采用配對樣本t檢驗，實驗眼及自身對照眼與正常對照組相比采用獨立樣本t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1　各組小鼠FDM后屈光度和眼軸長度的變化±s

表1　各組小鼠FDM后屈光度和眼軸長度的變化±s

注:aP＜0.01，bP＜0.01 vs自身對照眼；cP＜0.05，eP＜0.05 vs正常對照眼。

時間組別眼數(shù)屈光度（D）眼軸長度（mm）FDM21d正常對照眼163.04±0.533.134±0.032自身對照眼163.01±1.263.137±0.028實驗眼161.45±1.15a，c3.155±0.032a，cFDM28d正常對照眼162.48±0.673.241±0.041自身對照眼162.45±0.543.243±0.038實驗眼16-0.57±0.28b，e3.271±0.041b，e

表2　正常對照組與FDM自身對照眼及實驗眼小鼠鞏膜BMP-2平均光密度值±s

表2　正常對照組與FDM自身對照眼及實驗眼小鼠鞏膜BMP-2平均光密度值±s

注:aP＜0.05 vs自身對照眼；cP＜0.05 vs正常對照眼；bP＜0.01 vs自身對照眼；dP＜0.01 vs正常對照眼。

時間眼數(shù)正常對照眼自身對照眼實驗眼FDM 21d60.662±0.029 0.627±0.006 0.215±0.022a，cFDM 28d60.748±0.010 0.714±0.011 0.198±0.020b，d

圖1　小鼠正常眼后極部各層結(jié)構(gòu)HE染色（×400） 從上到下依次為:NFL:神經(jīng)纖維層（nerve fibre layer）；GCL:神經(jīng)節(jié)細胞層（ganglon cell layer）；IPL:內(nèi)叢狀層（inner plexiform layer）；INL:內(nèi)核層（inner nuclear layer）；OPL:外叢狀層（outer plexiform layer）；ONL:外核層（outer nuclear layer）；IS:內(nèi)節(jié)（inner segment）；OS:外節(jié)（out segment）；RPE:視網(wǎng)膜色素上皮層（retinal pigment epithelium）；Choriod:脈絡(luò)膜；Sclera:鞏膜。

2　結(jié)果

2.1各組小鼠屈光度和眼軸長度結(jié)果 實驗前，正常對照組、自身對照組以及實驗組的平均屈光度數(shù)為4.31± 1.35、3.71±1.14、4.22±1.47D，實驗前屈光度均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。形覺剝奪21d后，實驗眼較自身對照眼偏向近視方向-1.50D，與自身對照和正常對照眼屈光度比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-12.275，P=0.000；t= -13.971，P=0.000），實驗眼的眼軸也較自身對照眼和正常眼明顯延長，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=5.723，P= 0.011；t=6.118，P=0.007）。隨著形覺剝奪時間的延長，剝奪28d后，實驗眼相對自身對照眼偏向近視約-3.0D，實驗眼與自身對照眼（t=-14.832，P=0.000）及正常對照眼（t=-16.123，P=0.000）相比均產(chǎn)生明顯的近視。眼軸長度增長了21±13μm，實驗眼與自身對照及正常對照相比組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=5.437，P=0.012；t=7.812，P=0.002）。形覺剝奪前后各組的實驗眼、自身對照眼和正常對照眼屈光狀態(tài)和眼軸長度的變化見表1。

2.2各組小鼠光鏡下鞏膜的改變 小鼠正常眼后極部各層組織HE染色見圖1，可以觀察到小鼠鞏膜成纖維細胞核染成藍紫色，呈長梭型，細胞外基質(zhì)為粉紅色，對照眼鞏膜自赤道部向后極部鞏膜逐漸增厚，而實驗眼缺乏這種特征。各組小鼠眼后極部結(jié)構(gòu)見圖2，形覺剝奪21d時，可以觀察到實驗眼分別與自身對照眼及正常眼相比較鞏膜變薄，成纖維細胞排列紊亂；形覺剝奪28d后，實驗眼分別與自身對照眼及正常眼相比較可以觀察到鞏膜變薄，膠原纖維紊亂、粗細不均，成纖維細胞之間的間隙變大。

2.3各組小鼠免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 BMP-2陽性蛋白表達于正常小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞、內(nèi)核細胞層、外核細胞層、內(nèi)外節(jié)細胞及鞏膜細胞的胞漿中，呈棕黃色顆粒狀，胞核呈現(xiàn)藍色。成纖維陽性細胞內(nèi)胞漿染成深棕色，染色明顯。在小鼠形覺剝奪21d后BMP-2表達逐漸下調(diào)，胞漿著色減弱；形覺剝奪28d后，成纖維細胞著色最淺。用圖像分析軟件Image proplus6.0檢測BMP-2蛋白表達的強度，用平均光密度值表示（表2），其值越大說明染色越深，BMP-2蛋白表達越高；反之表示染色越淺，說明BMP-2蛋白表達量小。形覺剝奪21d實驗眼分別與自身對照眼及正常對照眼相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-4.461，P= 0.012；t=-5.521，P=0.007），隨著形覺剝奪時間的延長，形覺剝奪28d實驗眼染色越淺，與自身對照眼及正常眼相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-9.907，P=0.000；t=-8.025，P= 0.000，圖3）。

2.4各組小鼠鞏膜BMP-2 mRNA的表達 根據(jù)熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示，各組鞏膜組織均有BMP-2 mRNA的表達。形覺剝奪21d后，可觀察到實驗眼BMP-2 mRNA的表達量為0.432±0.041，與自身對照組（0.872± 0.032）和正常對照組（0.913±0.026）相比，BMP-2 mRNA的表達呈下調(diào)趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-4.465，P= 0.016；t=-4.827，P=0.011）。近視誘導(dǎo)28d時，實驗眼BMP-2 mRNA表達量為0.376±0.025，與自身對照組（0.926±0.013）和正常對照組（0.972±0.016）相比明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-5.179，P=0.009；t=-7.016，P= 0.002；圖4）。3討論

在眼球正常發(fā)育過程中，鞏膜成纖維細胞及其分泌的I型膠原等細胞外基質(zhì)成分共同構(gòu)成細胞外壁，維持眼球組織完整并決定眼軸長度［7］。在以往的研究中發(fā)現(xiàn)，哺乳動物模型眼典型的鞏膜改變是厚度變薄，這種減少主要是膠原蛋白I合成減少、蛋白聚糖降解增加共同造成的，Ⅲ型膠原和Ⅳ型膠原的含量并不受影響，這種改變導(dǎo)致鞏膜膠原纖維組成成分的改變，而后者直接影響膠原纖維直徑，是小直徑的膠原纖維增加的原因，本研究發(fā)現(xiàn)形覺剝奪后鞏膜較對側(cè)眼變薄，膠原纖維排列紊亂，粗細不均，間隙變大，以形覺剝奪4wk尤為明顯，可能由于FDM眼膠原纖維合成的紊亂而新的膠原纖維又尚未生成，成纖維細胞密度降低，鞏膜變薄，引起鞏膜生物力學(xué)特性的改變，最終導(dǎo)致眼軸的延長。

以往大量的研究證明，近視的發(fā)生是大量異常信息的作用下，視網(wǎng)膜上的信號直接到達鞏膜，發(fā)生近視，然而胡誕寧等［8］將已知有關(guān)近視的生長因子、激素和神經(jīng)傳遞因子同人類視網(wǎng)膜色素上皮細胞和脈絡(luò)膜黑色素細胞的研究中發(fā)現(xiàn)，上述細胞含有幾乎所有的受體，據(jù)此可以推測是由視網(wǎng)膜將信號傳遞給色素上皮和脈絡(luò)膜，由其再產(chǎn)生下一級活性物質(zhì)（二級信號），再作用于鞏膜。

圖2　各組小鼠鞏膜HE染色圖片（×400） A:形覺剝奪21d自身對照眼；B:形覺剝奪21d實驗眼；C:21d正常對照眼；D:形覺剝奪28d自身對照眼；E:形覺剝奪28d實驗眼；F:28d正常對照眼。

圖3　各組小鼠免疫組織化學(xué)染色圖片（×400） A:FDM 21d組自身對照眼；B:FDM 21d組實驗眼；C:FDM 28d組自身對照眼；D:FDM 28d組實驗眼。

圖4　各組C57BL/6小鼠鞏膜中BMP-2 mRNA的表達 實驗眼分別與自身對照眼及正常眼比較，P＜0.05。

現(xiàn)認為，TGF-β介導(dǎo)的鞏膜成纖維細胞的激活是發(fā)生鞏膜重塑的重要原因［9-11］。而BMPs是轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）超家族最大的成員，能夠調(diào)節(jié)多種細胞功能，是TGF-β家族中多效的調(diào)節(jié)因子，本研究發(fā)現(xiàn)B6小鼠視網(wǎng)膜和鞏膜中均存在BMP-2，F(xiàn)DM眼視網(wǎng)膜和鞏膜中BMP-2表達量明顯下降，表明BMP-2在鞏膜重塑過程中起到重要作用。

BMP-2是肝素結(jié)合型細胞因子，在角膜中能調(diào)節(jié)成纖維細胞的凋亡［12］，在體外細胞培養(yǎng)中，BMP-2能促進鞏膜成纖維細胞增殖，并呈劑量依賴性［13］。王青等［14］發(fā)現(xiàn)BMP-2在豚鼠的后鞏膜中有表達，并且FDM眼后鞏膜部的BMP-2表達明顯下降。本研究發(fā)現(xiàn)BMP-2在C57BL/6小鼠的視網(wǎng)膜和鞏膜中均有表達，并呈下降趨勢。提示BMP-2可能是近視的相關(guān)信號因子，參與了鞏膜重塑的過程。本實驗與其他實驗不同的是:本實驗首次驗證了小鼠的視網(wǎng)膜和鞏膜中存在BMP-2，而且采用小鼠作為近視模型，最大的優(yōu)點是小鼠的基因表達譜明確，和人類基因有90%基因同源，其眼球的cDNA文庫同人類的極其相似，這就為今后在分子和基因水平研究近視提供了模型基礎(chǔ)。

本實驗中，我們參考Wu等［15］的實驗方法，采用給小鼠佩戴眼罩的方法誘導(dǎo)近視模型，用離體測量的方法測量小鼠的眼軸長度，褚仁遠等已經(jīng)用離體測量眼軸長度的方法說明了形覺剝奪眼眼軸隨著遮蓋時間的延長而延長，證明了小鼠眼軸長度離體測量的可行性［16-18］。對于本實驗過程中出現(xiàn)的剝奪眼和自身對照眼均趨向近視方向發(fā)展，我們認為可能是由于長時間的光照引起的，Zhou等［19］將B6小鼠給予不同的光照時間，結(jié)果發(fā)現(xiàn)光照時間最長的小鼠更易發(fā)生軸性近視。吳曉敏等用13d的C57BL/6小鼠按照黑暗/光照周期分為18/6，12/12，6/12組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著光照時間的延長，小鼠眼球向近視方向發(fā)展，晶狀體變薄，玻璃體腔變長，后極部鞏膜直徑變小，又將小鼠分別置于光照強度為125、250、375Lu條件下飼養(yǎng)14d后發(fā)現(xiàn)，光照強度不會影響小鼠眼球正常的屈光發(fā)育，然而這與國外學(xué)者的研究不相符。Karouta等［20］研究發(fā)現(xiàn)，形覺剝奪近視小雞分別用15 000Lu和500Lu照射，近視程度呈明顯降低趨勢。目前光照的強度和屈光狀態(tài)之間的關(guān)系目前仍不確定，有待進一步的研究。

另外，在本研究發(fā)現(xiàn)以往小鼠造模過程中，大多采用8%水合氯醛（40mg/kg）麻醉小鼠。然而水合氯醛可以引起小鼠晶狀體混濁，這種混濁可能與小鼠眼球外突、眼瞼不能閉合和角膜干燥有關(guān)［21］，然而在近視造模的整個階段，需要晶狀體和角膜保持透明，以檢測小鼠剝奪前和剝奪后雙眼的屈光狀態(tài)，因此水合氯醛不適合用于小鼠近視模型的制備。而枸櫞酸芬太尼具有鎮(zhèn)痛的作用［22］，我們采用5%枸櫞酸芬太尼注射液以4mg/kg麻醉小鼠后，可以達到較好的效果，能夠順利完成小鼠造模過程，并且不會引起小鼠晶狀體混濁、角膜干燥等。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)C57BL/6小鼠視網(wǎng)膜和鞏膜中均存在BMP-2，并且小鼠形覺剝奪眼中鞏膜BMP-2呈下降趨勢，提示BMP-2可能參與了FDM后鞏膜重塑過程，但其信號通路的具體機制仍需進一步研究。

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Role of bone morphogenetic protein-2 in scleraremodelingofformdeprivation myopic eyes in C57BL/6 mice

Yu Zhang，Xian Yang，Li-Ping Jiang，Gui-Bo Liu，Shuang-Shuang Wang

s:the National Natural Science Foundation of China（Youth Foundation，No.81300790）；Natural Science Foundation of Shangdong Province（No.BS2010SF009）

2015-12-11 Accepted:2016-02-25

C57BL/6mice；bonemorphogenetic protein-2；form-depriviation myopia；sclera

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目（No. 81300790）；山東省自然基金項目（No.BS2010SF009）

（266003）中國山東省青島市，青島大學(xué)附屬醫(yī)院眼科作者簡介:張玉，女，在讀碩士研究生，研究方向:小兒斜視與弱視。

楊先，博士，副教授，副主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師，研究方向:視光學(xué)與斜視弱視.yangxian_zhao@126.com

2015-12-11

2016-02-25

Zhang Y，Yang X，Jiang LP，et al.Role of bone morphogenetic protein-2 in sclera remodeling of form deprivation myopic eyes in C57BL/6 mice.Guoji Yanke Zazhi（Int Eye Sci）2016；16（3）:423-427

10.3980/j.issn.1672-5123.2016.3.05