白亦光，陳巧玲，肖東琴，劉康，馮剛

(川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院·南充市中心醫(yī)院，1.骨科；2.腫瘤科；3.組織工程與干細(xì)胞研究所，四川 南充　637000)

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髂骨來(lái)源的“雙相”BMG結(jié)合軟骨細(xì)胞修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究

白亦光1，陳巧玲2，肖東琴3，劉康3，馮剛3

(川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院·南充市中心醫(yī)院，1.骨科；2.腫瘤科；3.組織工程與干細(xì)胞研究所，四川 南充637000)

目的：探討應(yīng)用髂骨來(lái)源的“雙相”骨基質(zhì)明膠(bone matrix gelatin,BMG)結(jié)合軟骨細(xì)胞移植修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損的有效性和可行性。方法：使用酶消化法體外分離培養(yǎng)并擴(kuò)增兔肋軟骨細(xì)胞；使用自體來(lái)源髂骨構(gòu)建“雙相”BMG支架材料；將軟骨細(xì)胞種植與BMG支架材料上構(gòu)建成為細(xì)胞-BMG復(fù)合物；將制作好的27只軟骨缺損動(dòng)物模型隨機(jī)分為3組。將細(xì)胞-BMG復(fù)合物移植于軟骨缺損模型進(jìn)行修復(fù)治療作為實(shí)驗(yàn)組。將BMG支架移植入軟骨缺損模型作為材料組；空白對(duì)照組不做處理。分別在術(shù)后4周、8周和12周通過(guò)大體形態(tài)學(xué)(依據(jù)國(guó)際軟骨修復(fù)協(xié)會(huì)評(píng)分量表)、病理組織學(xué)染色及免疫組織化學(xué)染色方法對(duì)各組修復(fù)效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果：番紅O染色，甲苯胺藍(lán)染色和Collagen II 免疫組化染色分別提示術(shù)后12周時(shí)實(shí)驗(yàn)組的修復(fù)組織非常類似于正常關(guān)節(jié)軟骨，組織表面與正常軟骨組織平面幾乎持平，材料組軟骨缺損處得到了部分修復(fù)，而缺損組的修復(fù)效果較差。按照ICRS量表，大體形態(tài)學(xué)和病理組織學(xué)評(píng)分結(jié)果提示：術(shù)后12周實(shí)驗(yàn)組的修復(fù)效果與其他兩組相比有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。結(jié)論：自體髂骨來(lái)源的“雙相”BMG結(jié)合軟骨細(xì)胞在體內(nèi)可形成具有一定結(jié)構(gòu)功能的軟骨組織，能夠應(yīng)用于再生修復(fù)軟骨的缺損。

軟骨細(xì)胞；BMG支架材料；軟骨修復(fù)；組織工程

關(guān)節(jié)軟骨是一個(gè)具有彈性光滑表面，提供結(jié)構(gòu)支撐和執(zhí)行關(guān)節(jié)承載與活動(dòng)功能的無(wú)血管組織，在關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)中具有降低磨損和緩沖震蕩的作用[1]。 膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎是一類具有高發(fā)病率疾病，是引起中老年人膝關(guān)節(jié)疼痛的最主要病因，隨著年齡的增長(zhǎng)，其自我修復(fù)能力逐漸減弱。目前臨床上對(duì)骨性關(guān)節(jié)炎的治療主要分為非手術(shù)保守治療(藥物和物理治療)和外科手術(shù)治療(膝關(guān)節(jié)置換術(shù)等)[2-3]。保守治療措施主要有使用非甾體抗炎藥、營(yíng)養(yǎng)軟骨藥和關(guān)節(jié)腔注射玻璃酸鈉注射液，其目的主要是緩解臨床癥狀，卻不能逆轉(zhuǎn)已經(jīng)發(fā)生退行性變的關(guān)節(jié)軟骨和細(xì)胞的生物學(xué)功能，且只在關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生退行性變的早期有效；同樣現(xiàn)有的外科手術(shù)治療手段主要有置換人工金屬材質(zhì)關(guān)節(jié)，以達(dá)到緩解癥狀和維持關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)功能和穩(wěn)定性的效果，數(shù)年以后仍需要進(jìn)行關(guān)節(jié)返修等手術(shù)等[4]。因此，繼續(xù)深入研究關(guān)節(jié)退行性變疾病的有效治療手段具有十分重要的意義。

組織工程軟骨構(gòu)建主要涉及種子細(xì)胞及具有軟骨細(xì)胞生存的三維結(jié)構(gòu)微環(huán)境能力的材料支架構(gòu)成。選擇一種合適的生物支架材料顯得尤為重要。本實(shí)驗(yàn)擬采用自體髂骨來(lái)源的“雙相”骨基質(zhì)明膠(bone matrix gelatin,BMG)三維支架作為組織工程材料并結(jié)合軟骨細(xì)胞對(duì)兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損模型進(jìn)行修復(fù)，以期取得良好的修復(fù)效果。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)與增殖將5月齡新西蘭兔肋軟骨無(wú)菌分離，剪成1 mm3大小碎片，使用等體積0.1%Ⅱ型膠原酶消化后，放于37 ℃恒溫水浴8 h(4 h后替換一次膠原酶)。取10% FBS的DMEM培養(yǎng)基加入離心管稀釋，離心，棄上清，最后將沉淀移入T75細(xì)胞瓶中，加20% FBS的DMEM培養(yǎng)基10 mL于瓶?jī)?nèi)，靜置于5% CO2，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。將軟骨細(xì)胞原代培養(yǎng)并增殖到所需的數(shù)量級(jí)[5]。

1.2.2“雙相”BMG材料的制備將新西蘭兔耳緣靜脈3%戊巴比妥鈉l mL/kg麻醉后俯臥位固定于手術(shù)臺(tái)，骼骨處預(yù)先脫毛，常規(guī)碘伏消毒鋪巾，切開(kāi)皮膚約3 cm，顯露骼骨；用骨刀及外科剪剪取骼骨以保持松質(zhì)骨與皮質(zhì)骨的“雙相”結(jié)構(gòu)。將骼骨標(biāo)本4 ℃下浸泡于0.9% NH4CL中24 h；水洗后使用氯仿及甲醇按體積比1∶1比例混合浸泡骼骨標(biāo)本1.5 h(脫脂)；4 ℃下浸泡于0.6 mol/L HCL下7 h進(jìn)行脫鈣，至骼骨標(biāo)本變軟且具有彈性；蒸餾水清洗5次；再次使用體積比1∶1氯仿甲醇混合液脫脂過(guò)夜；依次使用2 mol/L氯化鈣浸泡1 h、0.5 mol/L乙二氨四乙酸浸泡1 h、4 mol/L氯化鋰浸泡1 h； 55 ℃蒸餾水水浴24 h；37 ℃下DMEM培養(yǎng)液浸泡1 h；得到BMG材料。將得到的BMG修剪成高3 mm×3 mm×5 mm的圓柱狀，注意保持BMG材料的“雙相”性，即一側(cè)為松質(zhì)骨，一側(cè)為皮質(zhì)骨，風(fēng)干后電鏡下觀察孔隙率，環(huán)氧乙烷滅菌后-80 ℃保存[6]。

1.2.3BMG-軟骨細(xì)胞復(fù)合物的制備將BMG材料復(fù)溫，放入96孔板，將軟骨細(xì)胞濃度調(diào)整為1×107/mL，去1 mL滴加在BMG材料上，靜置于5% CO2，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，使用時(shí)直接移植即可。

1.2.4 動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)取10月齡新西蘭白兔27只(川北醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，雌雄不限，體重2.5～3.0 kg。10月齡兔隨機(jī)分為3組，分別命名為缺損組、材料組和BMG-軟骨細(xì)胞組。耳緣靜脈注射麻醉后，常規(guī)備皮、消毒、鋪巾；取雙膝外側(cè)切口，切口長(zhǎng)度1 cm；逐層打開(kāi)皮膚、滑膜層、關(guān)節(jié)囊；推開(kāi)髕骨及髕骨旁脂肪墊；屈曲膝關(guān)節(jié)；于髕骨溝處用電鉆開(kāi) 3 mm×3 mm大小的軟骨缺損，深度保持在5 mm左右。其中缺損組直接復(fù)位髕骨，逐層縫合切口。材料組僅移植BMG材料，注意確保松質(zhì)骨面向上，皮質(zhì)骨面向下，逐層縫合切口。BMG-軟骨細(xì)胞組將培養(yǎng)箱中的BMG-軟骨細(xì)胞復(fù)合物完整植入，逐層縫合切口。術(shù)后3 d使用青霉素肌肉注射預(yù)防感染。

1.2檢測(cè)指標(biāo)

1.2.1大體觀察術(shù)后4、8、12 周時(shí)段處死動(dòng)物，游離股骨遠(yuǎn)端肉眼觀察關(guān)節(jié)修復(fù)組織色澤、修復(fù)組織面積、厚度及其與周圍組織有無(wú)粘連等情況。根據(jù)以往國(guó)際軟骨修復(fù)協(xié)會(huì)(ICRS)量表進(jìn)行評(píng)分[7]。

1.2.2番紅O染色10%多聚甲醛固定標(biāo)本，脫鈣兩周，矢狀位切開(kāi)遠(yuǎn)端股骨標(biāo)本，石蠟包埋，切片(厚5 μm)，二甲苯酒精脫蠟至水；蘇木素染10 min；0.2%亮綠染色10 min；0.1%番紅O染色10 min；1%醋酸酒精分化液3 s，樹(shù)脂封片后鏡下觀察[8]。

1.2.3甲苯胺藍(lán)染將切片60 ℃烘烤過(guò)夜；蒸餾水水洗3次，每次5 min；二甲苯酒精脫蠟至水；1%甲苯胺藍(lán)染色4 h(保持室溫25 ℃，必要時(shí)可使用酒精燈烘烤)，蒸餾水水洗3次后封片，鏡下觀察[8]。

1.2.4Ⅱ型膠原免疫組化染色將切片60 ℃烘烤過(guò)夜；二甲苯酒精脫蠟至水；2%牛透明質(zhì)酸酶封閉30 min；3%過(guò)氧化氫封閉10 min(避光)；Ⅱ型膠原一抗(鼠抗兔)封閉4 ℃過(guò)夜; Ⅱ型膠原二抗(羊抗鼠)封閉1 h(保持室溫25 ℃)；DAB顯色；樹(shù)脂封片后倒置顯微鏡下觀察并采集圖像[8]。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示, 組間比較采用方差分析，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1軟骨細(xì)胞體外分離培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)觀察

組織培養(yǎng)7 d后可見(jiàn)少量細(xì)胞爬出，貼壁后的細(xì)胞外觀呈多角形、圓形或橢圓形，胞質(zhì)豐富。14 d后在培養(yǎng)瓶中呈現(xiàn)典型鋪路石樣表現(xiàn)，如圖1所示。

2.2“雙相”BMG材料肉眼及電鏡下觀察

BMG材料修剪為3 mm×3 mm×5 mm大小圓柱狀，肉眼觀察如圖2A所示；電鏡下觀察BMG材料松質(zhì)骨一側(cè)表面顯示布滿孔穴、內(nèi)部多孔隙,為種子細(xì)胞的生長(zhǎng)提供了良好的外部環(huán)境，松質(zhì)骨面孔隙大小100～800 μm,如圖2所示。

2.3關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)效果組織學(xué)評(píng)價(jià)

番紅O染色提示：在術(shù)后12 周，3組正常軟骨層均顯示大量紅染，表明正常軟骨組織表面含有大量蛋白多糖，其中缺損組的修復(fù)情況較差，缺損部位平面明顯低于正常軟骨組織，基底部雜亂無(wú)章，可見(jiàn)少量骨組織及纖維軟骨組織增生，未見(jiàn)明顯的軟骨層及軟骨陷凹形成；材料組修復(fù)部位平面明顯低于正常軟骨組織，BMG材料表面紅染，可見(jiàn)材料支架未被明顯降解吸收，但表面未見(jiàn)明顯軟骨層形成；實(shí)驗(yàn)組可見(jiàn)修復(fù)的組織表面與正常軟骨組織平面幾乎持平，表面含有大量蛋白多糖，紅染明顯。形成明顯軟骨層，軟骨層下可見(jiàn)明顯軟骨陷凹，修復(fù)效果明顯(如圖3所示)。

甲苯胺藍(lán)染色提示：在術(shù)后12 周，3組正常軟骨層均顯示大量藍(lán)染，缺損組缺損部位組織甲苯胺藍(lán)染色不明顯，內(nèi)部呈現(xiàn)骨性或纖維性組織修復(fù)；材料組修復(fù)部位可見(jiàn)基質(zhì)甲苯胺藍(lán)染色較淡，呈現(xiàn)條索狀支架，細(xì)胞外基質(zhì)淡染，修復(fù)效果不佳；實(shí)驗(yàn)組術(shù)后修復(fù)部位明顯填充，細(xì)胞外基質(zhì)藍(lán)染明顯，形成完整的軟骨表面，與正常軟骨層幾乎看不到明顯差別，修復(fù)效果明顯(如圖3所示)。

Collagen II 免疫組化染色提示：在術(shù)后12 周，三組正常軟骨層均顯示大量黃染，缺損組術(shù)后缺損部位CollagenII 免疫組化染色不明顯，基底部未見(jiàn)明顯Collagen II分泌；材料組術(shù)后修復(fù)組織中黃染較淡，細(xì)胞外基質(zhì)淡染，說(shuō)明CollagenII 少量分泌，修復(fù)組織內(nèi)部多為纖維性組織修復(fù)。實(shí)驗(yàn)組術(shù)后修復(fù)組織內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)為陽(yáng)性, 新生組織分泌大量 Collagen II，與正常軟骨層表面相似，修復(fù)效果明顯(如圖3所示)。

2.4ICRS量表評(píng)分

按照ICRS量表，術(shù)后將股骨遠(yuǎn)端游離后肉眼觀察修復(fù)效果進(jìn)行評(píng)分，各時(shí)間點(diǎn)各組間比較如圖4所示，術(shù)后12周缺損組得分5.2±0.5；材料組得分5.9±1.2；實(shí)驗(yàn)組得分9.5±1.5，與其他兩組相比有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。將病理組織學(xué)觀察修復(fù)效果進(jìn)行評(píng)分，各時(shí)間點(diǎn)各組間比較如圖5所示，術(shù)后12周缺損組得分17.2±1.5；材料組得分9.8±0.5；實(shí)驗(yàn)組得分9.7±1.2，與其他兩組相比有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

由此可見(jiàn)，實(shí)驗(yàn)組在術(shù)后12周，修復(fù)效果明顯強(qiáng)缺損組和材料組。

*P<0.05，與對(duì)照組和材料組相比。

*P<0.05，與對(duì)照組和材料組相比。

3　討論

各種針對(duì)軟骨損傷修復(fù)的治療方法正在積極的探索研究當(dāng)中。目前治療方法有很多，主要包括：自體軟骨細(xì)胞移植，骨膜及軟骨移植或者微骨折外科手術(shù)等。自體軟骨細(xì)胞移植據(jù)報(bào)道臨床軟骨修復(fù)效果較滿意，但軟骨細(xì)胞來(lái)源非常有限，并且體外培養(yǎng)增殖能力差，細(xì)胞容易衰老或纖維樣分化，在進(jìn)行移植過(guò)程中，細(xì)胞懸液無(wú)法在缺損處良好固定，常常發(fā)生滲漏導(dǎo)致種子細(xì)胞的浪費(fèi)以及周圍軟組織的骨化；骨膜及軟骨移植治療軟骨損傷存在匹配困難、移植物易退變等缺陷，微骨折外科手術(shù)可在短期內(nèi)緩解關(guān)節(jié)的疼痛癥狀，但其破壞了關(guān)節(jié)軟骨的微環(huán)境，從而導(dǎo)致軟骨纖維化修復(fù)，遠(yuǎn)期效果差，甚至導(dǎo)致嚴(yán)重的并發(fā)癥[9]。

本實(shí)驗(yàn)從組織工程角度為關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)提供了另一個(gè)方法，其原理主要是將種子細(xì)胞與生物材料之間綜合應(yīng)用，在體外構(gòu)建有生物活力的組織工程軟骨體，然后植入修復(fù)組織缺損處，達(dá)到組織或器官功能的恢復(fù)。這種組織工程軟骨體與自體軟骨移植的區(qū)別在于種子細(xì)胞可以在體內(nèi)良好的增殖并分泌新的有效的Ⅱ型膠原和蛋白多糖等軟骨細(xì)胞外基質(zhì)，而自體軟骨移植后，其內(nèi)分化成熟的軟骨細(xì)胞無(wú)法分泌新的有效的軟骨細(xì)胞外基質(zhì)，而軟骨組織又是一種缺乏血供的組織，無(wú)法進(jìn)行自我修復(fù)，故而移植后易發(fā)生退變。 對(duì)軟骨修復(fù)結(jié)果的病理評(píng)價(jià)方法，采用大體觀察以及組織病理學(xué)觀察兩種方式，并分別采用ICRS公認(rèn)的量表法進(jìn)行評(píng)分，組織病理學(xué)觀察采用番紅O染色、甲苯胺藍(lán)染色及Collagen II 免疫組化染色來(lái)檢測(cè)，其中番紅O和甲苯胺藍(lán)對(duì)軟骨組織內(nèi)的糖胺聚糖十分敏感，相互之間形成佐證。Collagen II是軟骨組織重要的細(xì)胞外基質(zhì)，對(duì)其表達(dá)量的檢測(cè)也十分重要。

本實(shí)驗(yàn)中，術(shù)后12周實(shí)驗(yàn)組的軟骨缺損修復(fù)效果較其他兩組十分滿意，表明BMG作為支架材料是非常合適的，由于“雙相”支架材料BMG的另一面為骨皮質(zhì)，在與缺損處基底部的骨質(zhì)相融合生長(zhǎng)的過(guò)程中，可以彌補(bǔ)其他材料在修復(fù)表面的機(jī)械強(qiáng)度不夠這一缺點(diǎn)，但具體強(qiáng)度指標(biāo)未得到進(jìn)一步的證實(shí)，這將是下一步實(shí)驗(yàn)需要完善的方向。

種子細(xì)胞是組織工程中的重要一個(gè)環(huán)節(jié)，實(shí)驗(yàn)所使用的種子細(xì)胞是成熟的類軟骨細(xì)胞，有學(xué)者在使用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及脂肪干細(xì)胞對(duì)軟骨缺損進(jìn)行移植也取得了良好的修復(fù)效果[10]，在今后的實(shí)驗(yàn)中，我們可以將使用上述干細(xì)胞與分化成熟的軟骨細(xì)胞進(jìn)行修復(fù)效果的比較，試圖尋求一種更為有效的種子細(xì)胞選擇。

軟骨組織工程研究仍處于動(dòng)物體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)階段，距離臨床安全有效的應(yīng)用尚有一段距離。但是隨著對(duì)組織工程軟骨在種子細(xì)胞來(lái)源，支架的特性及細(xì)胞與支架的構(gòu)建等一系列問(wèn)題研究的不斷深入,組織工程軟骨的臨床應(yīng)用前景必將受到了更加廣泛的關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)使用BMG材料構(gòu)建組織工程軟骨對(duì)缺損的關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行了結(jié)構(gòu)和功能上的修復(fù)，為今后組織工程軟骨的臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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(學(xué)術(shù)編輯：馮剛)

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Experimental study on the repairment for articular cartilage defects of rabbit with “bipolar” bone matrix gelatin combined with chondrocytes

BAI Yi-guang1,CHEN Qiao-ling2,XIAO Dong-qin3,LIU Kang3,FENG Gang3

(NanchongCentralHospital,TheSecondClinicalCollegeofNorthSichuanMedicalCollege,1.OrthopaedicDepartment;2.OncologyDepartment;3.ResearchInstituteofTissueEngineeringandStemCell,Nanchong637000,Sichuan,China)

Objective：To study the effectiveness and feasibility of the “bipolar” BMG which come from ilium combined with chondrocytes transplanted to repair articular cartilage defects.Methods：Culture the primary rabbit cartilage cells with the enzyme digestion method in vitro. Construct “bipolar” BMG scaffold material with the autogenous iliac.Construct cells-BMG composites with the cartilage cells and BMG scaffold material.The 27 cartilage defect animal models were randomly divided into three groups.The cells-BMG composite was transplanted to repair cartilage defect model as experimental group.The BMG scaffold material transplanted to repair cartilage defect model as materials control group.The defect model was without any treatment as blank control group.The repair effect was evaluated by gross morphology (according to the ICRS rating scale),pathological histology staining and immunohistochemical staining method at 4 weeks,8 weeks and 12 weeks respectively.Results：Safranin O,toluidine blue and collagen II immunohistochemical staining demonstrate that regenerate tissue of experimental group was similar with normal cartilage，and the surface of regenerate tissue and normal cartilage tissue were almost flat at 12 weeks after surgery. However,the defects in materials control group had been repaired partly and the repair effect of blank control group was very poor.According to the ICRS rating scale，the repair effect scores of gross morphology and pathologic histology showed that the scores of experimental group were significant higher than the other two groups at 12 weeks after surgery (P<0.05).Conclusion：“Bipolar” BMG combined with cartilage cells can form cartilage tissue in vivo which possess a certain structure function.The tissue engineering cartilage can be used in regenerative repair of cartilage defects.

Cartilage cells；BMG scaffold material；Cartilage repair；Tissue engineering

10.3969/j.issn.1005-3697.2016.05.08

國(guó)家自然科學(xué)基金(81171472、81071270、30872614)；四川省教育廳資助項(xiàng)目(15ZA0216、15ZB0201)；南充市科技局科技支撐項(xiàng)目(14A0017、14A0022)；川北醫(yī)學(xué)院科研發(fā)展計(jì)劃(CBY14-A-ZD02)；四川省衛(wèi)計(jì)委科研項(xiàng)目(16PJ202)

2015-10-26

白亦光(1986-)，男，碩士，住院醫(yī)師。E-mail:baiyiguang@163.com

馮剛，E-mail:lssmd18@gmail.com

時(shí)間：2016-10-2511∶31

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20161014.1716.016.html

1005-3697(2016)05-0652-04

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