謝俊云，姚 笛，郭 瑜，佐兆杭，張 微

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江大慶 163319）

貝達(dá)葡萄酒中酵母菌的分離鑒定

謝俊云，姚 笛，郭 瑜，佐兆杭，張 微

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江大慶 163319）

為了獲得一株葡萄酒發(fā)酵后期的主導(dǎo)菌，試驗(yàn)對(duì)貝達(dá)葡萄酒中的酵母菌進(jìn)行分離純化，經(jīng)菌落形態(tài)鑒定，并進(jìn)行酵母分離株26S rRNA的PCR擴(kuò)增，進(jìn)一步通過(guò)基因序列分析進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示，貝達(dá)葡萄酒的酵母菌菌落總數(shù)為3.4×107CFU/mL，分離的酵母菌菌株Y3，Y5，Y13均為釀酒酵母。因此，貝達(dá)葡萄酒發(fā)酵后期的優(yōu)勢(shì)菌即為釀酒酵母。

貝達(dá)葡萄酒；酵母菌；鑒定

葡萄酒是目前世界上產(chǎn)量最大、普及最廣的單糖釀造酒，是用葡萄果實(shí)或葡萄汁經(jīng)過(guò)發(fā)酵釀制而成的酒精飲料［1］。葡萄酒具有養(yǎng)顏?zhàn)o(hù)膚、抗癌、抗衰老、抗輻射等功效，能夠增進(jìn)食欲、消除疲勞［2］。葡萄酒的發(fā)酵是多個(gè)酵母菌種及菌株互作生長(zhǎng)和發(fā)展變化的復(fù)雜體系［3］。在葡萄酒發(fā)酵過(guò)程中，酵母菌的種群構(gòu)成及變化對(duì)葡萄酒的風(fēng)味和品質(zhì)有重要影響，尤其是天然酵母的存在，對(duì)葡萄酒特色的形成極為重要。一般情況下，在自然發(fā)酵過(guò)程中，畢赤酵母屬、假絲酵母屬、梅奇酵母屬等酵母菌可啟動(dòng)發(fā)酵，并在發(fā)酵中期逐步死亡和減少。釀酒酵母使發(fā)酵繼續(xù)，直至完成［4］。

利用發(fā)酵中后期的優(yōu)勢(shì)菌作為菌種，發(fā)酵生產(chǎn)葡萄酒已成為葡萄酒生產(chǎn)的關(guān)鍵步驟。因此，篩選和鑒定葡萄酒發(fā)酵中后期的主導(dǎo)菌對(duì)于葡萄酒的生產(chǎn)具有重要意義。所以，尋找能夠適應(yīng)當(dāng)?shù)仄咸言咸匦裕矣欣谛纬傻赜蚱咸丫骑L(fēng)格的新酵母菌株已成為研究的焦點(diǎn)［5-6］。目前，序列的同源性分析已被廣泛用于酵母種屬水平的鑒定等［7］。本研究擬對(duì)大慶市葡萄產(chǎn)區(qū)的貝達(dá)葡萄酒中的酵母菌進(jìn)行分離純化，并運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)酵母分離株進(jìn)行鑒定，鑒定出的酵母分離株旨在為葡萄酒生產(chǎn)菌種資源的進(jìn)一步利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 原料

貝達(dá)葡萄酒，由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品加工實(shí)驗(yàn)室自釀。

1.1.2 主要試劑和培養(yǎng)基

纖維素酶、溶菌酶、瓊脂糖、膠回收試劑盒、dNTP和TaqDNA聚合酶，購(gòu)自大連Takara公司；YPD瓊脂培養(yǎng)基、麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基等，青島海博公司產(chǎn)品；氯化鈉、飽和酚、乙醇、氯仿、異戊醇、異丙醇、EDTA和Tris等，均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 引物

根據(jù)Genebank發(fā)表的酵母菌26S rRNA基因序列，利用Primer 5設(shè)計(jì)引物，引物序列如下，F(xiàn):5'-G GCTTTAAGTGAGTTGATTG-3'，R:5'-TTGCCAGCATC CTTGACTTA-3'，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.1.4 培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基按照說(shuō)明書(shū)配制，121℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.1.5 主要儀器與設(shè)備

EDC-810型PCR擴(kuò)增儀，東勝創(chuàng)新生物科技有限公司產(chǎn)品；JY04S型凝膠成像系統(tǒng)，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司產(chǎn)品；XD-30A型生物顯微鏡，寧波舜宇儀器有限公司產(chǎn)品；DRP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)品；YX-280D型壓力蒸汽滅菌器，合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司產(chǎn)品；NW10UF型水純化系統(tǒng)，HealForce產(chǎn)品；TGL-16B型離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠制造產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 葡萄酒中酵母菌總數(shù)的測(cè)定

YPD培養(yǎng)基冷卻至50～60℃時(shí)，加入青霉素G鈉和鏈霉素溶液，以防細(xì)菌的生長(zhǎng)。取25 mL葡萄酒樣品于含225 mL無(wú)菌生理鹽水的三角瓶中，然后將葡萄酒樣品進(jìn)行10倍系列稀釋，取1×10-4～1× 10-6的樣品液1 mL傾注接種，傾入YPD培養(yǎng)基，每個(gè)稀釋度做2個(gè)平行，待凝固后28℃培養(yǎng)5 d后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.2.2 葡萄酒中酵母菌的分離

取上述葡萄酒樣品的稀釋液于滅菌平皿中，傾入YPD培養(yǎng)基，置28℃下恒溫箱中培養(yǎng)，每24 h觀察1次，對(duì)培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的疑似酵母菌菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，鏡檢為純種后接入YPD固體培養(yǎng)基斜面，于4℃下低溫保存。生長(zhǎng)的酵母菌菌種用阿拉伯?dāng)?shù)字Y1，Y2，Y3，Y4……依次編號(hào)。

1.2.3 酵母菌分離株的形態(tài)學(xué)鑒定

對(duì)純化培養(yǎng)的酵母菌單菌落進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，然后取分離得到的單菌落進(jìn)行染色，酵母菌采用番紅進(jìn)行染色。在載玻片上滴1滴蒸餾水，用接種環(huán)取一環(huán)菌體，均勻涂布于載玻片上，用火焰進(jìn)行干燥固定，番紅染色1～2 min，經(jīng)水洗、干燥，顯微鏡觀察微生物個(gè)體形態(tài)。

1.2.4 酵母菌分離株的分子鑒定

（1）葡萄酒中酵母菌分離株的DNA提取。葡萄酒中酵母菌基因組DNA的提取，按《分子生物學(xué)手冊(cè)》中常規(guī)方法的改進(jìn)方法進(jìn)行。

具體如下：取葡萄酒中酵母分離株的單個(gè)菌落接入YPD液體培養(yǎng)基中，以轉(zhuǎn)速200 r/min，溫度28℃培養(yǎng)過(guò)夜，取適量菌體，加入少量DNA提取緩沖液（100 mmol/L EDTA，100 mmol/L Tris，1.5 mol/L NaCl，pH值8.0） 于1.5 mL離心管中，加入纖維素酶和溶菌酶（終質(zhì)量濃度分別為6，1 mg/mL），混合均勻后于37℃下水浴1.5～2 h。加入20%SDS100 μL，于65℃下水浴30～60 min，以轉(zhuǎn)速12 000 r/min離心10 min。取上清液加入等體積酚、氯仿和異戊醇混合液（體積比為25∶24∶1）并混勻，以轉(zhuǎn)速12 000 r/min離心10 min。取上清液并加入0.6倍體積的異丙醇，顛倒混勻，-20℃放置20 min，以轉(zhuǎn)速12 000 r/min離心10 min。棄上清液，用70%乙醇洗滌，以轉(zhuǎn)速12 000 r/min離心10 min。干燥后用50 μL ddH2O溶解，DNA樣品于-20℃下保存。

（2）26S rRNA基因的PCR擴(kuò)增。以26S rRNA的F，R引物擴(kuò)增提取的葡萄酒中酵母分離株的基因組DNA，PCR反應(yīng)體系為10×2.5 μL，dNTP 2.0 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，Taq酶0.2 μL，加ddH2O至25 μL。PCR擴(kuò)增條件為94℃5 min，94℃45 s，54℃50 s，72℃60 s，做30個(gè)循環(huán)，于72℃下延伸10 min，PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。

（3）目的片段的回收與純化。PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠（EB）染色。紫外燈下分別切下含有目的片段的凝膠塊，置于1.5 mL EP管中。利用DNA純化回收試劑盒對(duì)目的片段進(jìn)行回收和純化，具體方法按照操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

（4）26S rRNA基因的序列分析。將已純化的PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序，得到菌株P(guān)CR擴(kuò)增片段的基因序列。在GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源序列搜索（BLAST search），比較分離株與已知微生物相應(yīng)序列的同源性，確定分離株的分屬。

2 結(jié)果與分析

2.1 貝達(dá)葡萄酒中酵母菌的計(jì)數(shù)

對(duì)貝達(dá)葡萄酒樣品進(jìn)行酵母菌的菌落總數(shù)測(cè)定，測(cè)得的酵母菌菌落總數(shù)為3.4×107CFU/mL。

2.2 酵母菌的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

酵母菌的菌落特征為圓形、大而厚，菌落表面光滑、濕潤(rùn)、黏稠，與培養(yǎng)基結(jié)合不緊密，容易挑起，菌落質(zhì)地均勻，正反面和邊緣、中央部位的顏色都很均一，菌落為乳白色。

分離株Y3的菌落形態(tài)見(jiàn)圖1，分離株Y3的鏡檢形態(tài)見(jiàn)圖2。

圖1 分離株Y3的菌落形態(tài)

酵母菌細(xì)胞呈球形、橢圓形，生殖方式為芽殖，無(wú)假菌絲，無(wú)色素；其他酵母菌分離株的菌落形態(tài)和鏡檢形態(tài)均與Y3相似。

圖2 分離株Y3的鏡檢形態(tài)

2.3 葡萄酒中酵母菌的PCR擴(kuò)增結(jié)果

對(duì)分離的3株酵母菌Y3，Y5，Y13進(jìn)行了26S rRNA基因的PCR擴(kuò)增。

酵母分離株的PCR擴(kuò)增效果見(jiàn)圖3。

圖3 酵母分離株的PCR擴(kuò)增效果

由圖3可知，獲得了與預(yù)期大小相符的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，片段大小為300～400 bp。

2.4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的回收與純化

利用DNA純化回收試劑盒對(duì)PCR擴(kuò)增片段進(jìn)行回收和純化。

酵母分離株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 酵母分離株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化結(jié)果

由圖4可知，獲得的目標(biāo)產(chǎn)物與預(yù)期大小相符，片段大小為300～400 bp，無(wú)引物二聚體。

2.5 酵母分離株的26S rRNA序列分析

對(duì)酵母分離株的26S rDNA基因序列進(jìn)行BLAST

同源性比較，代表菌株Y3的26SrRNA基因序列分析。酵母菌分離株Y3的序列分析結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 酵母菌分離株Y3的序列分析結(jié)果

由圖5可知，酵母菌分離株Y3與釀酒酵母菌株的同源性為99%以上，可將Y3鑒定為釀酒酵母；Y5和Y13的序列分析結(jié)果與Y3相同，均為釀酒酵母。因此，說(shuō)明貝達(dá)葡萄酒發(fā)酵后期的優(yōu)勢(shì)菌即為釀酒酵母。

3 結(jié)論

葡萄酒的生產(chǎn)需要微生物的參與，在此過(guò)程中發(fā)生了一系列復(fù)雜的生物化學(xué)變化，使制品具有特定的風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)。酵母是葡萄酒發(fā)酵中后期的主導(dǎo)菌。本試驗(yàn)對(duì)貝達(dá)葡萄酒中的酵母菌進(jìn)行分離純化，通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)方法對(duì)酵母分離株進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示，貝達(dá)葡萄酒的酵母菌菌落總數(shù)為3.4×107CFU/mL，分離的酵母菌菌株Y3，Y5，Y13均為釀酒酵母，因此貝達(dá)葡萄酒發(fā)酵后期的優(yōu)勢(shì)菌即為釀酒酵母。

［1］翟蘅，杜金華，管雪強(qiáng)，等.釀酒葡萄栽培及加工技術(shù) ［M］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2005：147-151.

［2］顧沛雯，張軍翔.葡萄酒酵母檢測(cè)方法研究 ［J］.葡萄釀酒，2005（3）：38-40.

［3］蘇龍，劉樹(shù)文，何玲，等.東北山葡萄酒自然發(fā)酵酵母菌群的研究 ［J］.食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2007，26（3）：110-115.

［4］劉慧.現(xiàn)代發(fā)酵微生物試驗(yàn)技術(shù) ［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：60-67.

［5］劉小珍，張漢堯.昆明葡萄酒相關(guān)酵母菌的分離與鑒定 ［J］.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2014，42（5）：78-81.

［6］朱麗霞，李紅梅，郭東起，等.新疆慕薩萊思自然發(fā)酵過(guò)程中酵母菌表型多樣性及優(yōu)勢(shì)菌分析 ［J］.食品科學(xué)，2012，33（7）：142-147.

［7］Dlauchy D，Tornai-Lehoczki J，Peter G.Restriction enzyme analysis of PCR amplified rDNA as a taxonomic tool in yeast identification［J］.Systematic and Applied Microbiology，1999，22（3）：445-453.◇

Separation and Identification of Yeast in Beida Grape Wine

XIE Junyun，YAO Di，GUO Yu，ZUO Zhaohang，ZHANG Wei
（College of Food Science，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing，Heilongjiang 163319，China）

In order to obtain a dominant yeast strains at later stage of grape wine fermentation，isolation and purification of yeast in beida grape wine is performed and colony morphology is identified.Then PCR amplification of 26S rRNA of yeast isolates is conducted，further identification by gene sequence analysis.Results show that yeast colony number in beida grape wine is 3.4×107CFU/mL，the yeast isolated strains Y3，Y5，Y13 are saccharomyces cerevisiae.Therefore，the advantage yeast in grape wine later fermentation is saccharomyces cerevisiae.

beida grape wine；yeast；identification

TS262.61

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.01.006

2015-11-12

謝俊云（1993— ），男，本科，研究方向?yàn)槭称芳庸ぁ?/p>