孔 宇，韓 冉，王汝華，陳 文，劉常金

（天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457）

酶法制備多肽-Fe的體內(nèi)抗氧化功能研究

孔 宇，韓 冉，王汝華，陳 文，*劉常金

（天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457）

研究了豬血血紅蛋白經(jīng)酶解制備的多肽-Fe對(duì)小鼠體內(nèi)抗氧化作用，分別測(cè)定血清中的ALT，AST，肝臟中的GSH-Px，蛋白質(zhì)，SOD，MDA。結(jié)果表明，多肽-Fe可以降低由于肝臟損傷而引起的血清中AST和ALT含量的升高，同時(shí)可抑制肝臟中GSH-Px活力降低，很好地抑制小鼠肝組織中MDA的形成及肝損傷后SOD代償性升高。HE染色結(jié)果表明，多肽-Fe可在一定程度上改善CCl4造成的肝損傷。

豬血血紅蛋白；多肽-Fe；體內(nèi)抗氧化

0 引言

2014年我國(guó)豬肉產(chǎn)量達(dá)5 671×108t［1］，是全球產(chǎn)量最高的國(guó)家，同時(shí)我國(guó)也是世界上豬肉銷量最大的國(guó)家。豬肉生產(chǎn)過程中會(huì)產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物，2014年我國(guó)因屠宰而產(chǎn)生的豬血為184×108t［2］。豬血中富含豐富的蛋白質(zhì)、微量元素，并且它的脂肪和糖含量并不高，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。作為食品工業(yè)副產(chǎn)物［3］，由于生產(chǎn)條件限制，我國(guó)在豬血開發(fā)利用方面形式比較單一［4］。酶法制備多肽-Fe，對(duì)豬血進(jìn)行加工，既可以使血液得到充分利用，又可提高產(chǎn)品的附加值，減少因豬血廢棄而對(duì)環(huán)境帶來的污染。本試驗(yàn)通過在新鮮豬血中添加一定量的胰蛋白酶，對(duì)豬血中的血紅蛋白進(jìn)行酶解，將得到的酶解物進(jìn)行分離、提純，得到所需多肽-Fe。對(duì)得到的多肽-Fe進(jìn)行體內(nèi)抗氧化性研究試驗(yàn)，結(jié)果表明豬血經(jīng)過酶解制備的多肽-Fe具有較好的體內(nèi)抗氧化性，為酶法制備多肽-Fe提供了一定的理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料及處理

將采集到的新鮮豬血中添加適量檸檬酸鈉抗凝。將處理后的血液離心，轉(zhuǎn)速為4 000 r/min，棄去上清液，沉淀即為血紅細(xì)胞。將得到的血紅細(xì)胞溶于一定體積的蒸餾水中，在磁力攪拌器中攪拌30 min，使細(xì)胞混合均勻，之后對(duì)血紅細(xì)胞進(jìn)行離心，轉(zhuǎn)速為4 000 r/min，離心時(shí)長(zhǎng)20 min，取上層清液。將上層清液置于60℃搖床中進(jìn)行避光加熱，加熱時(shí)長(zhǎng)30 min，將所得溶液于轉(zhuǎn)速3 000 r/min下離心15 min，取上層清液，得到純度較高的血紅蛋白。將得到的血紅蛋白溶液置于搖床中，于95℃下加熱15 min，使血紅蛋白變性。其中，胰蛋白酶添加量為1%，血紅細(xì)胞與蒸餾水的配比為1∶4（V∶V），酶解溫度為50℃，溶液的pH值為8，經(jīng)過5 h的酶解，將得到的溶液用4 mol/L氫氧化鈉調(diào)pH值為6～7進(jìn)行沉淀，沉淀收集凍干即為所制備多肽-Fe。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

昆明種小白鼠，清潔級(jí)動(dòng)物，6～8周，同批試驗(yàn)選用同一性別小鼠，體質(zhì)量20～22g，由中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院試驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK-（軍）2002-001。

1.3 試劑

豬血，天津市文詳屠宰場(chǎng)提供；CCl4，天津江天化工技術(shù)有限公司提供；胰蛋白酶，諾維信（中國(guó)）生物技術(shù)有限公司提供；考馬斯亮藍(lán)G-250，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)制劑有限公司提供；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）試劑盒，上海超研生物科技有限公司提供；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px） 試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒，南京建成生物工程中心提供。

1.4 試驗(yàn)儀器

ESJ205-4型電子天平、TGL-16B型臺(tái)式離心機(jī)、電熱恒溫水浴鍋、SP-2102UV型紫外可見分光光度計(jì)、pH自動(dòng)滴定儀、JR-2型集熱式磁力加熱攪拌器、Nikon 90i型顯微鏡。

1.5 方法

1.5.1 CCl4急性肝損傷模型的建立

選用30只雌性小白鼠并隨機(jī)分成3組，分別為正常組、模型組和給藥組。給藥組每天灌胃1.071 kg的多肽-Fe溶液（溶于生理鹽水中）；正常組和模型組灌胃等量的生理鹽水。灌胃8周后，模型組及給藥組腹腔分3 d注射0.2%CCl4（四氯化碳）食用油溶液0.1 mL/10g，正常組給植物油，給藥組繼續(xù)給予受試物至試驗(yàn)結(jié)束（與CCl4灌胃間隔 4 h以上）。

1.5.2 取樣

末次注射后，禁食16～20 h。對(duì)小鼠進(jìn)行眼球取血并分離血清，測(cè)各項(xiàng)血液生化指標(biāo)。摘取肝臟，用0.9%生理鹽水沖洗血跡，用濾紙吸取多余水分，將收集到的肝臟分為2部分，其中一部分冷凍后制成肝勻漿，測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)；另一部分用10%甲醛固定進(jìn)行病理組織學(xué)光學(xué)鏡觀察。

1.5.3 生化指標(biāo)測(cè)定

谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）活性測(cè)定：測(cè)定方法參見文獻(xiàn)［5］；谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）活性測(cè)定：測(cè)定方法參見文獻(xiàn)［5］；谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性測(cè)定：測(cè)定方法參見文獻(xiàn)［5］；蛋白含量測(cè)定：考馬斯亮藍(lán)法；超氧化物歧化酶（SOD）活性測(cè)定：黃嘌呤氧化酶法［6］；丙二醛（MDA）含量的測(cè)定：TBA法［6］。

1.5.4 肝臟形態(tài)學(xué)觀察

采用HE染色法。

肝臟剪碎成小塊，用0.9%生理鹽水洗凈，甲醛固定液固定，然后進(jìn)行包埋、切片、展片、分片、撈片、烘片、HE染色、切片脫水、封片等工藝，用光學(xué)顯微鏡對(duì)制備好的切片進(jìn)行觀察［7］。

2 結(jié)果和討論

2.1 試驗(yàn)小鼠肝臟形態(tài)學(xué)觀察

小鼠肝臟形態(tài)學(xué)觀察見圖1。

圖1 小鼠肝臟形態(tài)學(xué)觀察

由圖1可知，正常組小鼠肝臟形狀飽滿、顏色鮮艷、被膜光滑、輪廓清晰；模型組小鼠肝臟顏色灰暗、肝臟腫大、表面粗糙，表面有大量出血點(diǎn)，感官質(zhì)地?zé)o彈性、易破碎；給藥組小鼠的肝臟較模型組小鼠肝臟表面的出血點(diǎn)少，且有光澤，肝小葉輪廓較清晰。通過對(duì)肝臟外觀的觀察，發(fā)現(xiàn)多肽-Fe可降低由自由基造成的肝損傷。

2.2 多肽-Fe對(duì)試驗(yàn)小鼠血清中ALT，AST的影響多肽-Fe對(duì)試驗(yàn)小鼠血清中ALT，AST的影響見表1。

表1 多肽-Fe對(duì)試驗(yàn)小鼠血清中ALT，AST的影響

由表1可知，正常組小鼠血清中ALT和AST的含量最低，食用CCl4后對(duì)小鼠肝臟造成了一定的損傷，但給藥組的ALT和AST顯著低于模型組，說明酶法制備的多肽-Fe對(duì)由自由基造成的肝損傷有一定預(yù)防作用，作用的機(jī)制可能是多肽-Fe在動(dòng)物體內(nèi)有抗氧化、消除自由基的作用。

2.3 多肽-Fe對(duì)小鼠肝臟中GSH-Px，SOD，MDA的影響

多肽-Fe對(duì)小鼠肝臟中GSH-Px，SOD，MDA的影響見表2。

由表2可知，分析小鼠肝臟中GSH-Px活力變化，可以看出給藥組肝臟中GSH-Px的活性接近正常組，高于模型組。模型組小鼠GSH-Px活性比較低，說明CCl4能破壞肝臟的氧化-抗氧化平衡，增加自由基的累積，降低GSH-Px的活性。測(cè)定小鼠肝勻漿中SOD活性，結(jié)果顯示模型組的SOD含量較其他組明顯升高（p＜0.05），給藥組SOD含量略高于正常組。這可能與肝臟受到損傷后SOD代償性升高有關(guān)，在CCl4灌胃后給藥組小鼠肝臟有損傷，但因長(zhǎng)期灌服多肽-Fe，還是起到了一定的保護(hù)作用。模型組的MDA含量顯著高于其他2組，說明CCl4對(duì)小鼠的肝臟細(xì)胞造成了較大損害。給藥組小鼠肝勻漿中MDA的含量顯著低于模型組小鼠，但略高于正常組MDA水平。表明多肽-Fe具有一定的降低細(xì)胞脂質(zhì)過氧化的能力。

表2 多肽-Fe對(duì)小鼠肝臟中GSH-Px，SOD，MDA的影響

2.4 小鼠肝臟HE染色結(jié)果

小鼠肝臟HE染色結(jié)果（200倍）見圖2。

圖2 小鼠肝臟HE染色結(jié)果（200倍）

由圖2可知，圖2（a）中小鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)完整、肝細(xì)胞分界清晰，以中央靜脈為中心向四周呈放射狀整齊排列，核位于細(xì)胞中央，核圓而清晰，胞質(zhì)豐富，說明正常組小鼠肝臟無病理異常。圖2（b）中小鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)消失，肝細(xì)胞索紊亂，大部分肝竇消失，說明模型組小鼠肝臟出現(xiàn)明顯的病理異常。圖2（c）中，給藥組小鼠肝細(xì)胞較有序地排列在中央靜脈周圍，肝細(xì)胞形態(tài)、排列均好于模型組，說明多肽-Fe對(duì)CCl4誘導(dǎo)小鼠肝損傷有一定的保護(hù)、緩解效果。

3 結(jié)論

通過CCl4急性肝損傷試驗(yàn)，證明多肽-Fe對(duì)急性肝損傷有一定的預(yù)防作用，多肽-Fe能降低由于肝損傷造成的血清中AST，ALT活力，提高肝臟中GSH-Px活力，較好地抑制小鼠肝組織中MDA的形成及肝損傷后SOD代償性升高，為酶法制備多肽-Fe提供一定的理論基礎(chǔ)。HE染色結(jié)果表明，多肽-Fe可在一定程度上改善CCL4造成的肝損傷。為酶法制備多肽-Fe提供了一定的理論支持，為我國(guó)豬血資源的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

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Studies on Antioxidant Effect in Vivo of Polypeptide-Fe from Hemoglobin by Enzymatic Hydrolysis

KONG Yu，HAN Ran，WANG Ruhua，CHEN Wen，*LIU Changjin
（College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China）

To study the antioxidant effect in vivo of Polypeptide-Fe from Hemoglobin by enzymatic hydrolysis on mice.Contents of alanine transaminase（ALT）and aspartate transaminase（AST）in serum，and enzyme activities ofglutathione peroxidase（GSH-Px）and superoxide dismutase（SOD）and malondiadehyde（MDA）and protein in liver are measured.The followings are results.Polypeptide-Fe can reduce the contents of ALT and AST which will rise after the liver damage，can inhibit thegSH-Px activity decrease，can significantly inhibit the formation of MDA in liver and the activities of SOD compensatorily increased in liver.HE dyed results show that Polypeptide-Fe has a certain improvement on liver injury.

pig blood hemoglobin；Polypeptide-Fe；antioxidant effect

TS251.93

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.04.006

1671-9646（2016）04a-0020-03

2016-01-24

孔 宇（1986— ），男，碩士，助理工程師，研究方向?yàn)榧Z油加工。

*通訊作者：劉常金（1969— ），男，博士，副教授，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程。