韋　海，劉慧霞，周文紅

（廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院，廣西　南寧　530004）

兩種典型制糖工藝過程蛋白質(zhì)含量的差異

韋海，劉慧霞，周文紅

（廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院，廣西南寧530004）

為比較碳酸法和亞硫酸法兩種典型工藝過程糖物料的蛋白質(zhì)含量差異，測定了兩種工藝各段糖物料的蛋白質(zhì)含量。試驗表明，采用考馬斯亮藍法，波長595nm，反應(yīng)時間10～30min，標準蛋白質(zhì)溶液線性關(guān)系、精密度、重現(xiàn)性、加標回收試驗表現(xiàn)良好；制糖清凈過程能除去約94%～98%的蛋白質(zhì)，碳酸法工藝蛋白質(zhì)除去率較高；后序工段的蛋白質(zhì)含量按精糖漿、粗糖漿、甲原蜜、乙原蜜依次升高，精糖漿比粗糖漿蛋白質(zhì)低約10%～30%，甲原蜜比乙原蜜低約30%～50%，碳酸法廠各相應(yīng)物料蛋白質(zhì)含量都低于亞硫酸法廠。

制糖工藝；蛋白質(zhì)；考馬斯亮藍法

0　前言

甘蔗汁中的蛋白質(zhì)對制糖過程有很大影響，蔗汁大部分的蛋白質(zhì)在澄清過程中凝結(jié)成為沉淀物，可以幫助除去其他雜質(zhì)。但殘留的蛋白質(zhì)以及分解的含氮物質(zhì)會對后續(xù)的制糖過程有多種不良影響。蔗汁蛋白質(zhì)含量與甘蔗品種和質(zhì)量有直接的關(guān)系，新鮮成熟甘蔗中約占含氮物的65%～70%，但不新鮮或未成熟甘蔗，經(jīng)受風(fēng)折、霜凍、蟲害等自然災(zāi)害甘蔗中，蛋白質(zhì)含量可降到40%～20%［1］。

蛋白質(zhì)是典型的兩性高分子物質(zhì)，甘蔗汁中蛋白質(zhì)等電點約在pH3.3～3.8［2］，制糖生產(chǎn)的清凈過程，蛋白質(zhì)與鈣離子等正電離子結(jié)合而被沉淀除去。學(xué)者M.Bennnett［3］研究了蔗汁中蛋白質(zhì)和鈣的作用，蛋白質(zhì)結(jié)合的鈣量隨汁中鈣離子濃度升高而增大，并隨pH升高而增大。蛋白質(zhì)具有很強的表面活性，在制糖過程受熱凝結(jié)可覆蓋各種憎水微粒使其凝結(jié)除去，對蔗汁起到除雜脫色的效果，對澄清是有益因子。而某些難凝結(jié)除去的蛋白質(zhì)能與多糖或者其他有機物結(jié)合，容易形成渾濁溶液［4］，是制糖過程的有害因子。學(xué)者李鮮能等［5］測定了高濃度糖物料的蛋白質(zhì)含量，粗糖漿、精糖漿、甲洗、甲原、乙原含量分別為224、183、257、336、628 mg/kg·oBx。Ermolaeva，Stansbury，Roberts等［6-8］人分析了白砂糖和精糖的酸性絮凝物，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)是其主要成分之一；學(xué)者黃凱［9］，莫佳琳［10］的研究也表明，白砂糖酸性絮凝物中的蛋白質(zhì)等含氮物占比約為21.5%～33.7%，而酸性絮凝物是影響白砂糖質(zhì)量的一個重要因素。

綜上所述可知，糖物料中蛋白質(zhì)含量的差異直接影響到造蜜因子、提糖率和產(chǎn)品質(zhì)量，而制糖過程糖物料蛋白質(zhì)含量的檢測數(shù)據(jù)尤其是碳酸法和亞硫酸法工藝過程糖物料的蛋白質(zhì)含量的差異研究仍鮮見報道。本文首先研究了考馬斯亮藍比色法測定糖物料的蛋白質(zhì)含量的可靠性，對該方法的線性關(guān)系、回收率、精密度、穩(wěn)定性等進行了考察。然后分析了碳酸法和亞硫酸各工段物料的蛋白質(zhì)含量，比較了兩種工藝段物料的蛋白質(zhì)含量差異，為蔗汁清凈和后續(xù)工藝管理的改善提供一些參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實驗原理

考馬斯亮藍比色法是由Bradford等人建立的測定微量蛋白質(zhì)的方法［11］，考馬斯亮藍所含疏水基團在酸性條件下與蛋白質(zhì)的疏水微區(qū)具有親和力，通過疏水作用與蛋白質(zhì)相結(jié)合，形成的藍色蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物，在595nm處有最大吸光度，復(fù)合物1h內(nèi)保持穩(wěn)定；在一定的蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物在595nm處的吸光度與蛋白質(zhì)含量成正比，因此可用于蛋白質(zhì)含量的測定。該方法具有快速、穩(wěn)定、靈敏度高、測量結(jié)果準確等特點。該方法最低檢出限為1μg，只添加一種試劑就可以完成測定，且干擾物少，不受鉀離子、鈉離子、鎂離子、糖和蔗糖、酚類化合物以及游離氨基酸等物質(zhì)的干擾［12-13］。此方法已被用于果汁、乳制品、野木瓜多糖等［14-16］物質(zhì)的蛋白質(zhì)含量測定，均收到了良好的效果。

1.2實驗試劑

考馬斯亮藍G250；95%乙醇；磷酸；牛血清蛋白。

1.3實驗設(shè)備

722N可見分光光度計；YP2001電子分析天平；臺式高速離心機；101-1A型數(shù)顯示電熱恒溫干燥箱；數(shù)字阿貝折光儀。

1.4溶液的配置

考馬斯亮藍G-250溶液：稱取100mg考馬斯亮藍G-250溶于50mL95%乙醇中，加入100mL85% （W/V）磷酸，將溶液用水稀釋到1000mL，用濾紙過濾，存于棕色瓶中。［試劑的終含量為：0.01%考馬斯亮藍G-250，4.7%（W/V）乙醇，和8.5%（W/V）磷酸］。

蛋白質(zhì)標準溶液：精確稱取牛血清白蛋白10.00 mg，用蒸餾水溶解并定容至100mL，即為0.1mg/mL蛋白質(zhì)標準液，保存于4℃～5℃冰箱中。

1.5待測糖液的制備

取待測糖汁用離心機離心15min（4000r/min），然后用雙層濾紙過濾，測定其錘度，備用；稱取適量備用樣（保證所測值在標曲范圍內(nèi)為準），用蒸餾水稀釋至50ml，搖勻待測。

1.6標準曲線的制作

取11只試管，編號為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10，按照表1依次加入各試劑，混勻，靜置10min，以0號試管作空白對照，測定各標準樣品在595nm下的吸光度值。結(jié)果見2.1。

表1　牛血清蛋白標準曲線的制作

1.7樣品測定

取處理好的糖液樣品各2mL，加入8mL考馬斯亮藍G-250溶液，每種樣品取3份。再取一個試管依次加入2mL樣液和8mL水，作樣品空白。以表1中0號試管試劑為空白參比液，并按上述標準曲線的測定方法分別測定其吸光度值，以3次測定的平均值作為該糖液樣品蛋白質(zhì)含量的實測值。糖液樣品蛋白質(zhì)最終含量計算公式為：

式中：C-測定吸光度對應(yīng)蛋白質(zhì)的濃度（μg/mL）；

V-定容體積（mL）；

M-移取糖液量（g）；

°Bx-糖液錘度。

2　結(jié)果與討論

2.1標準曲線回歸方程建立

以吸光度值為縱坐標，標準蛋白濃度為橫坐標作圖，得到蛋白質(zhì)標準曲線如下圖1。線性回歸方程式Y(jié)=0.0032X+0.1319，R2=0.9954，相關(guān)系數(shù)r=0.9977，表明蛋白質(zhì)含量在10～100μg/mL范圍內(nèi)很好地符合郎伯-比爾（Lamber-Beer）定律。

圖1　蛋白質(zhì)標準曲線

2.2穩(wěn)定性實驗

移取2ml同一實驗樣品溶液，加入8ml考馬斯亮藍G-250溶液，搖勻，在40分鐘內(nèi)，在595nm波長下，每隔5min測定1次，觀測其穩(wěn)定性。結(jié)果表明，顯色時間在10min到30min內(nèi)吸光度穩(wěn)定性較好，結(jié)果見下圖2。

圖2　穩(wěn)定性實驗結(jié)果

2.3精密度實驗

精密移取1mL牛血清蛋白標準溶液，連續(xù)6次測定其吸光度，經(jīng)結(jié)果計算得RSD=0.225%，小于5%，表明實驗精密度較高，結(jié)果見表2。

表2　精密度實驗結(jié)果

2.4重現(xiàn)性實驗

精密移取來自同一批原料的試樣，按樣品測定方法分別測定其吸光度，經(jīng)計算得RSD=0.993%，小于5%，表明重復(fù)性較好，結(jié)果見表3。

表3　重現(xiàn)性實驗結(jié)果

2.5回收率實驗

精密吸取已測定的糖液1.0mL，分別加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL的蛋白質(zhì)標準溶液，加蒸餾水至2.0ml，按樣品測定方法，分別測定其吸光度，計算回收率，結(jié)果見表4，樣品平均回收率為99.55%，RSD =1.30%，符合實驗要求。

表4　回收率實驗結(jié)果

2.6各工藝段糖物料蛋白質(zhì)含量測定結(jié)果與討論

采集2014/2015年榨季中期金光、明陽和伶俐三家糖廠生產(chǎn)過程中的糖物料，包括混合汁、澄清汁、粗糖漿、精糖漿以及甲原蜜和乙原蜜。其中混合汁為壓榨工段物料，清汁為混合汁澄清后的糖物料，粗糖漿為蒸發(fā)后的糖物料，精糖漿為經(jīng)過糖漿上浮后的物料，甲原蜜、乙原蜜為分蜜工段的中間物料。金光和明陽糖廠采用磷酸亞硫酸法澄清工藝，而伶俐糖廠為碳酸法澄清工藝。將實驗測得的蛋白質(zhì)含量列于表5，為方便比較，作成圖3。

表5　各工藝段糖品蛋白質(zhì)含量　　單位：mg/kg·°Bx

圖3　不同澄清工藝制糖生產(chǎn)過程中蛋白質(zhì)含量差異

從表5和圖3可以看出，三個糖廠的混合汁蛋白質(zhì)含量有較大差異，明陽糖廠含量最高，比伶俐糖廠和明陽糖廠分別高出5.78%、32.62%，造成此現(xiàn)象的原因主要是甘蔗原料的不同，甘蔗原料主要與甘蔗品種、田間管理、病蟲害以及新鮮程度等因素有關(guān)。對混合汁進行澄清后發(fā)現(xiàn)，三個糖廠的清汁蛋白質(zhì)含量都比較低，說明清凈過程蛋白質(zhì)除去都較好，金光、明陽、伶俐糖廠蛋白質(zhì)去除率分別達到了94.14%、97.17%和97.86%，這是因為榨季中期甘蔗比較成熟，可溶性蛋白含量較高，分子量較大，而細胞壁離子型結(jié)合蛋白和共價型結(jié)合蛋白的含量都逐漸降低，使蔗汁中可凝結(jié)的蛋白質(zhì)占比升高，較易除去。比較不同澄清方法的物料發(fā)現(xiàn)，采用碳酸法澄清工藝的伶俐糖廠清汁蛋白質(zhì)含量要低于明陽糖廠和金光糖廠，碳酸法澄清工藝對蛋白除去率高于亞硫酸法，這是因為蛋白質(zhì)結(jié)合的鈣量隨糖汁中鈣離子濃度升高而增大，并隨著pH升高而增大，碳酸法澄清添加了大量的石灰，形成碳酸鈣沉淀物對物料進行全汁過濾，引入的大量鈣離子能與蛋白質(zhì)充分結(jié)合，對蛋白質(zhì)的充分去除起到很好的作用。

兩間亞硫酸法糖廠的物料蛋白質(zhì)含量也有差異，明陽糖廠在清凈過程中蛋白質(zhì)的除去率要高于金光糖廠，說明明陽糖廠在制糖生產(chǎn)過程的質(zhì)量控制都要好于金光糖廠；糖漿和原蜜蛋白質(zhì)含量都呈現(xiàn)相同的趨勢，都是伶俐糖廠＜明陽糖廠＜金光糖廠；三家糖廠的精糖漿的蛋白質(zhì)含量均低于粗糖漿，說明在糖漿上浮過程中，除去了一部分的蛋白質(zhì)，除去率約為10%～30%。此外，乙原蜜蛋白質(zhì)含量高于甲原蜜約30%～50%，在分蜜工段越往后面的物料蛋白質(zhì)含量越高，這是由于蔗糖的結(jié)晶使得后續(xù)工序物料的雜質(zhì)累積所致，且從精糖漿到甲原、乙原，蛋白質(zhì)含量增加的幅度相似。與亞硫酸工藝比較，總體上碳酸法工藝相應(yīng)的中間物料的蛋白質(zhì)含量仍然為最低，也說明了碳酸法廠的提糖率和糖產(chǎn)品質(zhì)量與亞硫酸法比較具有較明顯的優(yōu)勢。

3　結(jié)論與展望

采用考馬斯亮藍法測定糖汁中的蛋白質(zhì)含量，在波長為595 nm、反應(yīng)時間為10～30min內(nèi)，標準蛋白質(zhì)溶液濃度在10～100μg/mL之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，精密度實驗、重現(xiàn)性實驗、加標回收實驗RSD均小于5%?？捡R斯亮藍法用于測定甘蔗中蛋白質(zhì)的含量，具有簡便迅速、靈敏度高、重現(xiàn)性好、對設(shè)備要求低等特點，適合大量糖汁樣品的測定。

澄清工段能除去糖汁大部分的蛋白質(zhì)，采用碳酸法澄清工藝蛋白質(zhì)除去率要高于亞硫酸法，后續(xù)工段相應(yīng)的各種糖物料的蛋白質(zhì)含量也是碳法廠低于亞法廠。由此可見，糖物料中的蛋白質(zhì)若在澄清工段被去除，對于制糖過程是有積極意義的。而殘余在糖物料中的蛋白質(zhì)卻成為造蜜因子，對制糖過程是有害的因素，直接影響到糖品的質(zhì)量和收回率。制糖工作者可以從源頭上思考蛋白質(zhì)對制糖過程影響的利與弊，通過研究甘蔗品種、各類蛋白質(zhì)、各種氨基酸、酰胺、胨和多肽對制糖的影響，研究甘蔗蛋白在甘蔗中的含量與甘蔗的品種和質(zhì)量的關(guān)系，研究新鮮成熟的甘蔗與不新鮮或未成熟甘蔗的蛋白質(zhì)對制糖的影響，還可研究風(fēng)折、霜凍、蟲害等自然災(zāi)害甘蔗中的蛋白質(zhì)對制糖過程的危害。可為甘蔗的種植管理，為糖廠的砍運榨管理，為蔗汁清凈和后續(xù)工藝管理的優(yōu)化提供確切有用的依據(jù)。

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Two Typical Sugar Manufacturing Process Changes in Protein

WeiHai，Liu Hui-xia，ZhouWen-hong
（Collegeof Light Industry and Food Engineering，GuangxiUniversity，Nanning530004）

Determination of the protein content of each process section two kinds of sugar processmaterials using Coomassie brilliant blue．Experiments show that the absorbance wasmeasured at awavelength of 595nm at the reaction time iswithin 10～30min，standard protein concentration of the solution showed a good linear relationship within the range of 10～100μg/mL，experimental precision，reproducibility experiment，spiked recovery experiments performed well．Carbonation process in the cleaning process for removing sugarmixed juice rate of protein than sulfitation process．Carbonation clarification process better than the sulfitation process．

Sugar craft;Protein;Coomassie brilliant blue

TS244

B

2095-820X（2016）02-06

2016-03-08；

2016-04-20

廣西科學(xué)基金項目資助（2011GXNSFC018006；桂科轉(zhuǎn)1298009-13）。

韋海（1989-），男，廣西宜州人，碩士研究生，研究方向：制糖過程強化理論與技術(shù)。Email：Wei202hai＠163．com。通訊作者：劉慧霞，教授。Email：sugarliu＠gxu．edu．cn。