顧雨芳 劉煊 李勇進 等

消痰通腑方對肥胖氧化偶氮甲烷/葡聚糖硫酸鈉模型小鼠血清白介素-6和脂聯素的影響

顧雨芳 劉 煊 李勇進 修麗娟 魏品康

上海長征醫(yī)院中醫(yī)科，上海 200003

[摘要] 目的 觀察消痰通腑方對肥胖氧化偶氮甲烷（AOM）/葡聚糖硫酸鈉（DSS）模型小鼠成瘤率及血清白介素-6（IL-6）、脂聯素（ADP）的影響。 方法 飼喂高脂飲食建立小鼠肥胖模型，設正常對照組、肥胖對照組、肥胖模型組及肥胖中藥組，各6只。肥胖模型組及肥胖中藥組第1天AOM 12.5 mg/kg腹腔注射，第2天開始飼喂含3.5%DSS飲水7 d，之后改為14 d正常飲水為1個循環(huán)，共循環(huán)3次。正常對照組及肥胖對照組腹腔注射等劑量生理鹽水及正常飲水。模型建成后，肥胖中藥組給予灌胃消痰通腑方0.4 mL/d，共4周，其余各組灌胃等劑量蒸餾水。實驗結束后觀察小鼠成瘤率及血清IL-6和ADP的變化。 結果 肥胖中藥組成瘤率（50%）明顯低于肥胖模型組（100%）（P < 0.05）。肥胖中藥組血清IL-6水平為（128.17±8.55）ng/L，明顯低于肥胖模型組的（145.45±11.39）ng/L（P < 0.05）。肥胖中藥組ADP水平為（81.05±7.34）μg/L，明顯高于肥胖模型組的（63.15±10.37）μg/L（P < 0.05）。 結論 消痰通腑方可降低肥胖AOM/DSS模型小鼠的成瘤率及血清IL-6水平，升高ADP水平。

[關鍵詞] 消痰通腑方；肥胖；結直腸癌；白介素-6；脂聯素

[中圖分類號] R289 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）02（a）-0016-04

Effect of Xiaotan Tongfu Presciption on serum interleukin-6 and adiponectin in AOM/DSS model of obese mice

GU Yufang LIU Xuan LI Yongjin XIU Lijuan WEI Pinkang

Department of Traditional Chinese Medicine， Shanghai Changzheng Hospital， Shanghai 200003， China

[Abstract] Objective To observe effect of Xiaotan Tongfu Presciption on tumor rate， serum interleukin-6 （IL-6） and adiponectin （ADP） in Azoxymethane （AOM）/Dextran Sodium Sulfate （DSS） model of obese mice. Methods Feeding high fat diet to establish the model of obesity in mice. The mice were randomly divided into normal control group， obese control group， obese model group and obese Chinese medicine group， each group of 6 mice. The mice in obese model group and obese Chinese medicine group were injected AOM 12.5 mg/kg intraperitoneally on the first day and fed with 3.5%DSS from the second day for 7days， then changed to 14 days of normal drinking water as 1 cycle， repeat 3 cycles. The mice in normal control group and obese control group were injected with the same dose of normal saline and normal drinking water. After the model was built， mice in obese Chinese medicine group were given intragastric administration： Xiaotan Tongfu Presciption 0.4 mL/d， a total of 4 weeks， the remaining groups were intragastric administration of the same dose of distilled water. The tumor rate and the changes of serum ADP and IL-6 were observed. Results The tumor rate of obese Chinese medicine group （50%） was significantly lower than that of obese model group （100%） （P < 0.05）. Serum IL-6 level of obese Chinese medicine group was （128.17±8.55） ng/L， significantly lower than that of obese model group [（145.45±11.39） ng/L] （P < 0.05）. ADP level of obese Chinese medicine group was （81.05±7.34） μg/L， significantly higher than that of obese model group [（63.15±10.37） μg/L] （P < 0.05）. Conclusion Xiaotan Tongfu Presciption can reduce the tumor rate and IL-6 level， increase ADP level in AOM/DSS model of obese mice.

[Key words] Xiaotan Tongfu Presciption； Obesity； Colorectal cancer； Interleukin-6； Adiponectin

隨著經濟水平的提高，我國結直腸癌的發(fā)病率和死亡率逐年上升[1]。近期研究表明，肥胖是結腸癌的一個危險因素[2-3]，且增加其死亡率[4]，結腸癌亦屬于肥胖相關性腫瘤。尋找預防及治療結直腸癌的藥物或方法具有重要意義。前期研究顯示，消痰通腑方可抑制小鼠結腸癌CT26原位移植瘤的生長，抑制肝臟轉移[5]。筆者正在進行的實驗顯示，消痰通腑方有抑制化學誘導結腸癌發(fā)生的作用。本實驗選擇氧化偶氮甲烷（Azoxymethane，AOM）/葡聚糖硫酸鈉（Dextran Sodium Sulfate，DSS）誘發(fā)的炎癥相關性腸癌肥胖小鼠模型，采用消痰通腑方干預，觀察其對模型小鼠血清炎性因子及脂聯素（adiponectin，ADP）水平的影響。

1 材料與方法

1.1 動物與飼料

動物：健康清潔級C57BL/6小鼠，28只，雄性，4周齡，體重（20±2）g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，許可證號：SCXK（滬）2012-0002；實驗動物使用許可證號：SYXK（滬）2012-0003。自由進食、飲水，環(huán)境溫度（22±3）℃，相對濕度40%～55%，每天光照12 h。

飼料：基礎飼料及40%高脂飼料由上海普路騰生物科技有限公司提供，許可證號：滬飼證：（2014）04001。小鼠飼料配方：基礎飼料47%，水分10%，粗蛋白質20.5%，粗脂肪4%，粗纖維5%，粗灰分8%，鈣1.8%，總磷1.2%，賴氨酸1.32%，蛋氨酸+胱氨酸0.78%，氯化鈉0.4%。高脂飼料配方：基礎飼料41.79%，豬油40%，膽固醇1%，蛋黃粉12%，膽鹽0.2%，蔗糖5%，甲基硫氧嘧啶0.01%。

1.2 藥物

消痰通腑方，主要由制半夏、制大黃、白芍、細辛等組成，由第二軍醫(yī)大學長征醫(yī)院監(jiān)制江陰天江藥業(yè)有限公司生產，批號：1011370。

1.3 試劑與儀器

試劑：氧化偶氮甲烷購自Sigma公司，批號：A5486；葡聚糖硫酸鈉購自常州千杏生物科技有限公司，批號：DB0160；白介素-6（IL-6）的ELISA試劑盒購自美國Rapidbio公司，批號：DRE30044；脂聯素試劑盒購自美國RB公司，批號：201412。

儀器：離心機由上海安亭科學儀器廠制造，型號：TDL80-2C；移液器、離心管由Eppendorf公司提供。

1.4 分組、造模與給藥

28只小鼠，適應性喂養(yǎng)1周后，隨機分為：正常對照組（6只）及肥胖造模組（22只）。正常對照組予基礎飼料喂養(yǎng)，肥胖造模組予高脂飼料喂養(yǎng)，每周測體重1次并記錄。根據人類肥胖標準，將體重≥標準體重的20%視為肥胖[6]。當肥胖造模組小鼠平均體重>正常對照組的20%定義為肥胖模型建成，剔除體重最輕的4只小鼠。采用隨機數字表法，將剩余的肥胖造模組小鼠分為肥胖對照組、肥胖模型組及肥胖中藥組，各6只。肥胖模型組及肥胖中藥組第1天AOM 12.5 mg/kg腹腔注射，第2天開始飼喂含3.5%DSS飲水7 d，之后改為14 d正常飲水為1個循環(huán)，共循環(huán)3次9周時間。正常對照組及肥胖對照組腹腔注射等劑量生理鹽水及正常飲水。第14周開始，肥胖中藥組小鼠灌胃消痰通腑方0.4 mL/d，共4周，其余各組灌胃等劑量蒸餾水。18周后所有小鼠脫頸椎處死。

1.5 觀測指標

每日觀察小鼠形體、精神狀態(tài)及糞便等一般狀況。實驗結束后，摘眼球取血，血標本靜置20 min后，3000 r/min離心20 min，分離血清，-80℃保存，用ELISA檢測血清IL-6及ADP指標。小鼠以頸椎脫臼處死，迅速剖取整段結直腸（自盲腸末端至肛門），并沿腸管縱軸縱向剖開，用預冷的生理鹽水溶液漂洗清潔，黏膜面朝上置于濾紙上，肉眼觀察黏膜炎癥及有無腫瘤的發(fā)生及腫瘤發(fā)生數目。選取紅腫糜爛、潰瘍或腫瘤較明顯處的病變腸段置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，常規(guī)石蠟包埋，切片，蘇木精-依紅（HE）染色，行病理組織學檢測。計算腫瘤發(fā)生率：腫瘤發(fā)生率=（腺癌+腺瘤）動物數/動物總數×100%。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件對數據進行分析和處理，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較，方差齊時用LSD-t檢驗，方差不齊時用Dunnett′s T3檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計意義。

2 結果

2.1 小鼠一般情況

11周時，喂養(yǎng)高脂飼料的肥胖造模組小鼠體重為（30.75±1.29）g，超過正常對照組小鼠體重[（25.75±0.66）g]的20%，肥胖模型建成，肥胖模型組及肥胖中藥組小鼠建立AOM/DSS模型。正常對照組小鼠形體正常，行動靈活，大便正常；肥胖對照組體型肥胖，運動遲緩，大便正常；肥胖模型組小鼠體型肥胖，進食減少，排稀便；肥胖中藥組小鼠毛發(fā)油亮，體型肥胖，進食較肥胖模型組增加，排稀便減少。消痰通腑方可增加小鼠的食欲，減輕腹瀉情況。

2.2 消痰通腑方對小鼠腫瘤發(fā)生的影響

結腸組織肉眼觀察發(fā)現，正常對照組及肥胖對照組小鼠腸黏膜未見明顯異常，肥胖模型組小鼠腸黏膜可見較多息肉狀隆起樣改變，肥胖中藥組小鼠腸黏膜息肉狀隆起樣改變數目明顯減少，見圖1。病理檢查可見，正常對照組及肥胖對照組小鼠結腸黏膜未見明顯異常；肥胖模型組小鼠結腸可見黏膜腺體萎縮，低級別上皮內瘤變及高級別上皮內瘤變未見浸潤性癌，荷瘤數目為（9.50±3.27）個，成瘤率為100%；肥胖中藥組小鼠息肉數目明顯減少，荷瘤數目為（5.83±2.31）個，成瘤率為50%，與肥胖模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。見圖2、表1。

A

B

C

D

A：正常對照組；B：肥胖對照組；C：肥胖模型組；D：肥胖中藥組

圖1 各組腸黏膜肉眼觀察

A B

C D

A：正常對照組；B：肥胖對照組；C：肥胖模型組；D：肥胖中藥組

圖2 各組腸黏膜病理表現（HE染色，100×）

表1 各組小鼠荷瘤數目及腫瘤發(fā)生率比較

注：與肥胖模型組比較，△P < 0.05

2.3 各組小鼠血清IL-6及ADP水平比較

肥胖模型組小鼠IL-6水平明顯高于肥胖對照組及正常對照組（P < 0.01），肥胖中藥組小鼠IL-6水平低于肥胖模型組（P < 0.05）；肥胖模型組小鼠ADP水平明顯低于肥胖對照組及正常對照組（P < 0.01），肥胖對照組小鼠ADP水平明顯低于正常對照組（P < 0.01），肥胖中藥組小鼠ADP水平高于肥胖模型組（P < 0.05）。見表2。

表2 各組小鼠血清IL-6及ADP水平比較（x±s）

注：與正常對照組比較，**P < 0.01；與肥胖對照組比較，##P < 0.01；與肥胖模型組比較，△P < 0.05；IL-6：白介素-6；ADP：脂聯素

3 討論

近年來人們生活方式的改變如活動量減少、高脂高糖飲食攝入增加，使肥胖的發(fā)病率越來越高。一項Meta分析結果顯示，體重指數每增加2 kg/m2，結直腸癌的危險度增加7%[7]。肥胖是結直腸癌發(fā)生的一項獨立危險因素。肥胖與結腸癌發(fā)病的確切機制還沒有完全明了。在肥胖狀態(tài)下，以下因素的改變可能在結腸炎癌變的發(fā)展中起重要作用，包括胰島素、瘦素、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）及IL-6的增加和ADP的減少[8-9]。

IL-6是一種重要的促炎細胞因子，不僅由單核/巨噬細胞產生，也由脂肪細胞產生，在肥胖狀態(tài)下，血清IL-6水平增加[10]。近年來研究顯示，IL-6及其相關信號通路參與了結腸癌的發(fā)生，IL-6可在早期促進癌變細胞的增殖和腫瘤細胞的增長[11-12]。

ADP是脂肪組織分泌的脂肪細胞因子中，唯一隨脂肪組織體積增大而血漿濃度降低的脂肪因子，有胰島素增敏、抗炎和抗凋亡的作用，與肥胖、2型糖尿病、心血管疾病和腫瘤等疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關[13]。ADP可能通過與受體結合后介導PI3K/Akt/mTOR、Wnt等信號通路或通過調節(jié)其他細胞因子如瘦素、TNF-α、IL-6等影響腸癌的發(fā)生、發(fā)展[14]。動物實驗顯示，在AOM誘導的大腸癌模型中，ADP基因敲除小鼠的大腸癌生成和肝轉移較野生型小鼠更多[15]。體外實驗表明，ADP分泌的受損可引起結腸干細胞數量減少及細胞凋亡增加，導致結腸癌的發(fā)生[16]。有前瞻性病例對照研究顯示，低血漿ADP的男性患大腸癌風險更高[17]。增加循環(huán)ADP的水平或活化ADP介導的信號通路則有抗腫瘤的作用[14]。

AOM/DSS模型是目前使用最廣泛的結直腸癌化學誘導模型[18]。Suzuki等[19]用AOM 10 mg/kg腹腔注射和含1%DSS飲水4 d的方法處理雄性C57BL/6小鼠，第18周發(fā)現小鼠結腸腺癌發(fā)生率為50%。本研究預實驗顯示，給正常體重C57BL/6小鼠AOM 12.5 mg/kg腹腔注射3次聯合3循環(huán)3.5%DSS自由飲用，腸黏膜上皮最早于第9周出現結直腸高級別上皮內瘤變，14周時成瘤率為83.33%，其中50%為高級別上皮內瘤變，至18周成瘤率達90%[20]。本研究用AOM/DSS三循環(huán)的方法誘導肥胖小鼠建立模型，成瘤率達100%，肥胖模型組小鼠均出現高級別上皮內瘤變，表明肥胖可增加AOM/DSS模型的成瘤率。

魏品康[21]教授認為，“痰”是消化道腫瘤的主要致病因素，這種“痰”是廣義的“痰”，指臟腑功能失調或疾病狀態(tài)下津液水濕代謝障礙產生的病理產物，痰生成后，蓄積于體內，日久局部微環(huán)境發(fā)生變化，此即“痰濁”；在某些因素如“氣”和“火”的作用下，痰聚成結，化生痰核，萌生痰絡，生為“惡痰”即消化道腫瘤。早在《內經》時代，中醫(yī)就將肥胖之人稱為“肥人”，認為肥胖癥與痰濕密切相關。飲食肥甘，脾胃運化失健，傳導失司，水谷停為濕滯，蘊久化熱，濕與熱結發(fā)為腸澼，濕熱留滯于大腸，與氣血博結，致腸道傳導失司，產生氣滯、血瘀、痰濁等病理改變，形成結腸癌的基礎。結腸癌的發(fā)生與痰阻、氣滯、血瘀、熱毒相關，其中痰濁內阻是腫塊形成的關鍵病機。肥胖為一種慢性炎癥狀態(tài)，脂肪組織分泌大量的炎性因子如IL-6、TNF-α[4]，而ADP水平則顯著降低，干擾機體內環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，為腸癌的發(fā)生提供了痰濁環(huán)境，如果清除這種環(huán)境則能抑制其發(fā)生、發(fā)展。所以，從痰論治，清化痰濁污染，以消痰散結、清熱通腑之法治之。消痰通腑方是以魏品康主任消痰散結八法中消痰散結導滯法為指導，以二陳湯和小承氣湯化裁而來，在臨床實踐中，治療結腸癌效果甚佳。

本實驗結果顯示，肥胖對照組的IL-6水平與正常對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 005），但從數據看有增高趨勢；肥胖模型組的IL-6水平較正常對照組及肥胖對照組明顯升高（P < 005）；肥胖對照組小鼠ADP水平較正常對照組明顯降低（P < 005）；肥胖模型組小鼠ADP水平較正常對照組及肥胖對照組明顯降低（P < 005）；經消痰通腑方干預后可降低肥胖中藥組的成瘤率及IL-6水平，升高肥胖中藥組的ADP水平。降低炎性因子的水平及提高ADP的水平，都能降低腫瘤的發(fā)生率。本研究為從痰論治結腸癌提供了新的證據，但其具體作用機制尚待進一步研究。

[參考文獻]

[1] 江娜.老年結腸癌患者血清胃泌素表達及臨床意義[J].中國老年學雜志，2013，33（17）：4291-4292.

[2] Sinicrope FA，Foster NR，Yothers G，et al. Body mass index at diagnosis and survival among colon cancer patients enrolled in clinical trials of adjuvant chemotherapy [J]. Cancer，2013，119（8）：1528-1536.

[3] Wolin KY，Carson K，Colditz GA. Obesity and cancer [J]. Oncologist，2010，15（6）：556-565.

[4] Gallagher EJ，LeRoith D. Epidemiology and molecular mec-hanisms tying obesity，diabetes，and the metabolic syndrome with cancer [J]. Diabetes Care，2013，36（Suppl 2）：S233-S239.

[5] 趙穎，李勇進，魏品康.消痰通腑方對結腸癌荷瘤小鼠肝組織中IGF-I及其受體（IR）蛋白和基因表達的影響[J].中華中醫(yī)藥學刊，2012，30（11）：2557-2559.

[6] 陳灝珠，林果為.實用內科學[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2012：923.

[7] Moghaddam AA，Woodward M，Huxley R. Obesity and risk of colorectal cancer；a meta-analysis of 31 studies with 70 000 events [J]. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2007， 16（12）：2533-2547.

[8] Huang XF，Chen JZ. Obesity，the PI3K/Akt signal pathway and colon cancer [J]. Obes Rev，2009，10（6）：610-616.

[9] 周嬌群，孫文輝，許劍民.胰島素抵抗與結直腸癌相關性的臨床研究[J].中國現代醫(yī)生，2014，52（14）：16-19.

[10] 蔣敬薈，瞿平，魏小平，等.兒童代謝綜合征患兒血清中炎癥因子hs-CRP、IL-6、TNF-α的變化及意義[J].第三軍醫(yī)大學學報，2011，33（14）：1530-1533.

[11] Grivenniov S，Karin E，Terzic J，et al. IL-6 and Stat3 are required for survival of intestinal epithelial cells and development of colitis associated cancer [J]. Cancer Cell，2009，15（2）：103-113.

[12] Tian Y，Ye Y，Gao W，et al. Aspirin promotes apoptosis in a murine model of colorectal cancer by mechanisms involving downregulation of IL-6-STAT3 signaling pathway [J]. Int J Colorectal Dis，2011，26（1）：13-22.

[13] 張艷，魏文青，焦娟，等.脂聯素的生物學功能研究進展[J].中國熱帶醫(yī)學，2013，13（5）：649-650.

[14] Hebbard L，Ranscht B. Multifaceted roles of Adiponectin in cancer [J]. Best Pract Res Clin Endocrinol Metab，2014， 28（1）：59-69.

[15] Nishihara T，Baba M，Matsuda M，et al. Adiponectin deficiency enhances colorectal carcinogenesis and liver tumor formation induced by azoxymethane in mice [J]. World J Gastroenterol，2008，14（42）：6473-6480.

[16] DeClercq V，McMurray DN，Chapkin RS. Obesity promotes colonic stem cell expansion during cancer initiation [J]. Cancer Lett，2015，369（2）：336-343.

[17] Wei EK，Giovannucci E，Fuchs CS，et al. Low plasma adi-ponectin levels and risk of colorectal cancer in men：a prospective study [J]. J Nat Cancer Inst，2005，97（22）：1688-1694.

[18] Jemal A，Bray F，Center MM，et al. Global cancer statistics [J].CA Cancer J Clin，2011，61（2）：69-90.

[19] Suzuki R，Kohno H，Sugie S，et al. Strain differences in the susceptibility to azoxymethane and dextran sodium sulfate-induced colon carcinogenesis in mice [J]. Carci-nogenesis，2006，27（1）：162-169.

[20] 劉煊，顧雨芳，孫昱瑋，等.消痰通腑方對結直腸癌前病變小鼠IL-6、AICD表達的影響[J].上海中醫(yī)藥雜志，2015， 49（4）：79.

[21] 魏品康.胃癌診治新論[M].上海：上?？茖W教育出版社，2012：27-31.

（收稿日期：2015-10-27 本文編輯：李亞聰）