柳新勝 艾芬
[摘要] 目的 研究肺癌組織中miRNAs的表達及其與Oct4、Kruppel樣因子(Klf4)的關(guān)系。 方法 選擇2013年4月~2014年8月期間在南京軍區(qū)福州總醫(yī)院接受肺癌根治術(shù)的50例患者進行研究,收集肺癌組織和癌旁正常組織,檢測Oct4、Klf4的mRNA含量以及miR-335、miR-339、miR-361、miR-200c、miR-148、miR-29的表達量,分析Oct4、Klf4的mRNA含量與miRNAs表達量的關(guān)系。 結(jié)果 肺癌組織中Oct4的mRNA含量(231.12±29.49)高于癌旁正常組織的(100.00±13.49),t=16.965,P < 0.05;Klf4的mRNA含量(34.58±5.59)低于癌旁正常組織的(100.00±15.02)(t=21.344,P < 0.05);TNM分期越高,肺癌組織中Oct4的mRNA含量越高,Klf4的mRNA含量越低,F(xiàn)值分別為18.812、20.193(P < 0.05);分化程度越低,肺癌組織中Oct4的mRNA含量越高、Klf4的mRNA含量越低,F(xiàn)值分別為16.877、23.485(P < 0.05);肺癌組織中miR-335、miR-339、miR-361的表達量分別為(25.68±3.42)、(34.15±4.85)、(18.49±1.95),低于癌旁組織的(100.00±12.38)、(100.00±11.69)、(100.00±14.04)(均P < 0.05),并且與Oct4的mRNA含量呈負相關(guān);miR-200c、miR-148、miR-29的表達量[(243.45±30.45)、(313.68±36.58)、(278.69±32.48)]高于癌旁組織[(100.00±13.59)、(100.00±15.02)、(100.00±13.48)](均P < 0.05);并且與Klf4的mRNA含量呈負相關(guān)。 結(jié)論 肺癌組織中miR-335、miR-339、miR-361及miR-200c、miR-148、miR-29可能分別通過上調(diào)或下調(diào)Oct4、Klf4的表達來參與肺癌的發(fā)生發(fā)展。
[關(guān)鍵詞] 肺癌;microRNA;Oct4;Kruppel樣因子
[中圖分類號] R730.21 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210(2016)01(b)-0020-04
Expression of miRNAs in lung cancer and its correlation with Oct4, Klf4
ZHU Jie1,2 XU Chi1 YANG Jingrong1 ZENG Zhiyong1
1.Department of Cardiothoracic Surgery, Fuzhou General Hospital of Nanjing Military Command, Fujian Province, Fuzhou 350001, China; 2.Graduate School, the Second Military Medical University, Shanghai 200433, China
[Abstract] Objective To study the expression of miRNAs in lung cancer and its correlation with Oct4, Klf4. Methods 50 cases of patients received lung resection in Fuzhou General Hospital of Nanjing Military Command from April 2013 to August 2014 were enrolled. Lung cancer tissue and adjacent normol tissues were collected. Then mRNA contents of Oct4, Klf4 and miR-335, miR-339, miR-361, miR-200,, miR-148, miR-29 expression levels were detected, the correlation between mRNA contents of Oct4, Klf4 and miRNAs expression were analyzed. Results mRNA contents of Oct4 (231.12±29.49) in lung cancer were higher than those (100±13.49) in adjacent normal tissue (t=16.965, P < 0.05); mRNA contents of Klf4 (34.58±5.59) were lower than those (100.00±15.02) in adjacent normal tissue (t=21.344, P < 0.05); the higher the TNM stage, the higher the Oct4 mRNA contents and the lower the Klf4 mRNA contents in lung tissue, F value was 18.812, 20.193 separately (P < 0.05); the lower the differentiation degree, the higher the Oct4 mRNA contents and the lower the Klf4 mRNA contents in lung tissue, F value was 16.877, 23.485 separately (P < 0.05); miR-335, miR-339, miR-361 contents [(25.68±3.42), (34.15±4.85), (18.49±1.95)] in lung cancer were lower than those [(100.00±12.38), (100.00±11.69), (100.00±14.04)] in adjacent normal tissue (P < 0.05) and negatively correlated with mRNA contents of Oct4; miR-200c, miR-148, miR-29 expression levels [(243.45±30.45), (313.68±36.58), (278.69±32.48)] in lung cancer were higher than those [(100±13.59), (100.00±15.02), (100.00±13.48)] in adjacent normal tissue (P < 0.05) and negatively correlated with mRNA contents of Klf4. Conclusion miR-335, miR-339, miR-361 and miR-200c, miR-148, miR-29 may participate in the occurrence of lung cancer by reducing the expression of Oct4 and Klf4.
[Key words] Lung cancer; MicroRNA; Oct4; Klf4
肺癌是我國發(fā)病率最高的惡性腫瘤,手術(shù)切除仍是臨床治療肺癌最有效的方式,輔助以術(shù)后放化療、生物靶向治療等措施能夠有效地延長患者的生存時間。盡管如此,患者在接受綜合治療措施后的復(fù)發(fā)率仍較高,復(fù)發(fā)病灶對放化療以及生物靶向藥物不敏感會導(dǎo)致病情迅速發(fā)展,最終造成死亡。目前,肺癌發(fā)病的潛在分子機制仍未闡明。Oct4和Kruppel樣因子4(Klf4)是參與細胞增殖調(diào)控的兩類轉(zhuǎn)錄因子,與多種惡性腫瘤的發(fā)生相關(guān)[1-2],檢測肺癌組織中Oct4和Klf4的表達量、探索上游調(diào)控機制有助于闡明肺癌發(fā)生的分子機制。近年來有研究顯示,miRNAs表達異常與肺癌的發(fā)生密切相關(guān)并且能夠通過與mRNA3'UTR區(qū)域結(jié)合來調(diào)節(jié)基因表達,可能參與 Oct4和Klf4表達的調(diào)控[3-4]。本研究分析了肺癌組織中miRNAs表達量及其與Oct4、Klf4表達量的關(guān)系。
1 資料與方法
1.1 研究對象
選擇2013年4月~2014年8月在南京軍區(qū)福州總醫(yī)院胸外科接受肺癌根治術(shù)的50例患者進行研究,所有患者經(jīng)病理學(xué)檢查診斷為肺癌,包括男32例、女18例,年齡43~67歲,平均(52.39±6.82)歲。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準后告知研究事項和手術(shù)風(fēng)險,取得患者知情同意后進行肺癌根治術(shù)。術(shù)中取肺癌組織和癌旁正常組織,經(jīng)病理檢查確認肺癌組織和癌旁正常組織的性質(zhì)后用于下一步研究。
1.2 研究材料
RNA提取試劑盒、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒以及熒光定量PCR試劑盒來自日本Takara公司;miRNA提取試劑盒、miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒以及熒光定量PCR試劑盒來自德國Qigen公司;PCR儀來自美國ABI公司。
1.3 研究方法
1.3.1 RNA抽提和檢測方法 取肺癌組織和癌旁組織,采用RNA提取試劑盒抽提組織中的總RNA,采用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、通過OligoDT18將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,而后進行熒光定量PCR反應(yīng),擴增條件如下:95℃變性,15 s,特異性退火溫度,15 s,72℃延伸25 s,重復(fù)40個循環(huán)。擴增基因包括Oct4、Klf4,擴增引物及特異性退火溫度見表1。
1.3.2 miRNA抽提和檢測方法 取肺癌組織和癌旁組織,采用miRNA提取試劑盒抽提組織中的總miRNA,采用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒對miRNA進行加尾處理、取加尾樣本進行反轉(zhuǎn)錄并得到miRNA對應(yīng)的cDNA;而后進行熒光定量PCR反應(yīng),退火溫度參照試劑盒均為60℃,擴增條件如下:95℃變性,15 s,60℃退火和延伸,35 s,重復(fù)40個循環(huán)。擴增基因包括miR-335、miR-339、miR-361、miR-200c、miR-148、miR-29,擴增引物見表1。
1.4 統(tǒng)計學(xué)方法
采用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行錄入和分析,兩組間比較采用t檢驗,三組間比較采用方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗,相關(guān)性分析采用Pearson檢驗,以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2 結(jié)果
2.1 肺癌組織和癌旁正常組織中Oct4、Klf4的表達量
肺癌組織中Oct4的mRNA含量高于癌旁正常組織,Klf4的mRNA含量低于癌旁正常組織,肺癌組織和癌旁正常組織中Oct4、Klf4表達量比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P < 0.05)。見表2。
2.2 不同TNM分期肺癌組織中Oct4、Klf4的表達量
不同TNM分期肺癌組織中Oct4、Klf4的mRNA含量有差異,t檢驗示不同TNM分期肺癌組織中Oct4、Klf4表達量比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P < 0.05);LSD-t檢驗進行兩兩比較顯示,TNM分期越高,Oct4的mRNA含量越高,Klf4的mRNA含量越低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P < 0.05)。見表3。
2.3 不同分化程度肺癌組織中Oct4、Klf4的表達量
不同分化程度肺癌組織中Oct4、Klf4的mRNA含量有差異,t檢驗示不同分化程度肺癌組織中Oct4、Klf4表達量比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P < 0.05)。LSD-t檢驗進行兩兩比較顯示,分化程度越低,Oct4的mRNA含量越高、Klf4的mRNA含量越低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P < 0.05)。見表4。
2.4 肺癌組織和癌旁組織中miRNAs的表達量
肺癌組織中miR-335、miR-339、miR-361的表達量低于癌旁正常組織,miR-200c、miR-148、miR-29的表達量高于癌旁組織。肺癌組織和癌旁正常組織中miRNAs表達量比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P < 0.05)。見表5。
2.5 肺癌組織中miRNAs表達量與Oct4、Klf4的mRNA的相關(guān)性
肺癌組織中miR-335、miR-339、miR-361的表達量與Oct4的mRNA含量呈負相關(guān)(P < 0.05),miR-200c、miR-148、miR-29的表達量與Klf4的mRNA含量呈負相關(guān)(P < 0.05)。見表6。
3 討論
Oct-4蛋白由Pou5f1基因編碼,是一類含有Pou結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子,對于維持胚胎干細胞的多能性和自我更新性具有重要意義[5]。最初關(guān)于Oct-4的研究多集中在尚未分化的細胞,該轉(zhuǎn)錄因子既能夠使某些細胞繼續(xù)處于未分化狀態(tài),又能使某些細胞向某一類型細胞分化[6]。近年來的多項研究提示,Oct-4高表達與已分化體細胞的無限增殖有關(guān),進而參與乳腺癌、宮頸癌、胃癌、肺癌等惡性腫瘤的發(fā)生過程[7-9]。本研究對肺癌組織中Oct-4表達量的檢測顯示,肺癌組織中Oct-4的mRNA含量高于癌旁組織;且腫瘤的分化程度越低,Oct-4的mRNA含量越高,腫瘤的TNM分期越高,Oct-4的mRNA含量越高。
Klf4是真核細胞內(nèi)特有的一類含有3個鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子,能夠識別SP1的GC結(jié)合位點并進行競爭性結(jié)合、抑制SP1下游靶基因CyclinD1的表達,進而阻遏細胞周期的發(fā)展以及細胞的增殖[10]。近年來越來越多的研究將Klf4視作腫瘤抑制因子,胃癌、食管癌等消化道惡性腫瘤的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)Klf4低表達與惡性腫瘤的發(fā)展有關(guān)[11-12]。本研究采用與Oct4相同的方法對肺癌組織中Klf4表達量的檢測顯示,肺癌組織中Klf4的mRNA含量低于癌旁組織;且分化程度越低,Klf4的mRNA含量越低,腫瘤的TNM分期越高,Klf4的mRNA含量越低。
通過以上對Oct4和Klf4表達量的分析可知,Oct4高表達和Klf4低表達與肺癌的發(fā)生以及病情的進展相關(guān)。但是,目前關(guān)于兩種轉(zhuǎn)錄因子表達量發(fā)生變化的分子機制仍處于未知狀態(tài)。microRNA是近年來興起的表觀遺傳學(xué)調(diào)控分子,能夠通過與mRNA的3'UTR區(qū)域結(jié)合來調(diào)節(jié)多種轉(zhuǎn)錄因子的表達[13]。為了探明肺癌組織中miRNAs是否參與Oct4和Klf4表達的調(diào)控,首先對Oct4和Klf4 mRNA的3'UTR序列進行了生物信息學(xué)分析,在Oct4 mRNA的3'UTR上有miR-125b、miR-145、miR-200c、miR-302、miR-324、miR-335、miR-339、miR-430、miR-449a、miR-595的結(jié)合位點,在Klf4 mRNA的3'UTR上有miR-10b、miR147、miR-199、miR-205、miR-221的結(jié)合位點。由此推測上述miRNAs可能通過調(diào)節(jié)Oct4和Klf4的表達,進而參與肺癌的發(fā)生。
在上述生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)上,本研究查閱了有關(guān)肺癌組織中miRNAs表達變化的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),肺癌組織中miR-335、miR-339、miR-361、miR-200c、miR-148、miR-29的表達異常[14-20]。進一步對肺癌組織中miRNAs的表達量進行了驗證并分析了miRNAs含量與相應(yīng)靶基因Oct4、Klf4的相關(guān)性,檢測和分析的結(jié)果顯示,肺癌組織中miR-335、miR-339、miR-361的表達量低于癌旁組織且與Oct4的mRNA含量呈負相關(guān),miR-200c、miR-148、miR-29的表達量高于癌旁組織且與Klf4的mRNA含量呈負相關(guān)。這就初步提示肺癌組織中miR-335、miR-339、miR-361的低表達可能通過增加Oct4的表達來參與疾病的發(fā)生,miR-200c、miR-148、miR-29的高表達可能通過減少Klf4的表達來參與疾病的發(fā)生。
綜上所述,得出以下初步結(jié)論,肺癌組織中miR-335、miR-339、miR-361及miR-200c、miR-148、miR-29可能分別通過上調(diào)或下調(diào)Oct4、Klf4的表達來參與肺癌的發(fā)生發(fā)展。
[參考文獻]
[1] Liu L,Zhang J,F(xiàn)ang C,et al. OCT4 mediates FSH-induced epithelial-mesenchymal transition and invasion through the ERK1/2 signaling pathway in epithelial ovarian cancer [J]. Biochem Biophys Res Commun,2015,461(3):525-532.
[2] Wang Y,Yang C,Gu Q,et al. KLF4 promotes angiogenesis by activating VEGF signaling in human retinal microvascular endothelial cells [J]. PLoS One,2015,10(6):e0130341.
[3] Ogawa H,Wu X,Kawamoto K,et al. MicroRNAs induce epigenetic reprogramming and suppress malignant phenotypes of human colon cancer cells [J]. PLoS One,2015,10(5):e0127119.
[4] Tokarz P,Blasiak J. The role of microRNA in metastatic colorectal cancer and its significance in cancer prognosis and treatment [J]. Acta Biochim Pol,2012,59(4):467-474.
[5] Tang YA,Chen CH,Sun HS,et al. Global Oct4 target gene analysis reveals novel downstream PTEN and TNC genes required for drug-resistance and metastasis in lung cancer [J]. Nucleic Acids Res,2015,43(3):1593-1608.
[6] Rodriguez E,Chen L,Ao MH,et al. Expression of transcript factors SALL4 and OCT4 in a subset of non-small cell lung carcinomas (NSCLC) [J]. Transl Respir Med,2014,2(1):10.
[7] Liu T,Sun B,Zhao X,et al. OCT4 expression and vasculogenic mimicry formation positively correlate with poor prognosis in human breast cancer [J]. Int J Mol Sci,2014,15(11):19634-19649.
[8] Breyer JP,Dorset DC,Clark TA,et al. An expressed retrogene of the master embryonic stem cell gene POU5F1 is associated with prostate cancer susceptibility [J]. Am J Hum Genet,2014,94(3):395-404.
[9] 劉劼,徐阿曼,陸震,等.胃癌及癌前病變組織中Nanog和Oct-4的表達及意義[J].臨床與實驗病理學(xué)雜志,2014, 30(8):880-883.
[10] Naranjo Gómez JM,Bernal JF,Arranz PG,et al. Alterations in the expression of p53,KLF4,and p21 in neuroendocrine lung tumors [J]. Arch Pathol Lab Med,2014,138(7):936-942.
[11] 崔晉峰,趙晨燕,曹立勇,等.食管胃交界腺癌和遠端胃癌KLF4 SP1及Cyclin D1表達的對比研究[J].中國腫瘤臨床,2014,41(2):108-111.
[12] 張志平,王洲,劉相燕,等.食管癌組織KLF4和Survivin蛋白表達及其相關(guān)性研究[J].中華腫瘤防治雜志,2012, 19(6):406-409.
[13] 陳琛,孟凡榮,萬海粟,等.MicroRNAs與OCT4基因之間的相互作用[J].中國肺癌雜志,2015,18(1):55-58.
[14] Li Y,Zhao W,Bao P,et al. miR-339-5p inhibits cell migration and invasion and may be associated with the tumor-node-metastasis staging and lymph node metastasis of non-small cell lung cancer [J]. Oncol Lett,2014,8(2):719-725.
[15] Rani S,Gately K,Crown J,et al. Global analysis of serum microRNAs as potential biomarkers for lung adenocarc-inoma [J]. Cancer Biol Ther,2013,14(12):1104-1112.
[16] Gong M,Ma J,Guillemette R,et al. miR-335 inhibits small cell lung cancer bone metastases via IGF-IR and RANKL pathways [J]. Mol Cancer Res,2014,12(1):101-110.
[17] Li L,Chen YY,Li SQ,et al. Expression of miR-148/152 family as potential biomarkers in non-small-cell lung cancer [J]. Med Sci Monit,2015,23(21):1155-1161.
[18] Roth C,Stückrath I,Pantel K,et al. Low levels of cell-free circulating miR-361-3p and miR-625* as blood-based markers for discriminating malignant from benign lung tumors [J]. PLoS One,2012,7(6):e38248.
[19] Chang L,Guo F,Huo B,et al. Expression and clinical significance of the microRNA-200 family in gastric cancer [J]. Oncol Lett,2015,9(5):2317-2324.
[20] Tan M,Wu J,Cai Y. Suppression of Wnt signaling by the miR-29 family is mediated by demethylation of WIF-1 in non-small-cell lung cancer [J]. Biochem Biophys Res Commun,2013,438(4):673-679.
(收稿日期:2015-09-08 本文編輯:趙魯楓)