包怡紅，鄧 啟

（1.東北林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.林下經(jīng)濟(jì)資源研發(fā)與利用協(xié)同創(chuàng)新中心，黑龍江 哈爾濱150040）

響應(yīng)面法優(yōu)化亞臨界水萃取黑木耳多糖工藝

包怡紅1，2，鄧 啟1

（1.東北林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.林下經(jīng)濟(jì)資源研發(fā)與利用協(xié)同創(chuàng)新中心，黑龍江 哈爾濱150040）

利用響應(yīng)面法對(duì)亞臨界水萃取法提取木耳多糖的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。以木耳粉末為材料，研究溫度、時(shí)間、液料比、壓力對(duì)木耳多糖提取率的影響，用苯酚-硫酸法檢測(cè)木耳多糖的含量，基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，最終確定木耳多糖的最佳提取工藝，并與其他提取方法進(jìn)行比較。經(jīng)過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化，最佳提取條件為：溫度152℃，時(shí)間26 min，液料比131∶1（mL/g），提取壓力1.0 MPa，此條件下木耳多糖提取率為24.51%。利用亞臨界水萃取法，木耳多糖提取率得到大幅提高，與傳統(tǒng)的熱水浸提法相比提高了3.82倍，為木耳多糖的工業(yè)化生產(chǎn)提供了一種高效環(huán)保技術(shù)。

黑木耳；多糖；亞臨界水；響應(yīng)面法；提取

Keywords：Auricularia auricular，polysaccharies，subcritical water，response surface methodology，extraction

黑木耳（Auricularia auricular）俗稱云耳、木耳等，是我國(guó)珍貴的藥食兩用菌，含有人體不可缺少的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，具有益氣強(qiáng)身，防治動(dòng)脈硬化、高血壓和眼底出血，防治缺鐵性貧血等功效［1-2］。木耳多糖作為黑木耳的主要生物活性成分，具有抗?jié)儭⒀泳徦ダ?、降低血脂、抗肝炎、抗突變、抗腫瘤、增強(qiáng)蛋白質(zhì)和核酸代謝，及促進(jìn)機(jī)體免疫等功能［3-4］。有研究表明，黑木耳多糖可以作為藥物的有效成分而單獨(dú)使用或作為輔助藥物使用，因此利用黑木耳多糖開(kāi)發(fā)功能性食品、保健品和藥物有著廣闊的前景。

近年來(lái)，關(guān)于黑木耳多糖提取方法及其生物活性的研究較多，其中黑木耳多糖的提取方法主要包括：熱水浸提法、稀堿浸提法、酶解提取法、超聲波提取法和微波輔助提取法。但以上提取黑木耳多糖的方法，大多有耗時(shí)長(zhǎng)、產(chǎn)量低、成本高的缺點(diǎn)，無(wú)法滿足市場(chǎng)需求。亞臨界水萃取技術(shù)（subcritical water extraction，SWE）是近幾年發(fā)展起來(lái)的一種新興的提取分離技術(shù)。亞臨界水是指在一定的壓力下，將水加熱到100℃以上、374℃以下，水仍然保持液體狀態(tài)（低于臨界壓力22 MPa）［5-6］，其基本原理是在亞臨界狀態(tài)下，不僅可以降低固液相界面的液膜強(qiáng)度，還能改善動(dòng)力學(xué)特征，降低表面張力及黏度，增加有機(jī)活性物質(zhì)在水中的溶解度，從而提高萃取率。亞臨界水萃取與傳統(tǒng)方法相比具有提取時(shí)間短、提取效率高、能量消耗較少，并且綠色環(huán)保無(wú)污染等優(yōu)勢(shì)［7-8］，此外亞臨界水還會(huì)使蛋白質(zhì)、淀粉等變性，給后續(xù)的分離、純化帶來(lái)便利。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于亞臨界水萃取法的研究多集中于提取植物精油，而用于提取植物多糖的研究較少。婁冠群等人利用亞臨界水提取香菇多糖，提取率達(dá)到15.7%，與熱水恒溫浸提法相比，明顯降低提取時(shí)間和提高香菇多糖得率［9］。本課題研究中以黑木耳為原料，采用亞臨界水萃取法，研究溫度、時(shí)間、壓力及液料比對(duì)多糖提取率的影響，結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，為黑木耳多糖的綜合利用及工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑木耳，黑龍江省海林市北味黑木耳。主要試劑：蒸餾水、石油醚、硫酸、苯酚、葡萄糖、體積分?jǐn)?shù)30%過(guò)氧化氫溶液、氯仿、正丁醇、丙酮，以上試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

KCFD05-03型亞臨界反應(yīng)釜，煙臺(tái)高新區(qū)科立自控設(shè)備研究所研制；恒溫水浴鍋，上海普渡生化科技有限公司制造；DHG-9240型鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科技有限公司制造；PC20E-G電磁爐，上海奔騰企業(yè)有限公司制造；JA2003型電子天平，上海良平儀器儀表有限公司制造；721型分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司制造；TDL-40B-W臺(tái)式低速大容量離心機(jī)，河南星科科學(xué)儀器有限公司制造；RE-5205型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠制造。

1.3 方法

1.3.1 木耳多糖的提取方法 黑木耳洗凈，干燥粉碎，過(guò)80目篩，石油醚脫脂24 h。稱取2.5 g脫脂黑木耳粉于反應(yīng)釜，按一定的液料比、提取溫度、提取時(shí)間、提取壓力，對(duì)黑木耳進(jìn)行多糖提取。提取液于4 000 r/min離心20 min，取上清液55℃濃縮至原體積1/5后，加入5倍體積的體積分?jǐn)?shù)95%乙醇，靜置24 h后離心（4 000 r/min，20 min）得到多糖沉淀，然后利用Sevage法［10］除去蛋白質(zhì)，利用體積分?jǐn)?shù)30%的過(guò)氧化氫進(jìn)行脫色，得到木耳多糖粗品。

1.3.2 多糖含量的測(cè)定 精確吸取0，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6 mL 100 μg/mL的葡萄糖溶液于試管中，并用蒸餾水將其補(bǔ)至2.0 mL。加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%苯酚1.0 mL，迅速滴加濃硫酸5.0 mL，搖勻振蕩均勻后于沸水浴中15 min，冷卻5 min，在490 nm處測(cè)定吸光度［11-12］。以2.0 mL蒸餾水按照相同顯色操作（作為空白試驗(yàn)）。繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。

1.3.3 多糖提取率的計(jì)算 測(cè)定方法同1.3.2，根據(jù)得到的吸光值，利用葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算木耳多糖含量C，然后利用如下方程計(jì)算多糖提取率Y。

式（1）中，Y為多糖提取率，%；C為多糖質(zhì)量濃度，g/mL；V為提取液體積，mL；W為木耳粉質(zhì)量，g。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

1）液料比對(duì)木耳多糖提取率的影響：準(zhǔn)確稱取2.0 g脫脂木耳粉，按液料比50∶1，75∶1，100∶1，125∶1，150∶1，175∶1（mL/g）加入蒸餾水，在溫度120℃，壓力1.0 MPa條件下提取25 min，將提取液離心取上清液，測(cè)定多糖提取率。

2）溫度對(duì)木耳多糖提取率的影響：準(zhǔn)確稱取2.0 g脫脂木耳粉，按液料比125∶1（mL/g）加入蒸餾水，分別在溫度110、120、130、140、150、160℃，壓力1.0 MPa條件下提取25 min，將提取液離心取上清液，測(cè)定多糖提取率。

3）時(shí)間對(duì)木耳多糖提取率的影響：準(zhǔn)確稱取2.0 g脫脂木耳粉，按液料比125∶1（mL/g）加入蒸餾水，在溫度150℃，壓力1.0 MPa條件下分別提取5、10、15、20、25、30 min，將提取液離心取上清液，測(cè)定多糖提取率。

4）壓力對(duì)木耳多糖提取率的影響：準(zhǔn)確稱取2.0 g脫脂木耳粉，按液料比125∶1（mL/g）加入蒸餾水，在溫度150℃，壓力分別為0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 MPa條件下提取25 min，將提取液離心取上清液，測(cè)定多糖提取率。

1.3.5 響應(yīng)面分析試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，應(yīng)用響應(yīng)面分析法對(duì)提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。選取對(duì)木耳多糖提取率影響較大的3個(gè)因素：溫度、時(shí)間及液料比。通過(guò)Design Expert 8.0軟件，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，對(duì)提取工藝進(jìn)行響應(yīng)面分析。分析因素和水平設(shè)計(jì)如表1所示。

表1 響應(yīng)面分析試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels used in response surface analysis

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

利用苯酚-硫酸法測(cè)得的葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Glucose standard curve

回歸方程為：y=0.008 9x+0.009 1，方程的擬合度R2=0.995 9，在0～80 mg/L內(nèi)滿足線性關(guān)系。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 液料比對(duì)多糖提取率的影響 由圖2可知，隨著液料比的升高，多糖的提取率也隨之增加，當(dāng)液料比達(dá)到125（mL/g）時(shí)，多糖提取率為7.45%，之后液料比升高對(duì)多糖提取率的影響較小。這是因?yàn)檫m宜的液料比有利于萃取過(guò)程的順利進(jìn)行，液料比太小會(huì)導(dǎo)致物料密度較大，不利于與提取溶劑的接觸，理論上隨著液料比的增加，物料與提取溶劑的接觸面積增加，提取率隨之增高，但是當(dāng)液料比增加到一定程度，降低了提取液的固形物含量，不利于以后的分離，且加重了工業(yè)生產(chǎn)的后續(xù)工藝。

圖2 液料比對(duì)多糖提取率的影響Fig.2 Effectofliquid-solid ratio on the yield of polysaccharide

2.2.2 提取溫度對(duì)多糖提取率的影響 由圖3可知，隨著溫度的升高，多糖的提取率顯著增加，這與Li B，應(yīng)麗亞等人的研究結(jié)果一致，溫度是亞臨界水萃取技術(shù)中影響最大的參數(shù)［13-14］。當(dāng)溫度達(dá)到150℃時(shí)，多糖提取率達(dá)到最高22.18%。這是因?yàn)閬喤R界水作為萃取劑，在一定壓力下其極性隨著溫度的升高而降低，黏度降低，表面張力減小，所以出現(xiàn)了隨著溫度的升高，多糖提取率逐漸增加的現(xiàn)象。但當(dāng)溫度達(dá)到150℃以上時(shí)，多糖提取率反而下降，可能是由于溫度太高導(dǎo)致多糖降解，降低了多糖提取率。

圖3 溫度對(duì)多糖提取率的影響Fig. 3 Effect of temperature on the yield of polysaccharide

2.2.3 提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響 由圖4可知，在時(shí)間5～25 min之內(nèi)，多糖的提取率有較大幅度提升，在25 min之后，曲線趨于平緩，提取率僅從24.51%提高至24.75%，增長(zhǎng)幅度較小。這是由于亞臨界水在高溫和高壓下具有強(qiáng)烈的溶解能力，可以在短時(shí)間內(nèi)完成提取過(guò)程，延長(zhǎng)提取時(shí)間不會(huì)明顯增加溶質(zhì)的量，反而可能導(dǎo)致多糖物質(zhì)分解。

圖4 提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響Fig.4 Effect of extraction time on the yield of polysaccharide

2.2.4 提取壓力對(duì)多糖提取率的影響 亞臨界水萃取的壓力遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于超臨界萃取所需的高壓要求，只需要維持在使水保持液體狀態(tài)即可。由圖5可知，隨著壓力的升高，多糖的提取率整體呈先增加后減少的趨勢(shì)，在壓力為1.0 MPa時(shí)，多糖提取率達(dá)到最高為20.16%，但是壓力的變化對(duì)多糖提取率的影響較小，這是因?yàn)樵趤喤R界水提取過(guò)程中，壓力只是用來(lái)讓水處于液體狀態(tài)，它的變化對(duì)水的極性影響很小，所以壓力對(duì)提取效果影響不大，這與之前相關(guān)的研究結(jié)果一致［15-16］。

圖5 壓力對(duì)多糖提取率的影響Fig.5 Effect of extraction pressure on the yield of polysaccharide

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化工藝條件

試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2，其中試驗(yàn)號(hào)2、7、8、11、17為中心試驗(yàn)，其余為析因試驗(yàn)。以多糖提取率（Y）為響應(yīng)值，各因素經(jīng)回歸擬合后，得二次多項(xiàng)回歸方程為

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments

表3為回歸模型方差分析結(jié)果，從中可以看出該模型回歸顯著（P＜0.000 1），R2=0.992 9，失擬項(xiàng)不顯著，說(shuō)明該模型與實(shí)際實(shí)驗(yàn)擬合程度較好，可用上述回歸方程描述各因子與響應(yīng)值的關(guān)系，對(duì)木耳多糖提取率進(jìn)行預(yù)測(cè)。各項(xiàng)的P值（A：0.000 8，B：＜0.000 1，C：＜0.000 1）可以說(shuō)明各因子對(duì)多糖提取率影響顯著；從各項(xiàng)的 F值（A：32.06，B：65.92，C：138.77）可以看出，在所選的各因素水平范圍內(nèi)，對(duì)木耳多糖提取率影響大小的順序?yàn)椋簻囟龋疽毫媳龋咎崛r(shí)間。

表3 回歸模型方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance for the fitted regression model

根據(jù)圖6（a）（d），可以從圖形的弧面及等高線變化的密集程度看出液料比對(duì)多糖提取率的影響比提取時(shí)間的影響明顯，且液料比與提取時(shí)間不存在明顯的相互作用，即1個(gè)因素對(duì)多糖提取率的影響作用并不會(huì)隨著另一因素的變化而變化。從圖6（b）（e）可以看出，提取溫度對(duì)多糖提取率的影響大于提取時(shí)間，且兩因素之間存在較強(qiáng)的相互作用。從圖（c）（f）可以看出，提取溫度對(duì)多糖提取率的影響高于液料比，且兩者不存在明顯的相互作用。

圖6 各因素交互作用的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface plots for the effects of three process conditions on the extraction yield of polysaccharide

結(jié)合回歸模型分析結(jié)果可知，亞臨界水萃取法提取木耳多糖的最佳工藝條件為：提取溫度152.31℃，提取時(shí)間26.07 min，液料比130.79∶1（mL/g），提取壓力1.0 MPa，木耳多糖提取率為24.51%。為驗(yàn)證此方法的結(jié)果，并考慮實(shí)際可操作性，將最佳工藝參數(shù)修正為：提取溫度152℃，提取時(shí)間26 min，料液比131（mL/g），提取壓力1.0 MPa進(jìn)行多糖提取的驗(yàn)證試驗(yàn)，經(jīng)3次平行試驗(yàn)，實(shí)際得率分別為24.22%、24.16%及 24.32%，實(shí)際得率平均值為24.23%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與模型符合良好，說(shuō)明該模型能較好地預(yù)測(cè)木耳多糖得率。

2.4 亞臨界水萃取法與不同提取方法對(duì)比試驗(yàn)

參照前人的研究方法，在本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表4?？梢钥闯?，利用亞臨界水萃取法得到的多糖提取率顯著高于其他提取方法，分別比水浸提法提高了382%，比酶提取法提高144%，比微波輔助法提高49%，比超聲波輔助法提高48%；而一般的復(fù)合方法，例如超聲波協(xié)同酶解法得到的多糖提取率為16.8%［21］，超聲波微波協(xié)同輔助熱水浸提法的多糖提取率為31.92%［22］，雖然多糖提取率較高，但是復(fù)合方法的提取工序復(fù)雜繁瑣，成本高，不利于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，從而限制了木耳多糖的開(kāi)發(fā)利用。綜上，經(jīng)過(guò)優(yōu)化的亞臨界水萃取法是提取木耳多糖的最佳方法。

3 結(jié)語(yǔ)

將亞臨界水萃取技術(shù)應(yīng)用于黑木耳多糖的提取，并用響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，采用合理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，依據(jù)回歸分析確定各因素對(duì)多糖得率的影響，最終確定了木耳多糖的最佳提取工藝：提取溫度152℃，提取時(shí)間26 min，液料比131∶1（mL/g），提取壓力1.0 MPa。在此工藝條件下，木耳多糖的實(shí)際提取率為24.23%。與之前關(guān)于木耳多糖提取的研究相比，節(jié)能省時(shí)，大幅度提高了提取率，為木耳多糖的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和研究奠定了基礎(chǔ)，是一種極具發(fā)展空間的綠色技術(shù)。

表4 亞臨界水萃取法與其他提取法提取率對(duì)比Table 4 Comparison of Sub-critical water extraction and different extraction methods

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Optimization of Subcritical Water Extraction of Polysaccharides from Auricularia auricular by Response Surface Methodology

BAO Yihong1，2， DENG Qi1
（1.School of Forestry，Northeast Forestry University，Harbin 150040，China；2.Collaborative Innovation Center for Development and Utilization of Forest Resources，Harbin 150040，China）

The optimization of subcritical water extraction of polysaccharides from Auricularia auricular was investigated by response surface methodology （RSM）.The effect of extraction condition on the yield of polysaccharies in Auricularia auricular powder was studied，including temperature，extraction duration，liquid-solid ratio and pressure.The content of polysaccharide was determined using phenol-sulfuric acid colorimetry.A Box-Behnken design was used to achieve the best extraction procedure based on the results of single-factor experiments.The comparison of different extraction methods was also done.The optimized extraction procedure was performed by 131∶1 of liquid-solid ratio at 152℃ for 26 min under the pressure of 1.0 MPa with the polysacchariesn yield of 24.51%.The yield of polysacchariesn was significantly increased using the proposed subcritical water extraction procedure，which was 3.82 fold of that extracted by traditional hot water method.This study provides a high-efficiency and eco-friendly method for industrial production of polysaccharides from Auricularia auricular.

S 759

A

1673—1689（2016）010—1053—08

2015-01-30

國(guó)家“十二五”科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD34B04）。

包怡紅（1970—），女，黑龍江哈爾濱人，工學(xué)博士，教授，主要從事林下經(jīng)濟(jì)資源研究。E-mail：baoyihong@163.com