何玲 劉露 陳國俊

1.貴州省黔南州人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，貴州都勻558000；

2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬一；神經(jīng)病學(xué)重點實驗室，重慶400016

多聚左旋賴氨酸對大腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)的影響

何玲1，2劉露2陳國俊2

1.貴州省黔南州人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，貴州都勻558000；

2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬一；神經(jīng)病學(xué)重點實驗室，重慶400016

目的探討不同濃度多聚左旋賴氨酸（PLL）對體外培養(yǎng)大腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞（AS）的影響。方法采用酶消法、差速貼壁獲得大腦皮層AS細(xì)胞，細(xì)胞分為四組，分別種植于對照組（未包被PLL）、25μg/mL PLL包被組、50μg/mL PLL包被組、100μg/mL PLL包被組包被的培養(yǎng)瓶或板內(nèi)，運用細(xì)胞計數(shù)檢測細(xì)胞貼壁率及CCK檢測法繪制原代細(xì)胞生長曲線；待細(xì)胞鋪滿瓶底，予振蕩及傳代法去除其他類型細(xì)胞。第三代AS，通過膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）兔疫熒光計數(shù)細(xì)胞純度及CCK檢測細(xì)胞活性。結(jié)果細(xì)胞貼壁率隨PLL包被濃度的增加而增加；原代AS生長曲線顯示對照組生長速度較三組PLL包被組慢；除100μg/mL PLL包被組［（90±0.53）%］外，其余各組細(xì)胞純化率均大于95%；對照組第4、6天細(xì)胞活性均明顯低于各PLL包被組，差異均有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論PLL能有效地促進(jìn)AS的貼壁和生長，適宜包被濃度為25～50μg/mL。

星型膠質(zhì)細(xì)胞；體外培養(yǎng)；多聚左旋賴氨酸；免疫熒光；膠質(zhì)纖維酸性蛋白

隨著近年對大腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞（AS）的研究發(fā)現(xiàn)，AS以積極主動的方式參與調(diào)控突觸傳遞，在突觸重塑及學(xué)習(xí)記憶過程中起著重要的作用［1-2］。電生理技術(shù)的發(fā)展，也讓人們了解到，AS存在著許多離子通道［3］，與神經(jīng)元之間進(jìn)行著積極的雙向信息交流［4］。因此，對AS的深入研究在神經(jīng)退行性疾病如阿爾茨海默病中得到了進(jìn)一步的重視［5-6］。多聚左旋賴氨酸（PLL）是常用的包被基質(zhì)之一，可促進(jìn)細(xì)胞黏附、增生、分化［7］。對體外培養(yǎng)AS中是否使用PLL等促細(xì)胞黏附的包被基質(zhì)，以及PLL工作濃度，各文獻(xiàn)報道差異較大，本研究比較了文獻(xiàn)中PLL幾種常用包被濃度［8-10］，并通過檢測細(xì)胞貼壁率、純度、活性以進(jìn)一步探討其對體外培養(yǎng)AS的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

新生1～3日齡斯普拉格-杜勒鼠（SD）大鼠（動物合格證號：SCXK渝：2012-0001），雌雄不限，由重慶醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供。

1.2 儀器及試劑

CO2恒溫敷箱（Thermo fisher science，美國），倒置顯微鏡（Olympus，日本），多功能酶標(biāo)儀（Tecan，奧地利），恒溫?fù)u床振蕩儀（上海天呈科技有限公司），激光掃描共聚焦顯微鏡（Leica，德國），熒光顯微鏡（Olympus，日本）；DMEM高糖培養(yǎng)液（Gibco，美國），胎牛血清（Gibco，美國），多聚賴氨酸（Sigma，美國），Primocin（Invitrogen，美國），膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）兔抗大鼠多克隆抗體（Sigma，美國），F(xiàn)ITC山羊抗兔二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），CCK-8檢測試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 實驗分組實驗設(shè)為對照組（無PLL包被）、25μg/mL PLL包被組、50μg/m L PLL包被組、100μg/m L PLL包被組。原代前1 d將不同濃度PLL包被于25 cm2培養(yǎng)瓶或不同規(guī)格孔板中，次日吸出PLL放于無菌超凈臺備用。

1.3.2 星型膠質(zhì)細(xì)胞的分離培養(yǎng)參照文獻(xiàn)［11］的方法并適當(dāng)改進(jìn)。新生1～3日齡SD大鼠，消毒后斷頭取腦，剪碎腦組織，加入0.25%胰蛋白酶，37℃下消化18 min，加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基終止胰酶反應(yīng)，輕輕反復(fù)吹打成細(xì)胞懸液，400目篩過濾，收集該單細(xì)胞懸液，800 r/min離心5min，按2.5×105個/mL密度接種至未涂PLL的75 cm2的培養(yǎng)瓶中，移入CO2敷箱，37℃、5%CO2下培養(yǎng)20 min［12］，輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶。吸出細(xì)胞懸液按密度1.5×105個/mL分別接種到不同濃度PLL包被的25 cm2培養(yǎng)瓶中。自第3天起，予15%胎牛血清培養(yǎng)基（含primocin 100μg/mL），每3 d換液1次，培養(yǎng)至9～12 d，細(xì)胞鋪滿瓶底，置于37℃恒溫?fù)u床中，200 r/min振蕩18 h［13］。另按上述細(xì)胞接種密度接種于不同濃度PLL包被的24孔板及96孔板中。

1.3.3 臺盼藍(lán)活細(xì)胞計數(shù)檢測原代各PLL包被組細(xì)胞的貼壁率培養(yǎng)3 d后的細(xì)胞，消化獲得單細(xì)胞懸液，0.4%臺盼藍(lán)染色后計數(shù)細(xì)胞，每孔重復(fù)3次，取平均值。貼壁率=（貼壁細(xì)胞數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）×100%。

1.3.4 CCK檢測法繪制原代細(xì)胞生長曲線初次分離的原代細(xì)胞，按密度為1×104個/孔接種于96孔板中。分別在2、4、6、8、10、12 d，加入10μL的CCK-8溶液，混勻，孵育2 h后，后用酶標(biāo)儀在450 nm處掃描吸光度，記錄OD450值。連續(xù)12 d于同一時間點進(jìn)行觀察，每組設(shè)3個復(fù)孔。

1.3.5 傳代培養(yǎng)過夜振蕩細(xì)胞予0.25%的胰酶消化，按5×104個/m L接種后放入敷箱中孵育達(dá)85%融合度后再次傳代。

1.3.6 免疫熒光鑒定GFAP是AS的標(biāo)志性蛋白［14］，第三代AS以2.5×104個/mL接種于放有細(xì)胞爬片的24孔板中，孵育48 h，4%多聚甲醛4℃固定30min，山羊血清37℃封閉1 h，滴加一抗兔抗大鼠GFAP多抗（1∶100），4℃過夜，另設(shè)PBS代替一抗作為陰性對照。次日，1∶200山羊抗兔FITC熒光二抗，37℃避光孵育1 h，PBS沖洗3次，每次5 min，予DAPI復(fù)染細(xì)胞核3min?？篃晒獯銣缫悍馄?，激光共聚焦顯微鏡觀察AS形態(tài)；在熒光顯微鏡下觀察，每組各取4張爬片，每張爬片4個象限分別隨機選取3個200倍視野計數(shù)，取均值，計算綠色熒光陽性細(xì)胞百分比，即AS的純化率。

1.4 傳代情況及CCK法檢測不同濃度PLL包被組第三代AS細(xì)胞活性

同樣用CCK法檢測傳至第三代各PLL包被組細(xì)胞活性，每2天檢測1次，連續(xù)6 d于同一時間點進(jìn)行觀察，每組設(shè)3個復(fù)孔。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料用率表示，組間比較采用x2檢驗；多組間比較采用單因素方差分析；采用Student-Neuman-Keuls（SNK）法進(jìn)行多重比較；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 原代細(xì)胞貼壁率

對照組細(xì)胞貼壁率［（75.15±0.07）%］顯低于25μg/mLPLL包被組［（91.87±0.10）%］、50μg/mL PLL包被組［（94.44±0.07）%］、100μg/mL PLL包被組［（97.79±0.11）%］，差異均有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；25μg/mL PLL包被組細(xì)胞貼壁率與50μg/mL PLL包被組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；100μg/mL PLL包被組貼壁率最高，與25μg/mL PLL包被組及50μg/mL PLL包被組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示細(xì)胞貼壁率隨PLL包被濃度的升高而增大。

2.2 原代培養(yǎng)生長情況及各組細(xì)胞生長曲線

初次分離的AS接種后24 h后即可見折光度較好的貼壁細(xì)胞，接種后4 d內(nèi)生長緩慢，第6天，25μg/m L PLL包被組、50μg/mL PLL包被組、100μg/mL PLL包被組細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期。而對照組在第8天左右進(jìn)入對數(shù)生長期，各PLL包被組細(xì)胞生長曲線見圖1。接種后8～12 d，鏡下見AS呈“毛氈毯”樣，處于底層，其他類型細(xì)胞呈點狀分布在該層上。經(jīng)搖床過夜振蕩，AS與其他細(xì)胞分離，以梭狀及多角形為主，細(xì)胞邊緣較模糊，突起不明顯。見圖2。

圖1 不同濃度PLL包被組AS的生長曲線

圖2 普通光學(xué)顯微鏡下的原代星型膠質(zhì)細(xì)胞（200×）

2.3 免疫熒光鑒定AS及不同濃度PLL包被組AS純度的比較

第三代AS，倒置顯微鏡下可見細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，胞漿豐富且密度較低，核/漿比例小，胞核呈橢圓形，偏向于胞體一側(cè)；GFAP細(xì)胞兔疫熒光法鑒定，激光共聚集顯微鏡下見AS胞質(zhì)呈綠色熒光，核藍(lán)染，見圖3。各PLL包被組AS純化率見圖4，100μg/mL PLL包被組純化率［（90.00±0.53）%］低于對照組［（96.00± 0.63）%］、25μg/m L PLL包被組［（97.00±0.57）%］、50μg/m L PLL包被組［（98.00±0.77）%］，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；對照組、25μg/mL PLL包被組、50μg/mL PLL包被組AS純化率兩兩比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖3 AS免疫熒光染色（400×）

圖4 不同濃度PLL包被組AS純化率比較

2.4 AS傳代情況及不同濃度PLL包被組第三代AS細(xì)胞活性

傳代后細(xì)胞生長速度較原代快，第一代及第二代AS，各PLL包被組細(xì)胞均能在4 d進(jìn)入對數(shù)生長期，6 d達(dá)85%～90%的融合度。傳至第三代，對照組細(xì)胞貼壁后生長緩慢，各PLL包被組細(xì)胞仍保持前兩代的增殖速度。各PLL包被組第三代AS在第2、4、6天活性比較見圖5、表1。

圖5 不同濃度PLL包被組第三代AS活性的比較

表1 不同濃度PLL包被組第三代AS活性的比較，n=3）

表1 不同濃度PLL包被組第三代AS活性的比較，n=3）

注：與對照組同期比較，*P＜0.01；PLL：多聚左旋賴氨酸；AS：星型膠質(zhì)細(xì)胞

組別第2天第4天第6天對照組25μg/m L PLL包被組50μg/mLPLL包被組100μg/m L PLL包被組P值0.49±0.07 0.51±0.05 0.50±0.07 0.50±0.05＞0.05 0.64±0.06 0.99±0.06*1.00±0.06*1.04±0.08*＜0.01 0.72±0.06 1.02±0.07*1.04±0.08*1.06±0.07*＜0.01

3 討論

體外培養(yǎng)AS是進(jìn)行神經(jīng)科學(xué)研究的基礎(chǔ)。本實驗中選取出生1～3 d的新生鼠，一方面因為出生后的神經(jīng)元不再分裂，從而可減少神經(jīng)元的污染［15］，另一方面因出生1～3 d的新生鼠，腦溝腦回形成不明顯，其腦膜及血管較易剝離。實驗中盡可能剝離血管及腦膜，是減少成纖維細(xì)胞污染的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［16］。

預(yù)包被PLL后，細(xì)胞貼壁率高且原代生長周期少于無PLL包被組，在8～9 d即呈“毛氈毯”樣鋪滿底層，與文獻(xiàn)中提到的較適宜的時間相一致［17］。原代細(xì)胞在前4 d生長緩慢，所需營養(yǎng)相對較少，故本實驗接種血清濃度為10%，以減少對細(xì)胞貼壁的影響，3 d后第1次換液，則改為15%血清濃度培養(yǎng)細(xì)胞，以滿足快速增殖細(xì)胞的營養(yǎng)。

激光共聚焦顯微鏡下清楚的觀察到第三代AS的細(xì)胞形態(tài)，與其他文獻(xiàn)中報道的AS形態(tài)一致［18］。通過熒光顯微鏡計算各PLL包被組細(xì)胞AS純度，除100μg/mL PLL包被組外，其余三組細(xì)胞均能達(dá)95%的純化率，其主要原因考慮為高濃度PLL讓原代大腦皮層各類細(xì)胞均牢固貼壁，導(dǎo)致在振蕩環(huán)節(jié)中，AS單層上的雜細(xì)胞不易被去除。有文獻(xiàn)報道［19］，在每次傳代前均進(jìn)入搖床，加速振蕩及增加傳代次數(shù)也可進(jìn)一步去除雜細(xì)胞。

利用AS較強的增殖活性，多次傳代可去除少突膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞等細(xì)胞，通常用于實驗的AS為傳至第三代及第四代的細(xì)胞［20］。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，對照組細(xì)胞前2次傳代，尚能保持和其他PLL包被組的傳代速率，在傳至第三代時，對照組細(xì)胞增殖緩慢且活性較低。因此，通過包被PLL來促進(jìn)細(xì)胞早期貼壁，對傳代后AS細(xì)胞活性有著重要的作用。

本研究結(jié)果表明，PLL預(yù)包被能提高AS貼壁和生長狀態(tài)，其中25～50μg/mL PLL包被濃度為適宜濃度，無PLL包被可影響細(xì)胞的存活率及活性，較大濃度PLL包被可影響AS的純化率。

［1］Chung W，Clarke LE，Wang GX，et al.Astrocytesmediate synapse elimination through MEGF10 and MERTK pathways［J］.Nature，2013，504（7480）：394-400.

［2］Han X，Chen M，Wang F，et al.Forebrain engraftment by human glial progenitor cells enhances synaptic plasticity and learning in adultmice［J］.Cell Stem Cell，2013，12（3）：342-353.

［3］D'Ascenzo M，Vairano M，Andreassi C，et al.Electrophysiological and molecular evidence of L-（Cav1），N-（Cav2.2），and R-（Cav2.3）type Ca2+channels in rat cortical astrocytes［J］.Glia，2004，45（4）：354-363.

［4］Dallerac G，Chever O，Rouach N.How do astrocytes shape synaptic transmission？Insights from electrophysiology［J］. Front Cell Neurosci，2013，7（159）：1-19.

［5］Tian C，Zheng JC.Reprogrammed Astrocytes as a Potential therapy for neurodegenerative disorders［J］.Science，2011，334（6063 Suppl）：53-54.

［6］Birch AM.The contribution of astrocytes to Alzheimer's disease［J］.Biochem Soc Trans，2014，42（5）：1316-1320.

［7］Cai L，Lu J，Sheen V，et al.Optimal poly（L-lysine）grafting density in hydrogels for promoting neural progenitor cell functions［J］.Biomacromolecules，2012，13（5）：1663-1674.

［8］Ronco V，Grolla AA，Glasnov TN，et al.Differential deregulation of astrocytic calcium signalling by amyloid-β，TNF-α，IL-1βand LPS［J］.Cell Calcium，2014，55（4）：219-229.

［9］Ma Y，Qin P，F(xiàn)eng D，et al.Estrogen regulates the expression of Ndrg2 in astrocytes［J］.Brain Research，2014，4（1569）：1-8.

［10］Guo J，Duckles SP，Weiss JH，et al.17β-Estradiol prevents cell death and mitochondrial dysfunction by an estrogen receptor-dependentmechanism in astrocytes after oxygen-glucose deprivation/reperfusion［J］.Free Radical Biology and Medicine，2012，52（11-12）：2151-2160.

［11］Mccarthy KD，de Vellis J.Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue［J］.JCell Biol，1980，85（3）：890-902.

［12］周欣，明曉云，康頌建，等.差速貼壁技術(shù)對大鼠腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞純化率的影響［J］.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2007，11（15）：2829-2831.［13］Chen C，Kuo J，Wong A，etal.Estradiolmodulates translocator protein（TSPO）and steroid acute regulatory protein（StAR）via protein kinase A（PKA）signaling in hypothalamic astrocytes［J］.Endocrinology，2014，155（8）：2976-2985.

［14］Yang Z，Wang KK.Glial fibrillary acidic protein：from intermediate filament assembly and gliosis to neurobiomarker［J］.Trends Neurosci，2015，38（6）：364-374.

［15］Imura T，Kornblum HI，Sofroniew MV.The predominant neural stem cell isolated from postnatal and adult forebrain butnotearlyembryonic forebrain expressesGFAP［J］. JNeurosci，2003，23（7）：2824-2832.

［16］Ullian EM，Sapperstein SK，Christopherson KS，et al. Control of synapse number by glia［J］.Science，2001，291（5504）：657-661.

［17］Kuo J，Hamid N，Bondar G，et al.Membrane estrogen receptors stimulate intracellular calcium release and progesterone synthesis in hypothalamic astrocytes［J］.Journal of Neuroscience，2010，30（39）：12 950-12 957.

［18］周曼，楊萬超，劉翔，等.大鼠腦星形膠質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)方法的改進(jìn)及鑒定［J］.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2014，48（2）：91-94.

［19］Talia FR，Sigal FB.Protein synthesis dependent effects of kinins on astrocyte prostaglandin synthesis［J］.Peptides，2010，31（4）：651-656.

［20］錢騰達(dá)，張斌，劉彥，等.再程序化星形膠質(zhì)細(xì)胞的制備及體外定向分化為神經(jīng)元的研究［J］.臨床神經(jīng)外科雜志，2015，12（4）：256-264.

Effection of poly-L-lysine on cultures of cerebral cortical astrocytes in vitro

HE Ling1，2LU Liu2CHEN Guojun2
1.Department of Neurology，the People's Hospital of Qiannan，Guizhou Province，Duyun 558000，China；2.Key Laboratory of Neurology，the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China

Objective To investigate the effects of different concentrations of poly-L-lysine（PLL）on the cultures of cerebra lcorticalastrocytes（AS）in vitro.M ethods Astrocytes were dissociated from cerebra lcorticeswith themethods of trypsinization and differential adherence.They were divided into four groups and respectively planted in culture flasks or plateswhich coated PLL of different concentrations:control group（non-PLL），25μg/mL PLL envelop group，50μg/mL PLL envelop group，100μg/mL PLL envelop group.Adherent rates were detected by counted number and cell growth curveswere drawn with CCK-8 colorimeter.To remove other cell types，the cellswere shaken and passaged when they were confluent in amonolay on the bottom.Puritieswere assessed by immune of luorescence analysis of glial fibrillate acidic protein（GFAP）and cell viabilitiesweremeasured by CCK-8 colorimeter in the third generation astrocytes.Results Adherent rates were increased in a dose-dependent manner.Growth curves showed that the growth speed of control group was significantly slower than three PLL envelop groups.The purities of all groups were over 95%except 100μg/mL PLL envelop group［（90.00±0.53）%］.The cell activities of control group on the fourth day and the sixth day both were lower than three PLL envelop groups，the differences were statistially signifiant（P＜0.01）. Conclusion PLL-coated technique can effectively promote adhesion and growth of AS，and the best coated concentrations are 25-50μg/mL.

Astrocyte；In vitro；Poly-L-lysine；Immunofluorescence；Glial fibrillary acidic protein

Q 421

A

1673-7210（2016）05（a）-0004-05

2016-02-05本文編輯：任念）

國家自然科學(xué)基金資助項目（812101097）。

何玲（1979-），女，博士；研究方向：阿爾茨海默病。