陳博 謝琳

1.廣東醫(yī)科大學(xué)東莞校區(qū)生理科學(xué)實(shí)驗(yàn)室，廣東東莞523808；

2.廣東醫(yī)科大學(xué)東莞校區(qū)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東東莞523808

蛙血清小分子肽的分離鑒定及生物活性檢測(cè)

陳博1謝琳2▲

1.廣東醫(yī)科大學(xué)東莞校區(qū)生理科學(xué)實(shí)驗(yàn)室，廣東東莞523808；

2.廣東醫(yī)科大學(xué)東莞校區(qū)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東東莞523808

目的分離和鑒定蛙血清去蛋白提取物中的小分子肽，檢測(cè)其生物活性。方法用超濾法收集蛙血清中相對(duì)分子質(zhì)量為1000～3000的組分；用RP-HPLC對(duì)超濾組分進(jìn)行分離純化；用串聯(lián)質(zhì)譜法分析鑒定小分子肽的分子質(zhì)量；用呼吸檢壓儀測(cè)定并計(jì)算肝細(xì)胞呼吸活性和刺激指數(shù)。結(jié)果將相對(duì)分子質(zhì)量為1638的小分子肽的二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)經(jīng)處理后在數(shù)據(jù)庫(kù)搜索，沒(méi)有搜索到相關(guān)肽的信息，可能是新發(fā)現(xiàn)的肽。呼吸活性檢測(cè)顯示小分子肽有很強(qiáng)的呼吸活性，氧系數(shù)（QO2）≥4.0μLO2/（mg·h），刺激指數(shù)（SI）≥2.5，強(qiáng)于小牛血清去蛋白注射液。結(jié)論蛙血清小分子肽是一種新發(fā)現(xiàn)的肽，相對(duì)分子質(zhì)量為1638，其藥效可能優(yōu)于小牛血清去蛋白注射液。

蛙血清；小分子肽；呼吸活性

研究表明，動(dòng)物血清的主要藥理活性成分是小分子肽［1］。筆者的前期研究發(fā)現(xiàn)蛙血清去蛋白提取物能提高心、腦組織對(duì)缺氧的耐受力［2］，能保護(hù)心、腦缺血再灌注損傷［3-4］，說(shuō)明其含有對(duì)心腦缺血缺氧性損傷有保護(hù)作用的小分子肽類(lèi)物質(zhì)。因此，本研究從蛙血清去蛋白提取物中分離并純化其中的小分子肽，鑒定小分子肽的分子質(zhì)量，以期確定其分子結(jié)構(gòu)和名稱，并通過(guò)測(cè)定和計(jì)算小分子肽的呼吸活性和刺激指數(shù)（SI），探討該小分子肽的藥效。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性豚鼠1只，體重250～350 g，由廣東醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［合格證號(hào)：SYXK（粵）2013-0007］。

1.2 藥品試劑

色譜純乙腈（北京匯海科儀科技有限公司）；三氟乙酸（TFA，Sigma公司）；10%氫氧化鈉溶液（分析純，廣州化學(xué)試劑廠）；Soerensen緩沖液（0.0667 mol/L）：稱取磷酸氫二鈉（Na2HPO4·2H2O，分析純，廣州化學(xué)試劑廠）9.72 g和磷酸二氫鉀（KH2PO4，分析純，廣州化學(xué)試劑廠）1.65 g加雙蒸水至1000 m L，磷酸調(diào)pH值到7.4；Brodie測(cè)壓液：取氯化鈉（分析純，廣州化學(xué)試劑廠）23 g，牛膽酸鈉（分析純，北京化學(xué)試劑公司）5 g，伊文蘭（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）100mg，加雙蒸水至500mL；小牛血清去蛋白注射液（參考對(duì)照藥，錦州奧鴻藥業(yè)有限公司，規(guī)格：5mL∶0.2 g）。

1.3 儀器設(shè)備

光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）；Ultraflex TOF/ TOF型MALDI-TOFMass（Matrix-assisted Laser Desorption/ioniza-tion time-of-flight）質(zhì)譜儀（德國(guó)Bruker）；MILLIPORE8400超濾杯（MILLIPORE），RMM1000和RMM3000超濾膜（MILLIPORE）；SKW-3微量呼吸檢壓儀器（上海大學(xué)）；YQ3型高速勻漿機(jī)（江蘇江陰縣祝塘儀器廠）；恒溫水浴箱（余姚電訊儀表實(shí)業(yè)公司）；旋渦混勻器（江蘇海門(mén)麒麟醫(yī)用儀器廠）。

1.4 蛙血清小分子肽的分離和鑒定

1.4.1 超濾蛙血離心取上清，乙醇去蛋白，蒸餾回收乙醇，得蛙血清去蛋白提取物。將其倒入超濾杯中進(jìn)行超濾［5］。用截留相對(duì)分子質(zhì)量為3000的超濾膜超濾，收集濾過(guò)液，再用截留相對(duì)分子質(zhì)量為1000的超濾膜超濾，收集濾膜上保留液，低溫保存。

1.4.2 RP-HPLC分離純化分離柱：Sepax C18柱；洗脫液A為0.1%三氟乙酸（TFA）/H2O，洗脫液B為0.1%三氟乙酸（TFA）/乙腈；流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為215 nm，柱溫箱溫度為40℃。每次上樣100μL，收集洗脫峰，用質(zhì)譜儀鑒定洗脫峰中物質(zhì)的分子量［6］。

1.4.3 質(zhì)譜分析在MALDI-TOF/TOF Mass質(zhì)譜儀上進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜（MS）和串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）分析［6］。CCA基質(zhì)：0.1%TFA、50%ACN、50%H2O。取1μL樣品與3μLCCA基質(zhì)混合均勻，取0.5μL混合液在按規(guī)律分別在板上點(diǎn)樣，風(fēng)干后送入機(jī)內(nèi)檢測(cè)。MS：正離子檢測(cè)模式，離子源加速電壓為20 kV，N2激光波長(zhǎng)337 nm，脈沖寬度3 ns，離子延遲提取150 ns，真空度4×10-7Torr。轉(zhuǎn)化MS/MS模式后，將滿足MS的離子進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析，MS/MS模式的m/z范圍為0～3000。

1.4.4 小分子肽的鑒定用Mascot軟件的串級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)和序列標(biāo)簽進(jìn)行搜索鑒定［8］。

1.5 蛙血清小分子肽呼吸活性的測(cè)定

1.5.1 肝勻漿的制備雄性豚鼠1只，體重295 g，禁食24 h后頸椎脫臼處死，頸動(dòng)脈放血，開(kāi)腹取出肝臟，置冰水浴中的Soerensen緩沖液中。稱取5.5 g的肝臟，并切割為大小相同的7塊，每塊用7 mL的Soerensen緩沖液勻漿。以上操作均在冰水浴中進(jìn)行。

1.5.2 測(cè)定方法把測(cè)壓計(jì)和反應(yīng)瓶洗凈，干燥。裝好測(cè)壓液于測(cè)壓計(jì)內(nèi)，調(diào)節(jié)液面至150 mm。準(zhǔn)備供校正用溫壓計(jì)1套，空白組裝置2套，對(duì)照組裝置2套和供試品組裝置2套。每個(gè)反應(yīng)瓶中間小杯（內(nèi)含1小濾紙條）加10%氫氧化鈉溶液0.2mL。除供校正用溫壓計(jì)反應(yīng)瓶只加Soerensen緩沖液2.5 m L外，其他每個(gè)反應(yīng)瓶中均加入Soerensen緩沖液1.lmL和肝勻漿1.0 mL?？瞻捉M瓶中再加入Soerensen緩沖液0.2 m L，對(duì)照組瓶中加入?yún)⒖紝?duì)照藥小牛血清去蛋白注射液0.2mL［9］，供試品組瓶中加入蛙血清小分子肽0.2mL。

將裝好的密閉反應(yīng)瓶與測(cè)壓計(jì)相連，置37℃恒溫水浴中。將測(cè)壓計(jì)右側(cè)柱液面調(diào)至150mm，記下左側(cè)液面初讀數(shù)（A），反應(yīng)30min后將測(cè)壓計(jì)右側(cè)柱液面再調(diào)至150mm，記下左側(cè)液面讀數(shù)（B）。重復(fù)上述操作，進(jìn)行下一個(gè)30 min的反應(yīng)并記下左側(cè)液面初讀數(shù)（C）及30min后的液面讀數(shù)（D）。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中須觀察供校正用溫壓計(jì)的壓力的變化（ΔC），以消除試驗(yàn)過(guò)程中溫度及大氣壓的影響［10］。取2.0mL肝勻漿，置恒重的裝有海沙的稱量瓶中，110℃干燥至恒重，計(jì)算兩次的重量差ΔW（mg）。

1.5.3 計(jì)算呼吸活性計(jì)算公式［11］：QO2［μLO2/（mg·h）］=［（A-B+C-D）×K1-ΔC×K2］/G×I。公式中：QO2為氧系數(shù)；A、B、C、D為測(cè)壓計(jì)的讀數(shù)；K1為空白或樣品的反應(yīng)瓶常數(shù)；K2為溫壓計(jì)的反應(yīng)瓶常數(shù)；ΔC為校正溫壓計(jì)的體積變化；G為每l毫升肝勻漿的干重，G=ΔW/2-9.3，9.3為Soerensen緩沖液的干重，單位mg；I為反應(yīng)時(shí)間，單位h。

K1、K2計(jì)算公式為：｛［（VR+VM）×1000-2500］×273/（273+37）+2500×0.0239｝/10000。公式中：VR為反應(yīng)瓶體積；VM為測(cè)壓計(jì)體積；2500為瓶?jī)?nèi)液體體積（μL）；0.0239為37℃時(shí)氧的溶解度。

試驗(yàn)結(jié)果必須滿足以下條件［12］：對(duì)照品組的QO2≥4.0μLO2/（mg·h）并且SI≥2.5；空白組的QO2≥1.0μLO2/（mg·h）。

2 結(jié)果

2.1 蛙血清超濾組分的RP-HPLC圖譜

蛙血清超濾組分經(jīng)RP-HPLC分離純化，結(jié)果見(jiàn)圖1。215 nm波長(zhǎng)下，有7個(gè)洗脫峰。收集所有的洗脫峰。

2.2 蛙血清超濾組分洗脫峰的質(zhì)譜圖譜

將收集的RP-HPLC洗脫峰成分進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)峰位22min的洗脫峰為高純度肽。22min洗脫峰中相對(duì)分子質(zhì)量為1638的肽的一級(jí)質(zhì)譜圖譜見(jiàn)圖2，其相對(duì)應(yīng)的二級(jí)質(zhì)譜圖譜見(jiàn)圖3。

2.3 蛙血清小分子肽的數(shù)據(jù)庫(kù)搜索鑒定結(jié)果

將相對(duì)分子質(zhì)量為1638的小分子肽的二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)經(jīng)處理后在數(shù)據(jù)庫(kù)搜索，沒(méi)有搜索到相關(guān)肽的信息，可能是新發(fā)現(xiàn)的肽。

圖1 蛙血清相對(duì)分子質(zhì)量1000～3000超濾組分的RP-HPLC圖譜

圖2 蛙血清相對(duì)分子質(zhì)量1000～3000超濾組分RP-HPLC圖譜上22 m in洗脫峰的MS圖譜

圖3 相對(duì)分子質(zhì)量為1638的小分子肽的MS/MS圖譜

2.4 蛙血清小分子肽的呼吸活性測(cè)定結(jié)果

檢測(cè)的空白組、對(duì)照組及5組蛙血清小分子肽樣品結(jié)果見(jiàn)表1，通過(guò)公式計(jì)算，得空白組的耗氧量為2.1［QO2≥1.0μLO2/（mg·h）］，對(duì)照組的耗氧量為6.4［QO2≥4.0μLO2/（mg·h）］，SI 3.0（≥2.5），均滿足試驗(yàn)成功的條件。結(jié)果（表2）顯示：蛙血清小分子肽的刺激指數(shù)大于小牛血清去蛋白注射液，表明蛙血清小分子肽比小牛血清去蛋白注射液的藥效要更好。

表1 溫壓計(jì)、空白組、對(duì)照組和蛙血清小分子肽檢測(cè)結(jié)果

表2 呼吸活性QO2值和刺激指數(shù)SI值

3 討論

血清小分子肽是指血清中所有相對(duì)分子質(zhì)量低于10 000的小分子蛋白質(zhì)片段和多肽集合，具有低抗原等特性使其容易被吸收，并參與到細(xì)胞的新陳代謝中去，促進(jìn)體內(nèi)的新陳代謝［13］。但相對(duì)分子質(zhì)量5000以下的血清小分子肽研究較少［14］，因?yàn)檠逯写蠓肿拥鞍缀扛?，而且還與一些小肽結(jié)合在一起，使得分離純化較難，而相對(duì)分子質(zhì)量在1000～3000的肽含量雖少，但不與大分子蛋白結(jié)合，分離提純比較容易［15］。

本研究選擇兩棲類(lèi)的青蛙的血液進(jìn)行研究，是考慮到蛙在冬眠時(shí)血液流動(dòng)雖然很緩慢甚至停滯，但不會(huì)發(fā)生凝固和栓塞［16］，而秋冬寒冷季節(jié)人們腦梗塞的發(fā)病率更是明顯升高，由此推測(cè)蛙血清中必定含有能維持細(xì)胞能量代謝的肽類(lèi)物質(zhì)，因此本研究在前期研究的基礎(chǔ)上［3］，從蛙血清去蛋白提取物中分離相對(duì)分子質(zhì)量為1000～3000間的小分子肽，鑒定其中純度高的小分子肽的相對(duì)分子質(zhì)量，以期確定其分子結(jié)構(gòu)和名稱。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)蛙血清的研究?jī)H限于在血清生化指標(biāo)方面的檢測(cè)，尚未有在蛙血清中提純小分子肽的相關(guān)研究報(bào)道，更無(wú)相對(duì)分子質(zhì)量在1000～3000的小分子肽的研究。本研究通過(guò)RP-HPLC分離結(jié)果和質(zhì)譜結(jié)果表明，蛙血清相對(duì)分子質(zhì)量為1000～3000超濾組分中含有一種純度高達(dá)99.2%的小分子肽，為22min洗脫峰中相對(duì)分子質(zhì)量為1638的小分子肽，其他的洗脫峰純度都不高，且混合存在多種小分子肽類(lèi)物質(zhì)，即使進(jìn)行研究也無(wú)法說(shuō)明其有效作用成分，所以必須選擇高純度的小分子肽進(jìn)行研究。該小分子肽通過(guò)二級(jí)質(zhì)譜分析，其二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)通過(guò)軟件在蛋白質(zhì)/肽類(lèi)數(shù)據(jù)庫(kù)中未檢索到對(duì)應(yīng)信息，也就是說(shuō)很可能為新發(fā)現(xiàn)的一種小分子肽。研究后期將用Edman降解法測(cè)序，以期能獲得這種小分子肽的氨基酸序列。

血清小分子肽生物活性的檢測(cè)指標(biāo)是呼吸活性和刺激指數(shù)［17］，可以反映出小分子肽對(duì)細(xì)胞的代謝作用［18］。本研究用豚鼠肝細(xì)胞為底物測(cè)定，用呼吸檢壓儀測(cè)定肝勻漿的呼吸活性和刺激指數(shù)。該檢測(cè)系統(tǒng)簡(jiǎn)單靈敏專(zhuān)一，客觀可靠［19］。檢測(cè)結(jié)果顯示，小分子肽的5個(gè)樣品的刺激指數(shù)均符合國(guó)家規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)（SI≥2.5），并且各樣品的小分子肽的刺激指數(shù)均比小牛血清去蛋白注射液的刺激指數(shù)更高，說(shuō)明小分子肽在促進(jìn)細(xì)胞能量代謝和細(xì)胞修復(fù)方面的藥效要優(yōu)于小牛血清去蛋白注射液。

小分子肽類(lèi)藥物使用起來(lái)具有針對(duì)性強(qiáng)、療效顯著、副作用小等優(yōu)點(diǎn)，成為新型藥物開(kāi)發(fā)的重要方向［20］。在本研究中，通過(guò)分離、提純、鑒定，發(fā)現(xiàn)了蛙血清中的一種新的相對(duì)分子質(zhì)量為1638的小分子肽，并檢測(cè)了其呼吸活性和刺激指數(shù)，結(jié)果表明其藥效要優(yōu)于小牛血清去蛋白注射液。因此，若能將其開(kāi)發(fā)應(yīng)用，必定具有很好的社會(huì)效益。

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Isolation and identification and biological activity detection of small molecular peptides in frog serum

CHEN Bo1XIE Lin2▲
1.Laboratory of Physiology Science，Dongguan Campus of Guangdong Medical University，Guangdong Province，Dongguan 523808，China；2.Basic Medical College，Dongguan Campus of Guangdong Medical University，Guangdong Province，Dongguan 523808，China

Ob jective To isolated and identificated of small molecular peptide from the deproteinized frog serum extract，in order to detect its biological activity.Methods Collecting the components with relative molecular weight of 1000-3000 in frog serum was used ultrafiltration；separating and purificating the ultrafiltration components was used RP-HPLC；themolecularweight of smallmolecular peptideswas analyzed and identified by tandem mass spectrometry；the respiratory activity and stimulation index of liver cellsweremeasured and calculated by respiratory pressure detector.Results The second stagemass spectrometry data of smallmolecular peptide with relativemolecular weight of 1638 was disposed，and then itwas searched in the database，there was no relevant peptide information，maybe itwas a new discovery of the peptide.Detection of respiratory activity showed smallmolecular peptides had very strong respiratory activity，oxygen quotient（QO2）≥4.0μLO2/（mg·h），and stimulation index（SI）≥2.5，itwas stronger than in calf serum to protein injection.Conclusion The frog serum small molecular peptide is a newly discovered peptide，the relative molecular weight is 1638，the efficacy of the drug is better than that of calf serum albumin injection.

Frog serum；Smallmolecular peptide；Respiratory activity

R96

A

1673-7210（2016）05（a）-0016-05

2016-02-01本文編輯：蘇暢）

廣東醫(yī)學(xué)院青年基金項(xiàng)目（Q2010003）；廣東醫(yī)學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目（2015ZYDS005）

▲通訊作者