郭海榮，李增山，賀 帥，王小燕，劉 萍

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CD105和ki67在人卵巢癌細(xì)胞中的表達(dá)并確定表達(dá)部位

郭海榮1，李增山2，賀 帥3，王小燕1，劉 萍1

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古 包頭014010；2.第四軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部病理學(xué)教研室，陜西 西安710032；3.包頭醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，內(nèi)蒙古 包頭014060)

目的 檢測CD105和Ki67在人卵巢癌細(xì)胞中的表達(dá)情況及確定其表達(dá)部位。方法 采用Western blot篩選出6種人卵巢癌細(xì)胞系中CD105和Ki67均高表達(dá)的細(xì)胞系；并用免疫熒光染色法明確CD105和Ki67在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)部位。結(jié)果 CD105和Ki67在人卵巢癌OVCAR3細(xì)胞中均高表達(dá)；CD105主要表達(dá)于OVCAR3細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，Ki67主要表達(dá)于OVCAR3細(xì)胞的細(xì)胞核。結(jié)論 人卵巢癌OVCAR3細(xì)胞中CD105和ki67均呈高表達(dá)，CD105定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，ki67定位于細(xì)胞核，為進(jìn)一步研究CD105和ki67在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

CD105；ki67；OVCAR3；Western blot；免疫熒光染色

卵巢上皮癌(ovarian epithelial carcinoma，EOC)是死亡率最高的婦科惡性腫瘤[1]，發(fā)生于盆腔深部，表面沒有包膜，容易發(fā)生轉(zhuǎn)移及種植，大多數(shù)卵巢癌患者發(fā)現(xiàn)時即是晚期，因此，尋找敏感的腫瘤標(biāo)志物，早期發(fā)現(xiàn)腫瘤，是目前卵巢癌研究領(lǐng)域的熱點。所有腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移均離不開新生的毛細(xì)血管，CD105參與了新生毛細(xì)血管的形成，是目前有效的毛細(xì)血管標(biāo)記物[2]，能很好的反映毛細(xì)血管的生長。Ki67是反映腫瘤細(xì)胞增殖的因子，其高表達(dá)與惡性腫瘤的分化、侵襲及預(yù)后密切相關(guān)[3]。以往關(guān)于CD105和Ki67在卵巢癌中的研究多局限于組織水平，本文以人卵巢癌細(xì)胞為研究對象，研究CD105和Ki67在體外培養(yǎng)的人卵巢癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況及定位，為進(jìn)一步研究CD105和ki67對卵巢上皮癌細(xì)胞增殖、凋亡等生物學(xué)活性的影響奠定基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1材料及主要試劑

人上皮性卵巢癌細(xì)胞系OVCAR3、SKOV3TRp2、HIO-180和ES2購自中科院上海細(xì)胞庫；人上皮性卵巢癌細(xì)胞系HeyA8MDR和A2780ip2購自美國組織培養(yǎng)采集中心；RPMI1640培養(yǎng)基(Gibco-BRL)、胎牛血淸(Gaithersburg，MD)、硫酸鏈霉素/氨芐青霉素(Gaithersburg, MD)、兔抗人CD105單克隆抗體(abcam cambridge，UK)、鼠抗人Ki67單克隆抗體(abcam，cambridge，UK)、鼠抗人β-actin單克隆抗體(abcam cambridge，UK)、Western Blot抗兔二抗、抗鼠二抗購自武漢晟亞生物技術(shù)有限公司。PVDF 膜(millipore NY，USA)熒光抗鼠、抗兔二抗(invitrogen NY，USA)，Hoechst33258 染色試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1細(xì)胞的培養(yǎng)

OVCAR3、HeyA8MDR、SKOV3TRp2、A2780ip2、HIO-180及ES2卵巢癌細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基中(FBS濃度為20%，青霉素和鏈霉素各100ng/mL)，置37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中，每隔48h換液1次，待細(xì)胞生長完全融合后，按照1:3的比例傳代或凍存。

1.2.2Western Blot方法檢測各細(xì)胞內(nèi)CD105、Ki67蛋白的表達(dá)

將已完全融合的6孔板細(xì)胞置于冰上，每孔加入2×loading buffer 100μL，混勻，細(xì)胞刮反復(fù)刮下貼壁細(xì)胞移至Ep管內(nèi)，超聲破碎儀裂解細(xì)胞，100℃加熱10min，分裝，-20℃保存?zhèn)溆?。取蛋白樣品?%、8%SDS-PAGE電泳分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，將標(biāo)記好正反面的PVDF膜在脫脂奶粉中封閉30min，PBST清洗3×5min，在正面加一抗，4℃過夜；PBST清洗后在PVDF膜正面加二抗，37℃1h，洗完膜后按1:1加入發(fā)光A、B液，均勻滴于濾膜上，作用5min。在暗室中操作X光片壓片、曝光、顯影、定影。

1.2.3細(xì)胞免疫熒光方法檢測CD105、Ki67均高表達(dá)人卵巢癌細(xì)胞中具體表達(dá)部位

將玻片浸在稀釋的多聚賴氨酸溶液5 min，室溫18℃～26℃過夜干燥后置入6孔板，將完全融合的細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化后制成細(xì)胞懸液，待細(xì)胞達(dá)30%～50%融合后，取出玻片，1×PBS洗滌3次，每次5min，4%多聚甲醛固定15min，1%Triton X-100行破膜處理10min，1×PBS洗滌3次，每次5min，用含5%羊血清的BSA室溫下封閉30min，一抗孵育，4℃過夜，F(xiàn)ITC標(biāo)記的二抗孵育37℃、黑暗環(huán)境2h ，Hoechst33258核染色3min，封片，黑暗環(huán)境中在熒光顯微鏡下觀察。CD105、Ki67的一抗分別按照1:300、1:200稀釋。根據(jù)實驗需要選用相應(yīng)FITc(紅色或綠色熒光)標(biāo)記的二抗，按1:500稀釋，對每張染色片均另外各取2張作陰性對照，分別不加一抗和不加一抗及二抗，以PBS代替。

2結(jié)果

2.1Western Blot檢測實驗結(jié)果

采用Western blot方法分別檢測這6種人卵巢癌細(xì)胞系中CD105、Ki67的蛋白表達(dá)水平的情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：選取的6種癌細(xì)胞中只有OVCAR3細(xì)胞中CD105、Ki67均呈高表達(dá),見圖1。

圖1 6種人卵巢癌細(xì)胞系中CD105、Ki67蛋白表達(dá)情況

Fig.1 The protein expressions of CD105 and Ki67 in six ovarian cancer cell lines

2.2免疫熒光檢測人卵巢癌OVCAR-3細(xì)胞中CD105、Ki67的表達(dá)部位

以往研究發(fā)現(xiàn)，CD105蛋白主要定位于細(xì)胞漿，Ki67蛋白則主要定位于細(xì)胞核內(nèi)。通過第一步實驗可以得知：在選取的6種人卵巢癌細(xì)胞中，只有OVCAR3細(xì)胞中CD105、Ki67蛋白均呈高表達(dá)，為進(jìn)一步驗證這兩種蛋白在人卵巢癌OVCAR3細(xì)胞的表達(dá)及分布情況，應(yīng)用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測，檢測結(jié)果見圖2所示：熒光顯微鏡下可以清晰看到的紅色熒光，表明細(xì)胞與Cy3(紅色)熒光標(biāo)記的抗CD105抗體結(jié)合，與Hoechst33258染核的藍(lán)色熒光組成一個完整的細(xì)胞形態(tài)。熒光顯微鏡下清晰看到的綠色熒光，表明細(xì)胞與FITC(綠色)熒光標(biāo)記的抗Ki67抗體結(jié)合，且與Hoechst33258染核的藍(lán)色熒光完全重合，說明在人卵巢癌OVCAR3細(xì)胞中，CD105主要表達(dá)于細(xì)胞漿和細(xì)胞膜，Ki67則主要表達(dá)于細(xì)胞核。

Cy3-CD105

Hoechst

merged

FITC-Ki67

Hoechst

merged

注：A-1抗人抗體與OVCAR3胞漿上CD105結(jié)合，表現(xiàn)為胞漿內(nèi)散在分布的紅色熒光; A-2 僅用DAPI染細(xì)胞核;A-3用DAPI復(fù)染細(xì)胞核；B-1抗人抗體與OVCAR3細(xì)胞核內(nèi)的Ki67結(jié)合，表現(xiàn)為胞核內(nèi)散在分布的綠色熒光; B-2 僅用DAPI染細(xì)胞核;B-3用DAPI復(fù)染細(xì)胞核。

圖2 CD105、Ki67蛋白在人卵巢癌OVCAR3細(xì)胞的表達(dá)及分布情況(放大倍數(shù)：400)

Fig.2 Expression and distribution of CD105 and Ki67 in human ovarian cancer OVCAR3 cells (×400)

3討論

3.1 對CD105的研究現(xiàn)狀

CD105(endoglin)，分子量180kDa，是由二硫鍵連接的同型二聚體跨膜糖蛋白，更多分布在增殖的內(nèi)皮細(xì)胞。在惡性腫瘤包括卵巢癌，白血病，胃腸道間質(zhì)瘤，黑色素瘤，和喉癌等腫瘤的血管內(nèi)皮高表達(dá)，但很少表達(dá)于非內(nèi)皮細(xì)胞[4-5]。目前國內(nèi)外主要集中在研究腫瘤中CD105作為血管形成分子的角色和它作為腫瘤中微血管密度標(biāo)記的作用[6]。

3.2對Ki67的研究現(xiàn)狀

細(xì)胞增殖是腫瘤發(fā)生發(fā)展的一個重要的因素。Ki67抗原除G0期(細(xì)胞休眠期)，可表達(dá)在所有細(xì)胞周期階段[7-8]。Ki67蛋白表達(dá)對腫瘤預(yù)后的影響及同腫瘤臨床病理特征的關(guān)系提示在多種不同種類的癌癥中起到重要作用[9]。因此Ki67是一個細(xì)胞增殖較為可靠的標(biāo)志。以往的研究顯示Ki67增生指數(shù)同一些癌癥不良的遠(yuǎn)期無病存活和總體存活相關(guān)[10-12]。國外有研究表明，在卵巢惡性腫瘤中，細(xì)胞核內(nèi)Ki67的表達(dá)>30%，預(yù)示Ki67在進(jìn)展期卵巢癌中呈高表達(dá)[13]。

3.3對CD105、Ki67在體外培養(yǎng)人卵巢癌細(xì)胞系中的表達(dá)及部位研究

從上述實驗結(jié)果可以看出，以β-actin為內(nèi)參，所選取的6種體外培養(yǎng)的人卵巢癌細(xì)胞系中，在OVCAR3細(xì)胞中CD105、Ki67蛋白均呈高表達(dá)。據(jù)文獻(xiàn)報道：CD105和Ki67共同強(qiáng)表達(dá)于腫瘤增殖活躍的內(nèi)皮細(xì)胞，在表達(dá)腫瘤細(xì)胞增殖狀態(tài)方面具有統(tǒng)一性[13]。目前CD105及Ki67已經(jīng)被用于多種腫瘤的增殖程度的檢測，臨床上聯(lián)合檢測CD105及Ki67可能對于判斷卵巢癌的惡性程度及預(yù)后有很大的幫助。

本實驗中，采用體外培養(yǎng)人卵巢癌細(xì)胞，檢測CD105及Ki67的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)在OVCAR3細(xì)胞中二者均呈高表達(dá)；并且在OVCAR3細(xì)胞中CD105主要表達(dá)于細(xì)胞漿和細(xì)胞膜，Ki67則主要表達(dá)于細(xì)胞核。與既往在卵巢上皮癌組織病理切片中檢測的CD105及Ki67的表達(dá)部位相符[14]。為下一步實驗提取CD105及Ki67蛋白奠定實驗基礎(chǔ)。

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[專業(yè)責(zé)任編輯：安瑞芳]

Expression and location of CD105 and ki67 in human ovarian cancer cell lines

GUO Hai-rong1, LI Zeng-shan2, HE Shuai3, WANG Xiao-yan1, LIU Ping1

(1.The Third Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University,Inner Mongolia Baotou 014010, China; 2. Department of Pathology,The Fourth Military Medical University，Shaanxi Xi’an 710032；3. Department of Pathology,School of Basic Medical and Forensic Science, Baotou Medical College, Inner Mongolia Baotou 014060, China)

Objective To investigate the expressions of CD105 and ki67 in human ovarian cancer OVCAR3 cell lines and their location. Methods Cell lines with high expressions of CD105 and Ki67 were screened with Western blot from six human ovarian cancer cell lines. Immunofluorescene labelling assay was employed to investigate the location of CD105 and ki67 protein in OVCAR3 ovarian cancer cell lines. Results CD105 and Ki67 were both highly expressed in OVCAR3 cells lines. CD105 was mainly expressed in the cytoplasm and cell membrane, while Ki67 was mainly expressed in the nucleus. Conclusion CD105 and ki67 are highly expressed in human ovarian cancer OVCAR3 cell lines. CD105 is located in the cytoplasm and cell membrane, while Ki67 is located in the nucleus, which lay the foundation for the mechanism study of CD105 and ki67 in the development of human ovarian cancer.

CD105; ki67; OVCAR3; Western blot; immunofluorescence

2015-07-01

內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學(xué)基金資助項目(2012MS1134)

郭海榮(1971-)，女，主任醫(yī)師/碩士生導(dǎo)師，主要從事婦科腫瘤的研究。

劉 萍，教授/主任醫(yī)師。

10.3969/j.issn.1673-5293.2016.09.038

R737.3

A

1673-5293(2016)09-1139-03