張欣 賀曉生

(1第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西 西安 710032; 2解放軍75768部隊衛(wèi)生隊，湖北 襄陽 441500)

·論著·

創(chuàng)傷性腦損傷后Toll樣受體4表達(dá)變化對小鼠海馬區(qū)MYD88mRNA的影響

張欣1,2賀曉生1*

(1第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西 西安 710032;2解放軍75768部隊衛(wèi)生隊，湖北 襄陽 441500)

目的研究創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury, TBI)后抑制Toll樣受體4(Toll-like receptor 4, TLR4)與小鼠海馬區(qū)髓樣分化因子88(myeloid differentiation primary response gene 88, MYD88)mRNA表達(dá)變化以及對小鼠行為變化的關(guān)系。方法采用Mamarou自由落體方法建立小鼠TBI模型，腹腔注射TLR4抑制劑CLI-095，采用實時定量聚合酶鏈(real-time polymerase chain reaction, RT-PCR)反應(yīng)及礦場實驗，高架十字實驗，Morris水迷宮方法檢測創(chuàng)傷72 h后海馬區(qū)MYD88表達(dá)變化情況及行為學(xué)變化特征。結(jié)果模型建立并抑制TLR4后，72 h海馬區(qū)MYD88mRNA表達(dá)量較僅腹腔注射溶劑減少(Plt;0.05)，但處理組及對照組MYD88mRNA表達(dá)量均高于假損傷組(Plt;0.05)。礦場實驗，高架十字實驗，Morris水迷宮檢測TBI后小鼠出現(xiàn)運動水平下降，抑制TLR4后有所好轉(zhuǎn)(Plt;0.05)，但仍低于假損傷組(Plt;0.05)。結(jié)論TBI影響小鼠行為水平，抑制TLR4可下調(diào)MYD88mRNA表達(dá)，并可對小鼠神經(jīng)功能恢復(fù)發(fā)揮一定作用，可能是神經(jīng)損傷修復(fù)的關(guān)鍵因素之一。

創(chuàng)傷性腦損傷; Toll樣受體4; 髓樣分化因子88

髓樣分化因子88(myeloid differentiation primary response gene 88, MYD88)是Toll樣受體(Toll-like receptors, TLRs)下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和促炎基因表達(dá)的關(guān)鍵因子，對炎癥反應(yīng)區(qū)域的白細(xì)胞聚集有重要作用，可破壞血腦屏障(blood brain barrier, BBB)，導(dǎo)致腦水腫和二次腦損傷[1～4]。長期以來，創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury, TBI)都是與MYD88相關(guān)的神經(jīng)科學(xué)研究熱點。TBI具有高致殘、致死率，可對成年哺乳動物造成嚴(yán)重后果，創(chuàng)傷后可伴學(xué)習(xí)記憶能力下降及基本腦功能喪失[5]。TBI后嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)是影響神經(jīng)系統(tǒng)功能及轉(zhuǎn)歸的重要因素，然而TBI后局部炎癥反應(yīng)環(huán)境中有關(guān)MYD88的問題尚未解決。TLRs是病原體識別受體(pathogen-recognition receptors, PRRs)家族[6]，可感知機體微環(huán)境改變，并可被微生物產(chǎn)物釋放的內(nèi)源性配體激活[6]。Toll樣受體4(Toll-like receptor 4, TLR4)是TLRs家族中首個被發(fā)現(xiàn)并被研究的同源體，在損傷后炎癥反應(yīng)中可識別表達(dá)于易感配體中的病原體相關(guān)分子[7]。TLR4通過MYD88依賴途徑和MYD88非依賴途徑發(fā)揮功能[1]。目前MYD88非依賴途徑的研究甚少[2]，大量研究集中在MYD88依賴途徑上，但TBI后干預(yù)腦內(nèi)TLR4表達(dá)對于MYD88的表達(dá)影響及行為學(xué)改變未見報道。因此，本研究應(yīng)用TBI動物模型，通過行為學(xué)檢測和聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)等方法，旨在檢測TBI后，應(yīng)用TLR4抑制劑后小鼠海馬區(qū)MYD88的表達(dá)變化特征，以期進一步探討TBI后兩者之間的關(guān)系，為下一步研究TLR4抑制劑是否對于TBI后神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells, NSCs)的變化產(chǎn)生影響提供理論依據(jù)。

材料與方法

一、主要試劑與設(shè)備

cDNA synthesis kit(丹麥Exiqon公司)，Trizol(美國Thermo Fisher SCIENTIFIC公司)，Primescript RT reagent kit(日本TaKaRa公司)，混合熒光染料SYBR Green master mix kit (丹麥Exiqon公司)，低糖DMEM培養(yǎng)基，其余試劑為國產(chǎn)分析純。

二、動物來源及分組

健康雄性Balb/c小鼠，20～25 g，由第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供。隨機數(shù)表法分為假損傷組(n=24)和TBI組(n=48)，TBI組分為對照組(n=24)和處理組(n=24)。假損傷組及對照組術(shù)后6 h腹腔注射溶劑，處理組術(shù)后6 h腹腔注射CLI-095，其后2 d同一時間點腹腔注射。模型建立過程中3只小鼠死亡，使用另3只遞補。每組采用隨機數(shù)表法均分為3部分，分別進行礦場實驗和高架十字實驗、水迷宮實驗和實時定量PCR檢測，分別用于觀察TBI后小鼠行為學(xué)改變及檢測MYD88 mRNA。

三、TBI模型建立

使用Mamarou自由落體打擊模型建立Balb/c小鼠的TBI模型[9]。1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉，取俯臥位固定頭部，常規(guī)消毒，高溫滅菌器械沿顱骨中線切開頭皮，充分暴露顱骨，于人字縫左側(cè)2 mm，冠狀縫前2 mm處，環(huán)形取骨鉆去除直徑3 mm顱骨，距打擊點上方5cm處釋放330g砝碼，使局部硬腦膜接受3 m/s的打擊，可見打擊處腦挫裂傷，止血并復(fù)位骨瓣，縫合頭皮。假損傷組不予打擊。

四、使用CLI-095

CLI-095購自InvivoGen公司，貨號：tlrl-cli095。將1 mg CLI-095加入1 ml二甲基亞砜(Dimethyl Sulphoxide, DMSO)并充分溶解，取100 μl加入900 μl (Dulbecco's modified eagle medium, DMEM)，濃度為100 μg/ml，-20℃保存，于CLI-095組術(shù)后6 h腹腔注射。溶劑不加CLI-095，余配置及保存同前，于對照組損傷后6 h腹腔注射。

五、實時定量多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time polymerase chain reaction, RT-PCR)

按Trizol說明書提取，各組試驗動物術(shù)后72 h處死，取出左側(cè)海馬。按SYBR Green Master Mix Kit說明書操作，實時定量PCR儀擴增。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)為內(nèi)參照，小鼠MYD88及GAPDH引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，小鼠MYD88及GAPDH引物序列為：MYD88：上游：5'-ATACG GAACCAGCAGAAACAG-3'，下游：5'-TATCAAT GGGGCAGTAGCAGA-3'，GAPDH：上游：5'-CCAC CGATGGCAAATTCC-3'，下游：5'-TGGGAATTCCATT GATGACAAG-3'。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性45 s，52℃退火60 s，72℃延伸90 s。

六、礦場實驗檢測

取100 cm×100 cm×50 cm黑底無蓋木質(zhì)方箱，每個方箱分成等大的4個方箱，正上方2 m處設(shè)攝像機，實驗時四周屏風(fēng)放下，處于安靜弱光環(huán)境中，每個方箱放入一只小鼠。實驗在TBI模型建立后第4 天(72 h后)進行，記錄小鼠15 min內(nèi)運動表現(xiàn)情況。

七、高架十字檢測

實驗設(shè)備為十字形裝置，設(shè)有2個開放臂(長×寬為30 cm×5 cm)和2個相對封閉臂(長×寬×高為30 cm×5 cm×20 cm)，4個臂鏈接處為中央平臺(5 cm×5 cm)，距地面50 cm。各組小鼠置于中央平臺，自由活動5 min，記錄開放臂進入次數(shù)及停留時間。

八、Morris水迷宮(Morris water maze)實驗

實驗設(shè)備為圓形盛水池，直徑約180 cm，水池等分為Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ4個象限，Ⅳ象限距池壁30 cm處有一直徑約10 cm圓形平臺，注水并放入墨汁后使水面高出平臺約2～3 cm。TBI模型處理后第4天(72 h后)測試。水迷宮四周上方放置不同圖形供小鼠定位使用。每天隨機選取一個象限放入小鼠，并開始計時，記錄軌跡及尋找平臺所用時間，小鼠在平臺上停留5 s視為找到平臺，停止計時，該數(shù)據(jù)稱為潛伏期，若1 min找不到平臺則人為引導(dǎo)上平臺30 s強化記憶，此時潛伏期記為60 s。連續(xù)進行4 d，每天4個周期。第5天撤去平臺，記錄60 s內(nèi)在平臺區(qū)域穿梭次數(shù)。

九、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、RT-PCR

假損傷組MYD88 mRNA表達(dá)未見明顯變化，對照組MYD88 mRNA有明顯表達(dá)升高(Plt;0.05)，可見處理組MYD88 mRNA表達(dá)低于對照組(Plt;0.05)，但仍高于假損傷組?？傮w看來，應(yīng)用抑制劑后MYD88 mRNA的表達(dá)趨于下降。說明應(yīng)用CLI-095后MYD88 mRNA的表達(dá)得到明顯抑制(圖1)。

二、礦場實驗

對照組及處理組運動總路程明顯少于假損傷組(Plt;0.05)，但處理組較對照組運動總路程長 (Plt;0.05，圖2)。處理組中央活動時間長于對照組(Plt;0.05)，說明抑制TLR4后小鼠神經(jīng)功能改善(圖3)。

三、高架十字實驗

對照組比處理組進入開放臂次數(shù)及停留時間縮短(Plt;0.05)，假損傷組小鼠進入開放臂次數(shù)及停留時間均明顯長于對照組及處理組(Plt;0.05，表1)。

四、水迷宮實驗

各組小鼠找到平臺的潛伏期及行進軌跡隨訓(xùn)練次數(shù)增多而縮短，說明訓(xùn)練有效。測試1～4 d，對照組潛伏期大于處理組(Plt;0.05)，對照組及處理組潛伏期均大于假損傷組(Plt;0.05)，第4天與第1天比較，三組潛伏期均有減少(圖4)。第5天，處理組穿梭平臺區(qū)域次數(shù)高于對照組(Plt;0.05)，均少于假損傷組(Plt;0.05，圖5)。

圖1 不同組別MYD88 mRNA表達(dá)比較
Fig 1 Comparison of expression of MYD88 mRNA among sham, treatment and control groups

aPlt;0.05,vssham group;bPlt;0.05,vscontrol group.

圖2 不同組別礦場實驗活動路程比較(cm)
Fig 2 Comparison of distance of mice's move in open field test among TBI, sham and control groups (cm)

aPlt;0.05,vssham group；bPlt;0.05,vscontrol group;cPgt;0.05,vssham group

圖3 不同組別在礦場實驗中央活動時間比較(s)
Fig 3 Comparison of time of central activity in open field test between TBI group and sham group(s)

aPlt;0.05,vssham group;bPlt;0.05,vscontrol group.

圖4 TBI組和假損傷組潛伏期比較(s)
Fig 4 Comparison of latent period between TBI group and sham group (s)

圖5 不同組別水迷宮平臺區(qū)域穿梭次數(shù)(次)
Fig 5 Comparison of times of mice crossing the platform among sham, TBI and sham groups

aPlt;0.05,vssham group;bPlt;0.05,vscontrol group.

GroupnEnteringopenarms(times)Enteringopenarms(%)Timesinopenarms(s) Shamgroup89．35±2．2940．25±7．83107．45±12．55 Controlgroup84．16±2．01a15．99±8．83a25．49±10．71a Treatmentgroup85．86±2．39ab28．52±10．25ab51．58±7．15ab

aPlt;0.05,vssham group;bPlt;0.05,vscontrol group.

討 論

TBI長期都是神經(jīng)外科常見危重癥之一，對創(chuàng)傷者生理及心理創(chuàng)傷極大，同時TBI治療及預(yù)后也是神經(jīng)外科診治的重難點。目前認(rèn)為TBI后炎癥反應(yīng)產(chǎn)生的神經(jīng)毒作用可造成二次腦損傷，給TBI治療提出了更大挑戰(zhàn)[5,10,11]。

MYD88是TLRs和白介素-1(interleukin-1, IL-1)家族信號轉(zhuǎn)導(dǎo)非常重要的下游蛋白[2]。TLRs是表達(dá)于先天性免疫系統(tǒng)的模式識別受體家族，能夠識別病原體膜上特定結(jié)構(gòu)域，且在成年小鼠海馬部位高表達(dá)[8]。因此，MYD88對TLRs家族信號通路和促炎基因表達(dá)至關(guān)重要[2～4]。TLRs家族作為PRRs家族之一，對TBI后的病理生理過程有較強感知作用。TLRs中，TLR4的研究開展最早也研究最多，其在激活先天性免疫系統(tǒng)及病原體識別過程中具有重要作用，且介導(dǎo)相關(guān)免疫過程發(fā)展[6]。目前研究已證實MYD88依賴通路是腦損傷后白細(xì)胞聚集關(guān)鍵路徑[1～4]。因此，我們考慮MYD88作為胞膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)者可能在TBI后的炎癥和損傷發(fā)展中扮演重要角色。然而探索TBI后腦內(nèi)MYD88表達(dá)的報道仍很少。

本研究在Balb/c小鼠TBI模型上，通過基因?qū)W和行為學(xué)方法觀察到抑制TLR4后，MYD88mRNA表達(dá)減少，但仍高于假損傷組，表明在創(chuàng)傷下抑制有效，且抑制TLR4后對其下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的表達(dá)有影響。另TBI后，抑制TLR4可在72 h后觀察到小鼠運動水平明顯改善，即隨著TLR4及其下游MYD88表達(dá)量減少，小鼠TBI后認(rèn)知功能有所恢復(fù)。本研究提示：當(dāng)TBI發(fā)生在成年哺乳動物中時，抑制TLR4可造成可能的神經(jīng)發(fā)生，并改善神經(jīng)功能。

在目前實驗條件下，已有包括CLI-095在內(nèi)的多種化合物被證實具有TBI后的神經(jīng)保護及修復(fù)作用，然而迄今對于臨床上TBI患者，尚未報道有藥物或臨床治療方法可達(dá)到更好的神經(jīng)修復(fù)作用，可能源于實驗動物和人類種屬不同，且TBI患者病理生理情況各異等因素[5]。另臨床上TBI患者病情復(fù)雜，并不能用單一的動物模型模擬所有TBI患者[5]，但我們?nèi)阅芸闯鲆种芓LR4后的MYD88mRNA表達(dá)及行為學(xué)水平獲得有效改善。

已有報道TBI后3 d TLR4表達(dá)最高，因此本研究選擇TBI后72 h作為處理及觀察點，以期得到較好實驗結(jié)果[5,8]。

綜上，雖然本研究并未在使用TLR4抑制劑CLI-095直接檢測TLR4表達(dá)，但通過其下游首個分子MYD88可明確看出抑制有效，并分別從基因和行為學(xué)水平，對TBI后小鼠MYD88表達(dá)程度及行為學(xué)特點進行檢測，證實抑制TLR4之后小鼠MYD88水平及行為學(xué)水平均有改善，一定程度上提示了抑制TLR4可能對神經(jīng)修復(fù)具有作用，為下一步研究神經(jīng)修復(fù)及再生提供理論基礎(chǔ)。

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Expressionchangesoftoll-likereceptor4affecthippocampalMYD88mRNAinmousemodelaftertraumaticbraininjury

ZHANGXin1,2,HEXiaosheng1

1DepartmentofNeurosurgery,XijingHospital，F(xiàn)ourthMilitaryMedicalUniversity,Xi'an710032;2HealthTeamof75768TroopsofPLA,Xiangyang441500, China

ObjectiveThe correlation between toll-like receptor 4 (TLR4) and hippocampus myeloid differentiation primary response gene 88 (MYD88) mRNA and changes of behavior in mouse model after traumatic brain injury was discussed.MethodsAdult male Balb/c mice were randomly divided into the sham group, control group and treatment group. The traumatic brain injury (TBI) mouse model was induced by Mamarou weight-drop device. Mice in treatment group were induced by intraperitoneal injection of CLI-095. MYD88 mRNA was detected by real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) and the changes of behavior were detected by Morris water maze, open field test and elevated plus maze at 72 h after TBI.ResultsIt was observed that the expression of MYD88 mRNA after CLI-095 injection was lower than that after the solvent injection (Plt;0.05), but the expressions were both higher than those of the sham group (Plt;0.05). In the Morris water maze, open field test and elevated plus maze, the motor function decreased after TBI, which was improved after the inhibition of TLR4 (Plt;0.05), but it was still lower than that of sham group (Plt;0.05).ConclusionTBI can affect the behaviors of mice but the expression of MYD88 mRNA could become lower by inhibition of TLR4. TLR4 inhibition plays an important role in the recovery of neural function after TBI and it may be one of the key factors in the repair of neural injury.

Traumatic brain injury; Toll-like receptor 4; Myeloid differentiation primary response gene 88

1671-2897(2016)15-033-04

R 651

A

國家自然科學(xué)基金資助項目(81171155)

張欣，在讀研究生，E-mail: heartychang@163.com

*通訊作者：賀曉生，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，E-mail: hexiaos@fmmu.edu.cn

2015-12-10；

2016-01-06)