崔勇 張風(fēng)林 鮑晶 應(yīng)奇* 胡國(guó)漢 駱純 盧亦成

(1解放軍第411醫(yī)院神經(jīng)外科，上海 200081; 2第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)征醫(yī)院，上海市神經(jīng)外科研究所，上海 200003)

·腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤研究·

RNA干擾AKT2的表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤裸鼠移植瘤替莫唑胺敏感性的影響

崔勇1張風(fēng)林1鮑晶1應(yīng)奇1*胡國(guó)漢2駱純2盧亦成2

(1解放軍第411醫(yī)院神經(jīng)外科，上海 200081;2第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)征醫(yī)院，上海市神經(jīng)外科研究所，上海 200003)

目的研究RNA干擾絲/蘇氨酸蛋白激酶2 (AKT2)對(duì)腦膠質(zhì)瘤移植瘤的替莫唑胺療效的改變。方法構(gòu)建膠質(zhì)瘤裸鼠成瘤模型，瘤內(nèi)注射和腹腔內(nèi)給替莫唑胺(TMZ)藥物，以替莫唑胺化療藥物和AKT2短發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA(AKT2-shRNA)表達(dá)載體對(duì)成瘤后的裸鼠瘤體進(jìn)行聯(lián)合干預(yù)治療，進(jìn)而觀察并測(cè)量各組裸鼠腫瘤體積大小。DNA斷裂的原位末端標(biāo)記法(TUNEL)測(cè)定并計(jì)算分析各組裸鼠成瘤后腫瘤組織細(xì)胞的凋亡的變化。結(jié)果空白對(duì)照組、替莫唑胺化療組、TMZ+陰性對(duì)照組、TMZ+AKT2干擾組裸鼠瘤體體積分別為：(669.34±98.73)mm3、(399.86±55.26)mm3、(383.81±34.01)mm3、(297.72±41.49)mm3；瘤體質(zhì)量分別為：(1.25±0.26)g、(0.72±0.11)g、(0.69±0.07)g、(0.52±0.07)g。TMZ+AKT2干擾組其腫瘤體積及瘤體質(zhì)量都明顯小于空白對(duì)照組、替莫唑胺組和TMZ+陰性對(duì)照組，有顯著性差異(Plt;0.05)。TUNEL實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：空白對(duì)照組、替莫唑胺化療組、TMZ+陰性對(duì)照組、TMZ+AKT2干擾組裸鼠瘤體凋亡指數(shù)分別為：7.15%±1.04%、25.26%±2.71%、26.63%±3.46%、42.81%±5.97%。TMZ+AKT2干擾組其腫瘤凋亡情況明顯高于空白對(duì)照組、替莫唑胺組和TMZ+陰性對(duì)照組，結(jié)果有顯著性差異(Plt;0.05)。結(jié)論RNA干擾AKT2能夠顯著提高裸鼠膠質(zhì)母細(xì)胞瘤對(duì)TMZ化療的敏感性。

絲/ 蘇氨酸蛋白激酶2; 膠質(zhì)瘤; 替莫唑胺

替莫唑胺(temozolomide, TMZ)已成為臨床上腦膠質(zhì)瘤一線化療藥物。聯(lián)用替莫唑胺與生物靶向藥物以提高療效和降低毒性反應(yīng)是近年來(lái)最為活躍的研究領(lǐng)域之一。通過(guò)不同途徑聯(lián)合作用于膠質(zhì)瘤細(xì)胞可能提高化療敏感性。本研究先將前期實(shí)驗(yàn)構(gòu)造的絲/蘇氨酸蛋白激酶2 (serine/ threonine kinase β, AKT2)短發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA(AKT2-shRNA)通過(guò)瘤內(nèi)注射的方式轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞株，在裸鼠體內(nèi)環(huán)境中以研究轉(zhuǎn)染AKT2-shRNA能否提高膠質(zhì)瘤細(xì)胞株對(duì)化療藥物替莫唑胺敏感性。為后續(xù)研究AKT2改變TMZ對(duì)腦膠質(zhì)瘤化療療效的分子機(jī)理打下理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

材料與方法

一、主要實(shí)驗(yàn)材料和試劑

慢病毒介導(dǎo)的AKT2-shRNA表達(dá)載體由中科院上海生命科學(xué)院協(xié)助構(gòu)建。腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞購(gòu)自中科院上海生化與細(xì)胞所細(xì)胞庫(kù)，以含10%新生胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液(Dulbecco's modified Eagle's medium, DMEM)中培養(yǎng)。shRNA試劑盒購(gòu)于Invitrogen公司。兔抗人AKT2單克隆抗體購(gòu)自臺(tái)灣Abnova公司。替莫唑胺藥物由天士力公司提供。

二、細(xì)胞的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U251細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)70%，將AKT2-shRNA轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞。同時(shí)轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)特異性的shRNA(GFP-shRNA)作陰性對(duì)照。

三、裸鼠培養(yǎng)及成瘤

使用無(wú)特定病原體(specefic pathogen free, SPF)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)環(huán)境中的繁殖，在室溫下對(duì)裸鼠適用的是26～28℃，相對(duì)溫度保持在40%～60%。每天保持10 h，14 h，無(wú)光暗周期。2 w后觀察40只裸鼠約0.7 cm2腫瘤結(jié)節(jié)直徑為標(biāo)準(zhǔn)。

四、細(xì)胞接種、藥物干預(yù)

在SPF環(huán)境超凈工作臺(tái)內(nèi)，充分混勻細(xì)胞懸液，用無(wú)菌注射器吸取0.2 ml細(xì)胞懸液(U251細(xì)胞1×107/ml)。將裸鼠固定，75%酒精常規(guī)消毒裸鼠腹股溝皮膚，皮下注射。接種第20天左右開(kāi)始，選取成瘤大小0.7 cm左右成瘤標(biāo)準(zhǔn)裸鼠24只，隨機(jī)分組分四組。每3天給藥1次，共6次。具體分組及操作方法如下：①空白對(duì)照組：每只裸鼠注射入300 μl生理鹽水。②替莫唑胺藥物組：按40 mg/kg/d/劑量，每只裸鼠注射入300 μl替莫唑胺稀釋液。③替莫唑胺藥物+陰性對(duì)照病毒共同作用組：按40 mg/kg/d/劑量，每只裸鼠注射入300 μl替莫唑胺稀釋液和陰性病毒液稀釋液。④替莫唑胺藥物+AKT2-shRNA共同作用組：按40 mg/kg/d/劑量，每只裸鼠注射入300 μl替莫唑胺稀釋液和AKT2-shRNA病毒液。裸鼠腹腔部位局部皮膚碘伏消毒。將稀釋液緩慢注射入腹腔，連續(xù)3次。裸鼠成瘤后重新計(jì)算時(shí)間，第1天按組給藥，每3天藥物干預(yù)1次并用游標(biāo)卡尺測(cè)量一次腫瘤長(zhǎng)徑及短徑，做好記錄。共藥物干預(yù)6次，16 d。停藥1 w后，即藥物干預(yù)后第23天處死所有實(shí)驗(yàn)裸鼠，并取出瘤體，腫瘤測(cè)量大小，稱(chēng)重。同時(shí)將瘤體按分組編號(hào)放好拍照。腫瘤抑制率=(對(duì)照組瘤體體積-處理組瘤體體積)/對(duì)照組瘤體體積。瘤體積增長(zhǎng)率=(瘤體終體積-瘤體初體積)/瘤體初體積。腫瘤體積立方毫米(= 0.5236×長(zhǎng)×短徑×寬)。

五、TUNEL實(shí)驗(yàn)步驟

將組織切片置于染色缸中,用二甲苯洗兩次，每次5 min。用無(wú)水乙醇洗兩次，每次3 min。用95%和75%乙醇各洗一次，每次3 min。用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)洗5 min 加入蛋白酶K溶液(20 μg/ml)，于室溫水解15 min，去除組織蛋白。用蒸餾水洗4次，每次2 min。在樣本上滴加100 μl DNase I反應(yīng)液，室溫條件下反應(yīng)30 min后，PBS沖洗5 min，沖洗3次。每個(gè)樣品再滴加50 μl末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT) 反應(yīng)液，放入濕盒內(nèi)，室溫37℃條件避光反應(yīng)1 h。反應(yīng)后1X PBS漂洗三次，避光操作，每次5 min。每個(gè)樣品上滴加50 μl四甲基異硫氰酸羅丹明 (tetramethyl rhodamin isothiocyanate, TRITC)標(biāo)記的鏈霉素親和素(streptavidin)工作液，放入濕盒內(nèi)，室溫37℃條件反應(yīng)1 h。反應(yīng)后再次1×PBS漂洗5 min，重復(fù)漂洗3次。4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)染色復(fù)染細(xì)胞核，10 min，室溫條件下。洗去DAPI染液后滴加適量體積比封片劑(甘油：PBS=6：4)，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)中處死裸鼠時(shí)，測(cè)量體積稱(chēng)重，數(shù)據(jù)顯示：空白對(duì)照組、替莫唑胺化療組、TMZ+陰性對(duì)照組、TMZ+AKT2干擾組裸鼠瘤體體積分別為：(669.34±98.73)mm3、(399.86±55.26)mm3、(383.81±34.01)mm3、(297.72±41.49)mm3；質(zhì)量分別為：(1.25±0.26)g、(0.72±0.11)g、(0.69±0.07)g、(0.52±0.07)g。TMZ+AKT2干擾組其腫瘤體積、質(zhì)量都小于其他三組，有顯著性差異(Plt;0.05)(圖1, 2)。

二、TUNEL檢測(cè)結(jié)果

TUNEL實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：空白對(duì)照組、替莫唑胺藥物組、TMZ+陰性對(duì)照組、TMZ+AKT2干擾組裸鼠瘤體凋亡指數(shù)分別為：7.15%±1.04%、25.26%±2.71%、26.63%±3.46%、42.81%±5.97%。TMZ+AKT2干擾組其腫瘤凋亡情況明顯高于空白對(duì)照組、替莫唑胺化療組和TMZ+陰性對(duì)照組，有顯著性差異(Plt;0.05)。

圖1 藥物干預(yù)后裸鼠瘤體的變化

Fig 1 Growth of implanted tumor cells was monitored by tumor volume

A: Blank control groups; B: TMZ groups; C: TMZ+Negative control groups; D: TMZ+AKT2-shRNA groups.

圖2 瘤體體積增長(zhǎng)曲線變化圖

Fig 2 The changes of tumor volume

aPlt;0.05,vscontrol groups.

圖3 TUNEL檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況

Fig 3 The apoptosis of each groups detected by TUNEL

A: Blank control groups; B: TMZ groups; C: TMZ+Negative control groups; D: TMZ +AKT2-shRNA groups.

GroupsTumormass(g)Tumorvolume(mm3)Inhibitionrate(%)Apoptosisindex(%) Blankcontrolgroups1．25±0．26669．34±98．737．15±1．04 TMZgroups0．72±0．11399．86±55．2641．72±0．7125．26±2．71 TMZ+Negativecontrol0．69±0．07383．81±34．0144．67±2．8226．63±3．46 TMZ+AKT2?shRNA0．52±0．07a297．72±41．49a58．14±3．13a42．81±5．97a

aPlt;0.05,vsControl groups.

討 論

人腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最為常見(jiàn)的原發(fā)性惡性腦腫瘤，發(fā)病率在所有腦瘤中達(dá)到70%以上[1]。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma, GBM)，是一種高度惡性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，是人類(lèi)最具有侵襲性的腫瘤之一，在WHO腫瘤臨床分級(jí)中定為IV級(jí)，其惡性級(jí)別最高。新一代烷化劑替莫唑胺是目前對(duì)腦瘤GBM的標(biāo)準(zhǔn)化療藥物，在GBM的化療治療中發(fā)揮著重要作用[2～4]。并已被證明有著良好的臨床治療效果。但由于傳統(tǒng)的手術(shù)治療，及術(shù)后的化療和放療仍存在很大的局限性，所以GBM患者的中位生存時(shí)間只有14.6個(gè)月左右[5]。當(dāng)下研究并尋求針對(duì)膠質(zhì)瘤更好的治療策略改善提高患者生活質(zhì)量并延長(zhǎng)患者生存時(shí)間顯得尤為重要。

有研究表明AKT2基因在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲等多個(gè)方面起著很重要的作用[6,7]。同時(shí)，還有研究研究報(bào)告AKT2基因的表達(dá)程度和膠質(zhì)瘤惡性程度正相關(guān)，并且與患者的生存時(shí)間呈負(fù)相關(guān)性[8]。近年來(lái)有研究者實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，AKT活化可能參與腫瘤放射治療的抵抗，研究結(jié)果表明AKT似乎是一個(gè)有效的克服膠質(zhì)瘤治療抵抗重要靶標(biāo)[9]。在過(guò)去的幾十年里，不斷研究PI3K/AKT信號(hào)通路和參與在膠質(zhì)瘤和其他癌癥過(guò)程中的各種生物制劑，許多PI3K抑制劑已被開(kāi)發(fā)。他們中的一部分已經(jīng)被用來(lái)探索克服癌細(xì)胞的抗放療和化療能力。

本部分實(shí)驗(yàn)中，我們通過(guò)TUNEL實(shí)驗(yàn)觀察到TMZ化療+AKT2-shRNA干擾組較其他組相比，裸鼠膠質(zhì)瘤瘤體體積、瘤體質(zhì)量指標(biāo)、腫瘤抑制率和凋亡指數(shù)都發(fā)生了相應(yīng)的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出替莫唑胺藥物化療聯(lián)合轉(zhuǎn)染AKT2-shRNA與單純替莫唑胺化療相比可進(jìn)一步減緩腫瘤的生長(zhǎng)增殖速度并能促進(jìn)腫瘤凋亡，因而在一定程度上提高了替莫唑胺化療的敏感性，部分的克服了U251細(xì)胞對(duì)替莫唑胺的化療耐藥。

本研究只是為將來(lái)臨床上膠質(zhì)瘤患者替莫唑胺化療提供了一個(gè)新的思路，實(shí)驗(yàn)研究中AKT2表達(dá)下調(diào)的程度仍遠(yuǎn)未達(dá)到神經(jīng)外科臨床的標(biāo)準(zhǔn)，這可能與轉(zhuǎn)染慢病毒載體半衰期短、轉(zhuǎn)染進(jìn)入裸鼠移植瘤和腫瘤細(xì)胞的不均一性等原因有關(guān)。還有慢病毒轉(zhuǎn)染到患者身上的毒副作用等因素。這些實(shí)驗(yàn)研究要真正投入到神經(jīng)外科臨床應(yīng)用可能還有很多事情要去做。

1Ricard D, Idbaih A, Ducray F, et al. Primary brain tumours in adults [J]. Lancet, 2012, 379(9830): 1984-1996.

2Hart MG, Grant R, Garside R, et al. Temozolomide for high grade glioma [J]. Cochrane Database Syst Rev, 2013, 4: CD007415.

3Kim YH, Kim T, Joo JD, et al. Survival benefit of levetiracetam in patients treated with concomitant chemoradiotherapy and adjuvant chemotherapy with temozolomide for glioblastoma multiforme [J]. Cancer, 2015, 121(17): 2926-2932.

4趙鶯, 丁文秀, 尹小祥, 等. 替莫唑胺聯(lián)合調(diào)強(qiáng)放療治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤術(shù)后殘留臨床研究 [J]. 中華神經(jīng)外科疾病研究雜志, 2015, 14(4): 334-337.

5Van Meir EG, Hadjipanayis CG, Norden AD, et al. Exciting new advances in neuro-oncology:the avenue to a cure for malignant glioma [J]. CA Cancer J Clin, 2010, 60(3): 166-193.

6Pu P, Kang C, Li J, et al. The effects of antisense AKT2 RNA on the inhibition of malignant glioma cell growth in vitro and in vivo [J]. J Neurooncol, 2006, 76(1): 1-11.

7Zhang J, Han L, Zhang A, et al. AKT2 expression is associated with glioma malignantprogression and required for cell survival and invasion [J]. Oncol Rep, 2010, 24(1): 65-72.

8Wang G, Kang C, Pu P. Increased expression of Akt2 and activity of PI3Kand cell proliferation with the ascending of tumor grade of human gliomas [J]. Clin Neurol Neurosurg, 2010, 112(4): 324-327.

9Narayan RS, Fedrigo CA, Stalpers LJ, et al. Targeting the Akt-pathway to improve radiosensitivity in glioblastoma [J]. Curr Pharm Des, 2013, 19(5): 951-957.

AKT2-shRNAaffectsthesensitivityofhumangliomacelllineU251xenograftinnudemicetoTMZ

CUIYong1,ZHANGFenglin1,BAOJing1,YINGQi1,HUGuohan2,LUOChun2,LUYicheng2

1DepartmentofNeurosurgery, 411HospitalofPLA,Shanghai200081;2DepartmentofNeurosurgery,ChangzhengHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200003, China

ObjectiveThe effects of the expression of AKT2 on sensitivity of glioma cell line U251 to Temozolomide (TMZ) are discussed.MethodsU251 cell implanted tumor model in nude mice was established. By the intratumoral injection and intraperitoneal administration, the nude mice tumor was treated with TMZ chemotherapy drugs and AKT2-shRNA expression vector. The nude mice tumor accumulation conditions were observed. DNA in situ end labeling method (TUNEL) was used to analyze the apoptosis of tumor cells in each group.ResultsIn the blank control group, TMZ chemotherapy group, TMZ+ negative control group, and TMZ+AKT2 interference group, nude mice tumor volume were (669.34±98.73)mm3, (399.86±55.26)mm3, (383.81±34.01)mm3, (297.72±41.49)mm3, respectively; tumor weight were (1.25±0.26)g, (0.72±0.11)g, (0.69±0.07)g, (0.52±0.07)g, respectively. In TMZ+AKT2 interference group, the tumor volume and tumor weight were significantly less than those of the blank control group and negative control group, and there was significant difference (Plt;0.05). TUNEL experimental results showed that in blank control group, TMZ chemotherapy group, the TMZ+negative control group, TMZ+AKT2 interference body apoptosis index group of tumor were (7.15±1.04)%, (25.26±2.71)%, (26.63±3.46)%, (42.81±5.97)%, respectively. In TMZ+AKT2 interference group the apoptosis was significantly higher than that of the blank control group and negative control group, and there was significant difference (Plt;0.05).ConclusionRNA interference of AKT2 can significantly improve the sensitivity of glioma chemotherapy to TMZ.

AKT2; Glioblastoma; TMZ

1671-2897(2016)15-393-04

R 739

A

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30930094)

崔勇，主治醫(yī)師，博士，E-mail: ben_cuiyong@126.com

*通訊作者： 應(yīng)奇，副主任醫(yī)師， E-mail: yingqi411@126.com

2016-01-30；

2016-04-05)