何璐 郭亮 胡春洪 虞正權(quán) 惠國(guó)禎*

(蘇州大學(xué)第一附屬醫(yī)院: 1醫(yī)學(xué)影像科; 2神經(jīng)外科，江蘇 蘇州 215006)

·論著·

垂體腺瘤MRI Knosp分級(jí)與Ki-67、p53、MMP-9的相關(guān)性分析

何璐1郭亮1胡春洪1虞正權(quán)2惠國(guó)禎2*

(蘇州大學(xué)第一附屬醫(yī)院:1醫(yī)學(xué)影像科;2神經(jīng)外科，江蘇 蘇州 215006)

目的檢測(cè)增殖細(xì)胞核抗原Ki67(Ki-67)、抑癌基因p53(p53)及基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)在侵襲性及非侵襲性垂體瘤中的表達(dá)變化，探討它們與Knosp分級(jí)的相關(guān)性。方法選用垂體瘤179例，根據(jù)Knosp分級(jí)分為侵襲性組(n=91)和非侵襲性組(n=88)，應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè)標(biāo)本中Ki-67、p53及MMP-9的表達(dá)情況。結(jié)果p53、Ki-67和MMP-9在Knosp分級(jí)Ⅲ級(jí)以上組中顯著增高(Plt;0.01)。結(jié)論Ki-67、 p53和MMP-9表達(dá)與Knosp分級(jí)呈正相關(guān)。

垂體瘤; Knosp分級(jí); 增殖細(xì)胞核抗原Ki67; 抑癌基因p53; 基質(zhì)金屬蛋白酶-9

垂體瘤是顱內(nèi)常見(jiàn)的腫瘤之一，約占顱內(nèi)腫瘤的10%左右，垂體瘤在形態(tài)上屬于良性腫瘤，但有部分腫瘤呈侵襲性生長(zhǎng)。侵襲性垂體瘤約占垂體瘤總數(shù)的6%～17%。侵襲性垂體瘤具有高增殖性、呈侵襲性生長(zhǎng)、低治愈率及高復(fù)發(fā)率的特點(diǎn)，因此探究腫瘤的侵襲性標(biāo)記是近來(lái)研究的熱點(diǎn)。Knosp等根據(jù)垂體瘤冠狀位MRI海綿竇受侵犯的程度提出了Knosp分級(jí)法，是目前常用的垂體瘤分級(jí)方法。我們應(yīng)用免疫組化方法，分別檢測(cè)標(biāo)本中Ki-67、p53及基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metallo preteinases-9, MMP-9)的表達(dá)情況，并分析它們與Knosp分級(jí)的相關(guān)性，以期對(duì)垂體瘤的診斷及治療提供更多幫助。

對(duì)象與方法

一、一般資料

選取了2011年1月至2015年12月蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科治療的垂體瘤病例共179例，年齡15到85歲。其中，男性94例，女性85 例，平均年齡(52.52±15.02)歲。所有樣本均經(jīng)組織學(xué)檢查。

二、臨床表現(xiàn)

主要癥狀是非特異性頭痛，視力、視野缺損，性功能減退、性欲下降。20例女性患者還有月經(jīng)量減少、閉經(jīng)、溢乳等癥狀。

三、影像學(xué)檢查

侵襲性垂體瘤的判斷標(biāo)準(zhǔn)按照Knosp分級(jí)法。術(shù)前根據(jù)MRI海綿竇是否有明確侵犯，依照Knosp分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)分為五級(jí)：①0級(jí)，海綿竇未受侵，腫瘤局限在鞍內(nèi)及頸內(nèi)動(dòng)脈內(nèi)側(cè)壁連線內(nèi)；②Ⅰ級(jí)，腫瘤位于頸內(nèi)動(dòng)脈連線之內(nèi)，內(nèi)側(cè)靜脈叢受侵已消失；③Ⅱ級(jí)，腫瘤位于頸內(nèi)動(dòng)脈外側(cè)壁連線內(nèi)側(cè)，內(nèi)側(cè)和上方或下方的靜脈叢已消失；④Ⅲ級(jí)，腫瘤長(zhǎng)到頸內(nèi)動(dòng)脈外側(cè)壁連線外側(cè)，突到海綿竇外，海綿竇內(nèi)各靜脈叢消失，海綿竇外側(cè)腔消失；⑤Ⅳ級(jí)，海綿竇內(nèi)頸內(nèi)動(dòng)脈被腫瘤包裹，靜脈叢消失。腫瘤包繞頸內(nèi)動(dòng)脈達(dá)67%以上、海綿竇累及即可確診侵襲性垂體瘤。因此，Knosp分級(jí)0～Ⅱ級(jí)屬于非侵襲性，Ⅲ～Ⅳ級(jí)屬于侵襲性。

四、治療

179例患者均接受經(jīng)鼻蝶竇顯微外科手術(shù)治療。術(shù)中根據(jù)腫瘤的發(fā)展方向、鞍膈下降、質(zhì)地等進(jìn)行判斷，盡量全切腫瘤。術(shù)后無(wú)腦脊液鼻漏、感染、死亡病例。術(shù)后病理顯示179例患者均為垂體腺瘤。

五、免疫組化試驗(yàn)方法

采用免疫組化二步法檢測(cè)，兔抗人增殖細(xì)胞核抗原Ki-67(Ki-67)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)和小鼠抗人抑癌基因p53(p53)單克隆一抗及多克隆二抗均購(gòu)自上?；蛏锛夹g(shù)公司代理DAKO公司產(chǎn)品。以磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution)代替一抗作陰性對(duì)照，已知陽(yáng)性片作為陽(yáng)性對(duì)照，光學(xué)顯微鏡觀察著色反應(yīng)。Ki-67陽(yáng)性表達(dá)于細(xì)胞核，p53陽(yáng)性表達(dá)于細(xì)核，MMP-9陽(yáng)性表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜。應(yīng)用羅氏公司全自動(dòng)免疫組化儀檢測(cè)結(jié)果。陽(yáng)性細(xì)胞的陽(yáng)性強(qiáng)度按無(wú)著色、淡黃色、棕黃色及棕褐色打分為0、1、2、3分。著色陽(yáng)性細(xì)胞按無(wú)著色、著色0%～30%、gt;30%～60%、gt;60%～100%分別打0、1、2、3分。兩項(xiàng)打分之和：0～1分為陰性，2分為弱陽(yáng)性，3～4分為陽(yáng)性，5分以上為強(qiáng)陽(yáng)性。

六、統(tǒng)計(jì)方法

應(yīng)用SPSS 18.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，主要指標(biāo)均進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，正態(tài)分布的各統(tǒng)計(jì)指標(biāo)均以SD來(lái)表示。兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，采用雙側(cè)Plt;0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。相關(guān)性統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用Spearman法，采用雙側(cè)Plt;0.01為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。回歸分析采用多因素Logistic回歸分析，采用雙側(cè)Plt;0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、Knosp分級(jí)

將179例患者分為如下五級(jí)，其中0～Ⅱ級(jí)為非侵襲性垂體瘤，共88例，Ⅲ～Ⅳ級(jí)為侵襲性垂體瘤，共91例(圖1)。

二、免疫組化顯色

免疫組化染色中，0級(jí)24例，Ⅰ級(jí)40例，Ⅱ24例， Ki-67以細(xì)胞核染色為陽(yáng)性細(xì)胞(圖2)，其中，Ⅲ級(jí)45例，Ⅳ級(jí)46例。p53染色以細(xì)胞核染色為主(圖3)，MMP-9以細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜染色為主，陽(yáng)性染色為棕黃色細(xì)顆粒(圖4)。

三、侵襲性與非侵襲性組中Ki-67、p53及MMP-9表達(dá)情況

根據(jù)Knosp分級(jí)，侵襲性與非侵襲性組中的Ki-67、p53及MMP-9表達(dá)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05)(表1)。

KnospclassificationnKi?67p53MMP?9 0～Ⅱ881．01±1．020．563±0．1480．732±0．082 Ⅲ～Ⅳ913．56±1．84a1．478±0．087b1．653±0．139c

t=-10.07，aPlt;0.05,vsKnosp 0～Ⅱgroup;t=-3.477，bPlt;0.05,vsKnosp 0～Ⅱgroup;t=-6.008,cPlt;0.05,vsKnosp 0～Ⅱgroup.

表2 垂體瘤侵襲性發(fā)生影響因素的Spearman相關(guān)性分析結(jié)果

Tab 2 The Spearman correlation analysis of pituitary adenoma invasive influence factors

FactorKnospclassificationrP Ki-670．592lt;0．01 p530．362lt;0．01 MMP-90．426lt;0．01

表3 Logistic多因素回歸分析結(jié)果

Tab 4 Results of multivariate Logistic regression analysis

RiskfactorβStandarderrorWaldP Ki?67﹣2．1790．3269．1350．003 p53﹣1．2440．1271．5190．047 MMP?9﹣3．570．2027．5460．023

四、Spearman等級(jí)相關(guān)分析

Ki-67(r=0.592，Plt;0.01)、p53(r=0.362，Plt;0.01)及MMP-9(r=0.426，Plt;0.01)的表達(dá)水平與垂體瘤的Knosp分級(jí)呈正相關(guān)(表2)。

五、Logistic多因素回歸分析

Ki-67(P=0.003)、p53(P=0.047)及MMP-9(P=0.023)均是垂體瘤侵襲性的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)表3)。

圖1 非侵襲性垂體瘤與侵襲性垂體瘤MR表現(xiàn)

Fig 1 MR images of non-invasive and invasive pituitary adenoma

A: MR image of non-invasive pituitary adenoma showed the lesion was limited in the saddle area; B：MR image of invasive pituitary adenoma showed that the lesion extends to the saddle.

圖2 免疫組化顯示非侵襲性及侵襲性垂體瘤腫瘤組織的Ki-67表達(dá)情況

Fig 2 Expression of Ki-67 in non-invasive and invasive pituitary adenomas by immunohistochemistry (×40)

The positive staining were brown granulesin tumor cells nucleus.

A: Expression of Ki-67 in non-invasive pituitary adenomas by immunohistochemistry; B: Expression of Ki-67 in invasive pituitary adenomas by immunohistochemistry.

圖3 免疫組化顯示非侵襲性及侵襲性垂體瘤腫瘤組織的p53表達(dá)情況

Fig 3 Expression of p53 in non-invasive and invasive pituitary adenomas by immunohistochemistry (×40)

The positive staining were brown granulesin tumor cells nucleus.

A: Expression of p53 in non-invasive pituitary adenomas by immunohistochemistry; B: Expression of p53 in invasive pituitary adenomas by immunohistochemistry.

圖4 免疫組化顯示非侵襲性及侵襲性垂體瘤腫瘤組織的MMP-9表達(dá)情況

Fig 4 Expression of MMP-9 in non-invasive and invasive pituitary adenomas by immunohistochemistry (×40)

The positive staining were brown granulesin tumor cells nucleus.

A: Expression of MMP-9 in non-invasive pituitary adenomas by immunohistochemistry; B: Expression of MMP-9 in invasive pituitary adenomas by immunohistochemistry.

討 論

侵襲性垂體瘤較非侵襲性垂體瘤在生物學(xué)上具有高侵襲性，生長(zhǎng)速度快的特點(diǎn)。垂體瘤可以侵襲海綿竇、鞍底骨質(zhì)和蝶竇，其中以海綿竇受累為重要征象。MRI上，海綿竇兩側(cè)信號(hào)強(qiáng)度不對(duì)稱是海綿竇受侵犯的最敏感的征象，但其特異性差；頸內(nèi)動(dòng)脈海綿竇段受包繞，特異性高，但敏感性差。因此，我們引用Knosp分級(jí)法[1,2]，如果腫瘤包繞頸內(nèi)動(dòng)脈達(dá)67%以上，海綿竇累及可以診斷，侵襲性的陽(yáng)性預(yù)測(cè)率為100%；如果海綿竇顯示不清或海綿竇上、內(nèi)側(cè)壁與腫瘤相連，則高度懷疑；如果腫瘤包繞頸內(nèi)動(dòng)脈小于25%或頸內(nèi)動(dòng)脈上、內(nèi)側(cè)壁未與腫瘤接觸，則可以明確海綿竇未累及。因此，MRI已成為評(píng)價(jià)垂體腫瘤最好的影像學(xué)方法。我們可以根據(jù)腫瘤的MRI影像學(xué)特點(diǎn)，對(duì)垂體瘤的侵襲性做出初步判斷。

Ki-67是一種與DNA結(jié)合的核內(nèi)蛋白，因其只表達(dá)于細(xì)胞增殖各期，不易受生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)，能夠較好的判斷腫瘤的生長(zhǎng)增殖特性[2,3]。Thapar[4]提出，以3%指數(shù)作為區(qū)分侵襲性與非侵襲性腺瘤的閾值。本文結(jié)果顯示Ki-67表達(dá)與Knosp分級(jí)呈正相關(guān)。Knosp[5]等發(fā)現(xiàn)，垂體腺瘤中，Ki-67表達(dá)指數(shù)越高，其侵襲性越強(qiáng)。最新研究表明，Ki-67與垂體瘤的侵襲性呈正相關(guān)，而與垂體瘤的復(fù)發(fā)并無(wú)明顯關(guān)聯(lián)[3]。Ki-67可作為判斷腫瘤侵襲性的指標(biāo)之一。

與侵襲性垂體瘤相關(guān)的抑癌基因主要包括Rb基因、p53基因和MEN-1基因等，其中，p53是目前研究最多的抑癌基因。p53基因可以分為野生型和突變型兩種。研究發(fā)現(xiàn)，野生型的p53可以抑制腫瘤的發(fā)生，但其為潛在的形式，平時(shí)維持較低的水平[6]。同時(shí)，p53也是腫瘤發(fā)生中最常見(jiàn)發(fā)生突變和變異的抑癌基因，突變后的p53能夠刺激細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[7]。Thapar等[4]提出，侵襲性垂體腺瘤組織中p53的表達(dá)較高，而非侵襲性垂體腺瘤組織中表達(dá)較低。因此，p53基因的異常表達(dá)是侵襲性垂體腺瘤的重要標(biāo)志。本研究也證實(shí)p53的表達(dá)與Knosp分級(jí)呈正相關(guān)。

MMP-9屬于膠質(zhì)酶Ⅳ，具有溶解基底膜的膠原Ⅳ和細(xì)胞外基質(zhì)的能力，并能夠誘導(dǎo)細(xì)胞有絲分裂及參與新生血管網(wǎng)的形成。同時(shí)，MMP-9與轉(zhuǎn)移瘤及某些惡性腫瘤包括腦腫瘤的侵襲性密切相關(guān)[8]。文中結(jié)果表明，MMP-9表達(dá)與Knosp分級(jí)呈正相關(guān)。此外，MMP-9在垂體腺瘤的侵襲性生長(zhǎng)中起重要促進(jìn)作用。Kawamoto[9,10]等研究認(rèn)為，MMP-9不僅與垂體瘤的侵襲性密切相關(guān)，而且與腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移有關(guān)，也可作為腫瘤侵襲性和復(fù)發(fā)的指標(biāo)。有研究表明，指導(dǎo)個(gè)體化臨床治療抑制MMP-9的活性作用或減少其分泌，可作為治療侵襲性垂體瘤的一個(gè)新靶點(diǎn)。

目前已有很多研究表明，垂體腫瘤是單克隆起源的，有多種因素參與垂體腫瘤的形成。大部分的垂體腺瘤是良性的，不會(huì)轉(zhuǎn)移，但也有一些會(huì)侵襲鄰近組織。目前對(duì)垂體瘤侵襲機(jī)制及影響垂體瘤侵襲性因素的研究，仍是熱點(diǎn)。垂體的侵襲性的發(fā)生是一個(gè)長(zhǎng)期的、多因素、多步驟的過(guò)程。術(shù)后并發(fā)癥、內(nèi)分泌方面未能獲得緩解、以及患者的預(yù)后與侵襲性密切相關(guān)，不同的因素在垂體瘤的啟動(dòng)和進(jìn)展中發(fā)生拮抗或者協(xié)同的作用。本文研究表明，Ki-67、p53及MMP-9均與Knosp分級(jí)一致呈正相關(guān)，即侵襲性垂體瘤中Ki-67、p53及MMP-9三者表達(dá)均顯著高于非侵襲性垂體瘤。同時(shí)，Ki-67、p53及MMP-9標(biāo)本容易獲得，對(duì)于實(shí)驗(yàn)室的設(shè)備要求一般，適用于臨床的研究，且MMP-9可作為腫瘤復(fù)發(fā)的判斷指標(biāo)。因此，聯(lián)合Ki-67、p53、MMP-9表達(dá)的檢測(cè)及Knosp分級(jí)對(duì)提高垂體腺瘤侵襲性判斷的特異性及預(yù)后有重要價(jià)值。

1Knosp E, Steiner E, Kitz K, et al. Pituitary adenomas with invasion of the cavernous sinus space: a magnetic resonance imaging classification compared with surgical findings [J]. Neurosurgery, 1993, 33(4): 610-618.

2惠國(guó)禎, 主編. 垂體瘤 [M]. 第2版. 北京: 人民軍醫(yī)出版社, 2011: 152-158.

3Yilmaz M, Vural E, Koc K, et al. Cavernous sinus invasion and effect of immunohistochemical features on remission in growth hormone secreting pituitary adenomas [J]. Turk Neurosurgery, 2015, 25(3): 380-388.

4Thapar K, Kovacs K, Scheithauer BW, et al. Proliferative activity and invasiveness among pituitary adenomas and carcinomas: an analysis using the MIB-1 antibody [J]. Neurosurgery, 1996, 38(1): 99-107.

5Knosp E, Perneczky A, Kitz K, et al. The need for adjunctive focused radiation therapy in pituitary adenomas [M]. Acta Neurochir Suppl, 1995, 63: 81-84.

6Gejman R, Swearingen B, Hedley-Whyte ET. Role of Ki-67 proliferation index and p53 expression in predicting progression of pituitary adenomas [J]. Human Pathol, 2008, 39(5): 758-766.

7Madsen H, Borges TM, Knox AJ, et al. Giant pituitary adenomas: pathologic-radiographic correlations and lack of role for p53 and MIB-1 labeling [J]. Am J Surg Pathol, 2011, 35(8): 1204-1213.

8Zhang Y, Zhang X, Zhu X, et al. The correlativity of PTTG, MMP-2 MMP-9 with the invasiveness of pituitary adenoma [J]. Chin J Laborat Diagn, 2012, 16(9): 1671-1673.

9Kawamoto H, Uozumi T, Kawamoto K, et al. Type IV collagenase activity and cavernous sinus invasion in human pituitary adenomas [J]. Acta Neurochirurgica, 1996, 138(4): 390-395.

10Qiu L, He D, Fan X, et al. The expression of interleukin (IL)-17 and IL-17 receptor and MMP-9 in human pituitary adenomas [J]. Pituitary, 2011, 14(3): 266-275.

ThecorrelationbetweenMRIKnospclassificationandKi-67,p53andMMP-9inpituitaryadenoma

HELu1,GUOLiang1,HUChunhong1,YUZhengquan2,HUIGuozhen2

1DepartmentofMedicalImaging;2DepartmentofNeurosurgery,FirstAffiliatedHospitalofSoochowUniversity,Suzhou215600, China

ObjectiveThe expressions of Ki-67, p53 and MMP-9 in the pituitary adenomas were detected to study the correlation between them and Knosp classification.MethodsOne hundred and seventy-nine cases of pituitary tumor specimens were divided into two groups by Knosp classification, including ninty-one cases of invasive pituitary adenoma and eighty-eight cases of non-invasive pituitary adenoma. The expressions of proliferation-related Ki-67 antigen (Ki-67), tumor suppressor gene p53 (p53) and matrix metalloproteinase 9 (MMP-9) were detected by immunohistochemistry.ResultsThe rates of Ki-67, p53 and MMP-9 were higher than those in the groups above Knosp classification Ⅲ (Plt;0.01).ConclusionThere is significant positive correlation between Ki-67, p53, MMP-9 and Knosp classification.

Pituitary adenoma; Knosp classification; Ki-67; p53; MMP-9

1671-2897(2016)15-410-04

R 736.4

A

國(guó)家973基金資助項(xiàng)目(2012CB518106)

何璐，醫(yī)師，E-mail：20114232125@suda.edu.cn

*通訊作者： 惠國(guó)禎，教授、主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，E-mail：guozhen-hui@163.com

2016-04-16；

2016-07-27)