黃林晶 侯毅翰 楊立勇 嚴(yán)孫杰 沈喜妹

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科 福建醫(yī)科大學(xué)代謝病研究所，福建 福州 350005)

?

高脂狀態(tài)下Exendin-4對(duì)胰島βTc6細(xì)胞內(nèi)胰-十二指腸同源盒-1表達(dá)、細(xì)胞增殖功能及胰島素分泌能力的干預(yù)作用

黃林晶 侯毅翰 楊立勇 嚴(yán)孫杰 沈喜妹

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科 福建醫(yī)科大學(xué)代謝病研究所，福建 福州 350005)

目的 探討Exendin-4在高脂狀態(tài)下是否具有抗脂毒性及其相關(guān)機(jī)制是否涉及胰-十二指腸同源盒(PDX)-1。方法 不同濃度的Exendin-4培育βTc6細(xì)胞不同時(shí)間，再應(yīng)用1 mmol/L游離脂肪酸(FFA)干預(yù)24 h，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)PDX-1表達(dá)及增殖能力和胰島素分泌功能。結(jié)果 ①Exendin-4干預(yù)6 h，各組細(xì)胞PDX-1表達(dá)、細(xì)胞增殖能力和胰島素分泌功能均未見明顯改善;②當(dāng)Exendin-4干預(yù)延長(zhǎng)至12～24 h，隨著干預(yù)濃度增高，細(xì)胞內(nèi)PDX-1逐漸升高，細(xì)胞增殖能力和胰島素分泌功能明顯好轉(zhuǎn)。結(jié)論 高脂狀態(tài)下適宜濃度的Exendin-4干預(yù)一定時(shí)限可上調(diào)β細(xì)胞內(nèi)PDX-1的表達(dá)，并改善細(xì)胞增殖功能及胰島素分泌能力。

Exendin-4；胰-十二指腸同源盒-1；胰島素；游離脂肪酸；βTc6細(xì)胞

肥胖，尤其是中心型肥胖與2型糖尿病(T2DM)密切相關(guān)。大量證據(jù)表明血游離脂肪酸(FFA)是T2DM發(fā)病重要的危險(xiǎn)因素〔1〕。Exendin-4是長(zhǎng)效的胰升血糖素樣肽(GLP)-1受體激動(dòng)劑，而胰-十二指腸同源盒(PDX)-1是胰腺發(fā)生與發(fā)育相關(guān)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子之一，其在調(diào)節(jié)胰腺的發(fā)育、分化及胰島素分泌中起著至關(guān)的重要作用〔2〕。本研究對(duì)高脂狀態(tài)下的βTc6細(xì)胞進(jìn)行不同濃度和不同時(shí)限的Exendin-4干預(yù)，并觀察細(xì)胞內(nèi)PDX-1、增殖能力和的胰島素分泌表達(dá)情況，旨在探討Exendin-4在高脂狀態(tài)下是否能保護(hù)胰島β細(xì)胞及其抗脂毒性作用的相關(guān)機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 βTc6細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)，通過DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，接種于6孔板中培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)分組為空白對(duì)照組(NC組)、1.0 mmol/L FFA干預(yù)組(1 mmol/L組)、5 nmol/L Exendin-4 +FFA干預(yù)組(5 nmol/L組)、10 nmol/L Exendin-4+FFA干預(yù)組(10 nmol/L組)、50 nmol/L Exendin-4+FFA干預(yù)組(50 nmol/L組)。各組分別加入含有不同濃度的Exendin-4或不含Exendin-4的DMEM培養(yǎng)基培育不同時(shí)間(6、12、24 h)，再加入1.0 mmol/L FFA繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2 MTT細(xì)胞活力分析 收集數(shù)生長(zhǎng)期的βTc6細(xì)胞，計(jì)數(shù)按5×103/孔接種于96孔板中，培養(yǎng)使其貼壁。加入FFA、Exendin-4等各種實(shí)驗(yàn)因素作用后，每孔加入5 g/L四甲基偶氮唑鹽(MTT)溶液孵育4 h，吸走培養(yǎng)液，每孔加150 μl的二甲基亞砜(DMSO)，置于搖床上低速振蕩約10 min，振搖10 min，使結(jié)晶溶解后用酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)量吸光值(OD值)。細(xì)胞增殖抑制率=(對(duì)照組OD值-干預(yù)組OD值)/對(duì)照組OD值。

1.3 放射免疫法檢測(cè)胰島素 將βTc6細(xì)胞制成4×105/ml 單細(xì)胞懸液，接種于6孔板，加入FFA、Exendin-4等各種實(shí)驗(yàn)因素作用后，通過用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后加入含25 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基培育60 min，收集上清液，按照胰島素放射免疫分析試劑盒說明書測(cè)定其濃度。

1.4 RT-PCR檢測(cè)PDX-1 mRNA表達(dá) 按照Trizol試劑盒說明進(jìn)行細(xì)胞mRNA總提取，在TaqDNA聚合酶催化下行聚合酶鏈反應(yīng)。PDX-1擴(kuò)增片段長(zhǎng)度317 bp：上游：5'CAAGATTGTGCGGTGACCT3'，下游：5'CGGCTATACCCAACTGGCT3'；β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度462 bp；按照2-△△Ct計(jì)算各組PDX-1相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 高脂狀態(tài)下Exendin-4干預(yù)對(duì)βTc6細(xì)胞PDX-1 mRNA表達(dá)的影響 不同濃度的Exendin-4作用βTc6細(xì)胞6 h后，再予FFA 1 mmol/L干預(yù)24 h，細(xì)胞內(nèi)PDX-1 mRNA表達(dá)與1 mmol/L組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，各濃度組表達(dá)量均明顯低于NC組(P<0.05)。當(dāng)Exendin-4作用時(shí)間延長(zhǎng)至12 h，5 nmol/L組PDX-1 mRNA表達(dá)量與1 mmol/L組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；干預(yù)濃度為10 nmol/L時(shí)PDX-1 mRNA表達(dá)較5 nmol/L組增加(P<0.05)；當(dāng)濃度進(jìn)一步升到50 nmol/L時(shí)，PDX-1 mRNA表達(dá)量繼續(xù)上升(P<0.05)，但與NC組相比仍較低(P<0.05)。干預(yù)24 h，5 nmol/L組PDX-1 mRNA表達(dá)與1 mmol/L組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；10 nmol/L組PDX-1 mRNA的表達(dá)量較5 nmol/L組升高(P<0.05)，但50 nmol/L組PDX-1 mRNA的表達(dá)未較10 nmol/L組進(jìn)一步升高(P>0.05)，這兩組表達(dá)量均低于NC組(P<0.05)。見圖1。

2.2 高脂狀態(tài)下Exendin-4干預(yù)對(duì)βTc6細(xì)胞增殖活性的影響 當(dāng)Exendin-4干預(yù)時(shí)間設(shè)定為6或12 h，5 nmol/L組βTc6細(xì)胞的增殖能力明顯下降，與1 mmol/L組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；10 nmol/L組細(xì)胞增殖活性較前改善，與1 mmol/L組相比OD值明顯改善(P<0.05)；50 nmol/L組OD值未較10 nmol/L組進(jìn)一步升高。當(dāng)Exendin-4干預(yù)時(shí)間增加到24 h，5 nmol/L組βTc6細(xì)胞的增殖活性較1 mmol/L組有所恢復(fù)(P<0.05)；10 nmol/L組和50 nmol/L組βTc6細(xì)胞的增殖活性明顯改善，兩組OD值均較5 nmol/L組進(jìn)一步升高(P<0.05)。在脂毒性狀態(tài)下，當(dāng)Exendin-4干預(yù)濃度固定時(shí)，在6、12 h干預(yù)組中βTc6細(xì)胞的增殖活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但在24 h干預(yù)組其細(xì)胞增殖活性明顯較前兩組改善(P<0.05)，見表1。

1～5分別為：NC，1 mmol/L，5 nmol/L，10 nmol/L，50 nmol/L組圖1 Exendin-4干預(yù)12、24 h βTc6細(xì)胞PDX-1 mRNA的表達(dá)

分組6h12h24hNC組1.33±0.171.31±0.151.29±0.111mmol/L組0.35±0.031)0.36±0.041)0.34±0.051)5nmol/L組0.43±0.051)0.46±0.041)0.57±0.051)2)4)5)10nmol/L組0.75±0.061)2)3)0.75±0.131)2)3)0.94±0.101)2)3)4)5)50nmol/L組0.72±0.081)2)3)0.76±0.151)2)3)1.01±0.101)2)3)4)5)

與NC組相比:1)P<0.05；與1 mmol/L組相比:2)P<0.05；與5 nmol/L組相比:3)P<0.05;與6 h組相比:4)P<0.05；與12 h組相比:5)P<0.05;下表同

2.3 高脂狀態(tài)下Exendin-4干預(yù)對(duì)βTc6細(xì)胞胰島素分泌功能的影響 當(dāng)Exendin-4干預(yù)時(shí)間設(shè)定為6或12 h，5 nmol/L干預(yù)組βTc6細(xì)胞的胰島素分泌(GSIS)與1 mmol/L組無明顯差異(P>0.05)；10 nmol/L組的GSIS有所恢復(fù)，其雖然低于對(duì)照組(P<0.05)，但較1 mmol/L組明顯改善(P<0.05)；50 nmol/L組的GSIS未較10 nmol/L組進(jìn)一步升高(P>0.05)。當(dāng)干預(yù)時(shí)間設(shè)定為24 h，5 nmol/L組的GSIS高于1 mmol/L組(P<0.05)，而10、50 nmol/L組的GSIS較5 nmol/L組明顯改善(P<0.05)。當(dāng)Exendin-4干預(yù)濃度穩(wěn)定時(shí)，隨著干預(yù)時(shí)限的延長(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)GSIS逐漸改善。另經(jīng)析因設(shè)計(jì)的方差分析表明，在高脂狀態(tài)下，隨著Exendin-4干預(yù)時(shí)限的延長(zhǎng)及干預(yù)濃度的增加，βTc6細(xì)胞內(nèi)GSIS得到更加明顯改善，見表2。

表2 高脂狀態(tài)下Exendin-4干預(yù)βTc6細(xì)胞的GSIS功能改變

3 討 論

長(zhǎng)期高FFA血癥可導(dǎo)致胰島β細(xì)胞脂質(zhì)過載，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和壞死，從而使胰島β細(xì)胞數(shù)目減少；也可使胰島β細(xì)胞分泌功能損傷，胰島素分泌減少〔3〕。既往研究表明，1 mmol/L FFA干預(yù)24 h對(duì)胰島βTc6細(xì)胞的功能產(chǎn)生明顯的抑制作用，細(xì)胞呈現(xiàn)出明顯的凋亡趨勢(shì)，細(xì)胞增殖能力和胰島功能均受到明顯抑制，細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子PDX-1表達(dá)明顯減少〔4，5〕。

本研究發(fā)現(xiàn)，高脂狀態(tài)下βTc6細(xì)胞PDX-1 mRNA的表達(dá)、細(xì)胞增殖能力及胰島分泌功能與Exendin-4存在明顯的濃度及時(shí)間依賴性。不同濃度Exendin-4干預(yù)6 h不能有效拮抗高濃度FFA對(duì)細(xì)胞的脂毒性作用，且PDX-1基因表達(dá)未見好轉(zhuǎn)，但10、50 nmol/L Exendin-4干預(yù)組內(nèi)的細(xì)胞增殖能力和胰島素分泌功能已較1 mmol/L高FFA組有一定程度提高，表明細(xì)胞增殖能力和胰島分泌功能有所改善。這種PDX-1細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子的基因表達(dá)并未改善但β細(xì)胞相關(guān)功能卻出現(xiàn)適當(dāng)?shù)幕謴?fù)，考慮與Exendin-4干預(yù)時(shí)間較短不能激活PDX-1及其相關(guān)調(diào)控基因表達(dá)有關(guān)，但可能通過調(diào)控其他信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑使β細(xì)胞的功能微弱改善〔6〕。但當(dāng)干預(yù)時(shí)間延長(zhǎng)至12～24 h，βTc6細(xì)胞PDX-1 基因表達(dá)明顯改善，其增殖能力和胰島素分泌功能也得到明顯修復(fù)。本研究也顯示低濃度Exendin-4干預(yù)12 h雖然PDX-1基因表達(dá)改善，但細(xì)胞增殖活性和分泌功能并未出現(xiàn)好轉(zhuǎn)，考慮PDX-1作為胰島β細(xì)胞內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，其發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)須轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核內(nèi)，雖然PDX-1表達(dá)改善，但胰島β細(xì)胞內(nèi)仍有大量脂質(zhì)堆積，神經(jīng)酰胺合成增加，致使另一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子探討叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子(Fox)01與其競(jìng)爭(zhēng)轉(zhuǎn)位，從而使PDX-1轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核內(nèi)受限無法完全發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)有關(guān)〔7〕。本研究也發(fā)現(xiàn)了50 nmol/L Exendin-4干預(yù)24 h PDX-1表達(dá)和胰島細(xì)胞相關(guān)功能并未比10 nmol/L組得到改善，考慮可能與β細(xì)胞膜表面的GLP-1受體飽和性有關(guān)〔8〕。

Exendin-4在β細(xì)胞中發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)與PDX-1密切相關(guān)。研究顯示，Exendin-4要發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)必須與細(xì)胞膜上GLP-1受體相結(jié)合，而PDX-1是其發(fā)揮生物學(xué)作用所必需的重要轉(zhuǎn)錄因子〔9〕。Wang等〔10〕認(rèn)為Exendin-4與GLP-1受體結(jié)合后通過cAMP/PKA這條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上調(diào)β細(xì)胞內(nèi)PDX-1的表達(dá)與核定位，從而發(fā)揮其生物學(xué)功能，并且腺苷酸環(huán)化酶激活劑Forskolin及8-溴-cAMP可以模擬GLP-1對(duì)PDX-1的正性作用〔11〕。

1 Slagter SN,van Vliet-Ostaptchouk JV,van Beek AP,etal.Health-related quality of life in relation to obesity grade,type 2 diabetes,metabolic syndrome and inflammation〔J〕.PLoS One,2015;10(10):e0140599.

2 Hwang SL,Kwon O,Kim SG,etal.B-cell translocation gene 2 positively regulates GLP-1-stimulated insulin secretion via induction of PDX-1 in pancreatic β-cells〔J〕.Exp Mol Med,2013;45:e25.

3 Giacca A,Xiao C,Oprescu AI,etal.Lipid-induced pancreatic beta cell dysfunction:focus on in vivo studies〔J〕.Am J Physiol Endocrinol Metab,2011;300:E255-62.

4 楊立勇,侯毅翰，沈喜妹,等.游離脂肪酸對(duì)βTc6細(xì)胞PDX-1表達(dá)及胰島素分泌能力的影響〔J〕.國(guó)際內(nèi)分泌代謝雜志,2009;29(6)：381-4.

5 黃林晶，楊立勇，嚴(yán)孫杰，等.Exendin-4對(duì)游離脂肪酸介導(dǎo)的βTc6細(xì)胞GK和GLUT2表達(dá)改變的干預(yù)作用〔J〕.中國(guó)糖尿病雜志,2013;21(9)：832-5.

6 Tews D,Lehr S,Hartwig S,etal.Anti-apoptotic action of exendin-4 in INS-1 beta cells:comparative protein pattern analysis of isolated mitochondria〔J〕.Horm Metab Res,2009;41(4):294-301.

7 Poitout V,Hagman D,Stein R,etal.Regulation of the insulin gene by glucose and fatty acids〔J〕.J Nutr,2006;136(4):873-6.

8 Kim MJ,Kang JH,Park YG,etal.Exendin-4 induction of cyclin D1 expression in INS-1 β-cells:involvement of cAMP-responsive element〔J〕.J Endocrinol,2006;188:623-33.

9 Li Y,Cao X,Li LX,etal.β-Cell Pdx1 expression is essential for the glucoregulatory,proliferative,and cytoprotective actions of glucagon-like peptide-1〔J〕.Diabetes,2005;54(2):482-91.

10 Wang X,Zhou J,Doyle ME,etal.Glucagon-like peptide-1 causes pancreatic duodenal homeobox-1 protein translocation from the cytoplasm to the nucleus of pancreatic beta-cells by a cyclic adenosine monophosphate/protein kinase A-dependent mechanism〔J〕.Endocrinology,2001;142(5):1820-7.

11 Kwon G,Pappan KL,Marshall CA,etal.cAMP dose-dependently prevents palmitate-induced apoptosis by both protein kinase A-and cAMP-Guanine nucleotide exchange factor-dependent pathways in β-cells〔J〕.J Biol Chem,2004;279(10):8938-45.

〔2015-02-19修回〕

(編輯 苑云杰)

國(guó)家自然科學(xué)基金(81500632)；福建省青年科研基金(2015-1-48)

楊立勇(1957-)，男，博士生導(dǎo)師，教授，主任醫(yī)師，主要從事糖尿病研究。

黃林晶(1982-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事糖尿病研究。

R341.6；R977.6

A

1005-9202(2016)20-4945-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.20.003