張自剛 劉鐵柱 張 寧

(大慶油田總醫(yī)院泌尿外科，黑龍江 大慶 163001)

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益母草總生物堿對前列腺增生模型大鼠Bcl-2表達的影響

張自剛 劉鐵柱 張 寧1

(大慶油田總醫(yī)院泌尿外科，黑龍江 大慶 163001)

目的 探討益母草總生物堿對前列腺增生模型大鼠抑凋亡因子Bcl-2表達的影響及其對良性前列腺增生(BPH)的治療效果。方法 健康SD大鼠65只，雄性，10～12 w，體重250～270 g，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后開始造模。從中隨機選取55只大鼠，隔日皮下注射丙酸睪丸酮(溶于橄欖油)50 mg/kg連續(xù)4 w，分別為模型組、益母草組及陽性藥組，每組10只，余下大鼠注射10 ml/kg橄欖油，位置及時間間隔同模型大鼠，作為對照組。從造模后1 w開始，益母草組高、中、低劑量組分別按2 ml/100 g灌服益母草總生物堿(100、50、25 mg/kg)；陽性藥組以同體積灌胃癃閉舒膠囊300 mg/kg(溶于10 ml生理鹽水)，模型組和對照組均以等體積的生理鹽水灌胃，均每日1次，每周稱量一次體重，根據(jù)體重調(diào)整給藥劑量，連續(xù)4 w。結(jié)果 益母草組和陽性藥組均可降低模型大鼠前列腺濕重和前列腺指數(shù)，與模型組相比，差異顯著(P<0.05)。與陽性藥組相比，益母草高、中劑量組下降更顯著(P<0.05)。治療后各治療組Bcl-2表達均減弱，與模型組相比差異顯著(P<0.05)，與陽性藥組相比，益母草高、中劑量組治療后Bcl-2表達減弱更顯著(P<0.05)。益母草高、中劑量組前列腺總體形態(tài)接近對照組，腺體大小基本一致，有少數(shù)增生，極少部分呈乳頭狀突入腔內(nèi)，益母草低劑量組可見腺體增多未明顯改善，向腺腔內(nèi)突出，部分上皮細胞呈高柱狀，間質(zhì)和血管充血、水腫明顯。陽性藥組光鏡下可見部分腺腔變大，有一部分呈乳頭狀向腔內(nèi)突出，有部分高柱狀上皮。陽性藥組和益母草組大鼠的前列腺上皮皺褶基本消失，腺腔擴張，間質(zhì)有所增厚，其比表面(δ)和比膜面(δm)與模型組相比有明顯差異(P<0.05)，而益母草高、中劑量組與陽性藥組相比也有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。結(jié)論 益母草總生物堿能夠顯著降低前列腺增生模型大鼠Bcl-2表達，對BPH的治療效果明顯，值得推廣。

益母草總生物堿；前列腺增生；Bcl-2

目前，前列腺增生的發(fā)病機制尚不完全清楚，已有的發(fā)病學(xué)說有激素內(nèi)分泌學(xué)說、細胞凋亡學(xué)說、生長因子學(xué)說等〔1〕。中醫(yī)認為前列腺增生的成因是膀胱氣化不利、三焦氣化失司致濕熱瘀血痰濁閉阻膀胱所致〔2〕。益母草是一種常見的中草藥，具有活血化瘀、利水通淋之功?，F(xiàn)代藥理研究表明，益母草具有抑制血小板聚集、抗氧自由基、增強免疫、保鉀利尿等作用〔3〕，提示益母草可能具有治療前列腺增生的功效。高漸聯(lián)〔4〕研究發(fā)現(xiàn)，益母草總生物堿能顯著抑制模型動物前列腺增生，并推測其可能是通過調(diào)解轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1表達水平抑制增生。因此，治療前列腺增生，抑制細胞增殖是關(guān)鍵。抑凋亡基因Bcl-2是目前僅發(fā)現(xiàn)的與BPH密切相關(guān)的基因，但目前關(guān)于益母草總生物堿治療前列腺增生對Bcl-2表達的影響尚未見報道。因此本試驗通過分析益母草總生物堿對大鼠前列腺細胞凋亡基因表達的影響，為益母草總生物堿治療前列腺增生提供新證據(jù)。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 健康SD大鼠65只，雄性，10～12 w，體重250～270 g，北京維通利華實驗動物中心提供。室溫20℃左右，相對濕度40%～60%。環(huán)境光照12 h暗、12 h明。動物自由飲水進食。

1.2 儀器及試劑 丙酸睪丸酮注射液(上海通用藥業(yè)股份有限公司)、益母草總生物堿(含量>80%)、癃閉舒膠囊(石家莊科迪藥業(yè)有限公司)、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)試劑盒(北京中杉生物工程公司)、 Bcl-2試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)、圖像采集(德國 Lecia 顯微照相系統(tǒng))。

1.3 實驗方法

1.3.1 模型的建立 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后開始造模，隨機選取55只大鼠，隔日皮下注射丙酸睪丸酮50 mg/kg(溶于橄欖油，0.1 ml/100 g )，連續(xù)4 w，余下10只大鼠注射10 ml/kg橄欖油，位置及時間間隔與造模大鼠相同。

1.3.2 分組及處理 造模大鼠55只隨機分為模型組、益母草高、中、低劑量組及陽性藥組，每組10只，剩下5只模型大鼠用于模型的驗證。未干預(yù)大鼠作為對照組，從造模后1 w開始，益母草組高、中、低劑量組分別按2 ml/100 g灌服益母草總生物堿(100、50、25 mg/kg)；陽性藥組以相同體積癃閉舒膠囊300 mg/kg(溶于10 ml生理鹽水)灌胃。模型組和對照組均以等體積的生理鹽水灌胃，灌胃均每日1次，每周稱量一次體重，根據(jù)體重調(diào)整給藥劑量，連續(xù)4 w。

1.4 檢測指標(biāo)及觀察方法

1.4.1 前列腺濕重及前列腺指數(shù) 末次給藥后24 h稱重，脫頸處死大鼠，立即打開腹部，分離前列腺周圍脂肪后摘除前列腺，去除附帶組織，用濾紙吸取表面液體，天平稱量，計算前列腺指數(shù)〔前列腺濕重(mg)/體重(g)×100%〕。

1.4.2 Bcl-2測定 稱重完畢后將前列腺組織于4%多聚甲醛溶液中固定20 h，脫水后石蠟包埋，切片，按照試劑盒說明滴加一抗后磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗標(biāo)本，再滴加二抗。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，二甲苯透明，光學(xué)樹脂膠封固，醫(yī)學(xué)真彩色計算機圖像全自動分析處理系統(tǒng)觀察并計算陽性細胞。上皮細胞層中有棕黃色顆粒者為陽性細胞，每張切片中隨機選擇10個視野，計算Bcl-2蛋白的平均光密度(MOD)。

1.4.3 前列腺病理學(xué)形態(tài) 將固定后的前列腺組織48 h后常規(guī)脫水、石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡觀察其病理學(xué)形態(tài)變化，測定各組大鼠的前列腺比表面(δ)和比膜面(δm)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件，計量資料采用t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 模型驗證 造模開始后第29天隨機選取5只大鼠，處死，下腹部切口，找到膀胱，在其后下方找到前列腺，分離周圍脂肪，分離并取出前列腺，固定，石蠟包埋，HE染色，在顯微鏡下觀察，鏡下顯示前列腺腺泡增多，腺腔呈鋸齒擴張明顯并出現(xiàn)乳頭狀增生 (圖1)，證明造模成功。

圖1 大鼠前列腺組織病理圖片

2.2 前列腺濕重及前列腺指數(shù) 與對照組相比，模型組大鼠前列腺濕重和指數(shù)均降低(P<0.05)。與模型組相比，各治療組前列腺濕重及前列腺指數(shù)均明顯下降(P<0.05)；與陽性藥組相比，益母草高、中劑量組前列腺濕重及前列腺指數(shù)下降更顯著(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠前列腺濕重及前列腺指數(shù)±s,n=10)

與對照組相比：1)P<0.05；與模型組相比：2)P<0.05；與陽性藥組相比：3)P<0.05；下表同

2.3 Bcl-2水平變化 與對照組〔(7.74±1.66)%〕相比，模型組大鼠前列腺組織中上皮細胞層Bcl-2有較強陽性表達〔13.68±3.62)%〕(P<0.05)。與模型組相比，益母草各組和陽性藥組的Bcl-2表達均減弱〔益母草高、中、低劑量組及陽性藥組分別為(8.49±2.59)%、(9.25±1.87)%、(11.93±2.04)%、(10.33±2.70)%,P<0.05〕；與陽性藥組相比，益母草高、中劑量組治療后表達減弱更顯著(P<0.05)。見圖2。

2.4 病理學(xué)改變 對照組光鏡下可見前列腺體大小一致、排列整齊，上皮細胞呈單層柱狀，表面光滑。模型組可見腺體增多、擴張，向腺腔內(nèi)突出，上皮細胞呈高柱狀，間質(zhì)和血管充血、水腫。益母草高、中劑量組：前列腺總體形態(tài)接近對照組，腺體大小基本一致，有少數(shù)增生，極少部分呈乳頭狀突入腔內(nèi)；益母草低劑量組可見腺體增多未明顯改善，向腺腔內(nèi)突出，可見部分上皮細胞呈高柱狀，間質(zhì)和血管充血、水腫明顯。陽性藥組光鏡下可見部分腺腔變大，有一部分呈乳頭狀向腔內(nèi)突出，有部分高柱狀上皮。 見圖3。

圖2 各組大鼠前列腺細胞Bcl-2免疫組化

圖3 大鼠前列腺組織病理切片

2.5 立體計量學(xué)改變 對照組大鼠的前列腺幾乎沒有皺褶，腺腔正常；模型組大鼠前列腺上皮皺褶明顯增多，腺腔縮小，間質(zhì)變薄。陽性藥組和益母草組前列腺上皮皺褶基本消失，腺腔擴張，間質(zhì)增厚，δ和δm與模型組相比有明顯差異(P<0.05)。益母草中、高劑量組前列腺上皮皺褶基本消失，腺腔擴張，間質(zhì)增厚不明顯，與陽性藥組相比有明顯差異(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠δ和δm比較

3 討 論

細胞增殖和凋亡的動態(tài)平衡維持了器官細胞總數(shù)目的恒定。正常前列腺形態(tài)也是細胞增殖和凋亡的細胞保持恒定的結(jié)果，是在控制下進行的，在正常組織中，細胞增殖速率和細胞死亡速率間存在著平衡，一旦不平衡發(fā)生，則表現(xiàn)為細胞的增殖增加或細胞凋亡數(shù)目減少。無論是通過細胞復(fù)制的增加還是細胞死亡的減少，都會引起前列腺細胞的堆積進而反應(yīng)為前列腺的增生〔5〕。Bcl-2基因是目前僅發(fā)現(xiàn)的與BPH密切相關(guān)的基因。以往研究已經(jīng)證實了Bcl-2基因表達可以抑制細胞的增殖〔6～8〕。本研究首次證明了益母草總生物堿能夠顯著降低Bcl-2表達，因此推測其可能是通過抑制Bcl-2表達促進了前列腺增生細胞的凋亡，從而達到治療作用。進一步的病理學(xué)檢測和立體計量學(xué)檢測結(jié)果顯示，益母草總生物堿比陽性藥的治療效果更好。

1 Unterbrink A，O′SullivanM，Chen S，etal.TGF beta-1downregulates DMP-1 and DSPP in odontoblasts〔J〕.Connect Tissue Res，2002;43(2-3)：354-8.

2 Gann PH，Klein KG，Chatterton RT，etal.Growth factors in expressed prostatic fluid form men with prostate cancer，BPH，and clinically normal prostates〔J〕.Prostate，1999；40(4)：248-55.

3 Roberts RO，Jacobson DJ,Girman CJ，etal.Insulin-like growth factor i，insulin-like growth factor binding protein 3，and urologic measures of benign prostatic hyperplasia〔J〕.Am J Epidemiol，May 2003；157(7)：784-91.

4 高漸聯(lián).益母草總堿對良性前列腺增生動物模型的作用機理探討〔D〕.鄭州：河南中醫(yī)學(xué)院，2010.

5 王宜梅.益母草的臨床應(yīng)用〔J〕.光明中醫(yī)，2006；21(2)：11.

6 張學(xué)軍，馬騰驤.Bcl-2基因在良性前列腺增生中的作用〔J〕.中華泌尿外科雜志，1997；18(2)：97-9.

7 劉 洋.中醫(yī)藥治療良性前列腺增生機理的研究進展與現(xiàn)狀〔J〕.中國男科學(xué)雜志，2006；20(6)：71-2.

8 洪振豐.良性前列腺增生實驗研究的選擇指標(biāo)〔J〕.中華男科學(xué)雜志，2008；14(9)：771-4.

〔2015-12-30修回〕

(編輯 袁左鳴)

國家自然科學(xué)基金資助項目(No.81372738)

張自剛(1980-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事泌尿系結(jié)石，腫瘤的治療研究。

R69

A

1005-9202(2016)20-4951-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.20.005

1 北京大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院泌尿外科