朱敏+劉艷

【摘 要】目的：建立控制舒肝顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：對(duì)舒肝顆粒中白術(shù)、甘草、梔子、芍藥進(jìn)行薄層色譜鑒別；采用高效液相色譜法測(cè)定梔子苷的含量。結(jié)果：薄層色譜檢出白術(shù)、甘草、梔子苷、芍藥苷；梔子苷在0.2505～2.672μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r=0.9998，平均回收率為97.98%，RSD為2.26%（n=9）。結(jié)論：該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，能有效控制舒肝顆粒的質(zhì)量。

【關(guān)鍵詞】舒肝顆粒；梔子苷；HPLC

【中圖分類(lèi)號(hào)】R286.0 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A【文章編號(hào)】1007-8517（2016）15-0024-04

舒肝顆粒是由當(dāng)歸、白芍、柴胡、香附等10味中藥組成，具有疏肝理氣，散郁調(diào)經(jīng)的功效。臨床用于肝氣不舒的兩脅疼痛，胸腹脹悶，月經(jīng)不調(diào)，頭痛目眩，心煩意亂，口苦咽干，以及肝郁氣滯所致的面部黧黑斑（黃褐斑）等。該制劑載于衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第十七冊(cè)中，標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)為WS3-B-3343-98，處方合理，療效確切。原標(biāo)準(zhǔn)中有兩項(xiàng)TLC鑒別，無(wú)含量測(cè)定項(xiàng)，為了有效控制其內(nèi)在質(zhì)量，現(xiàn)對(duì)其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了研究和提高。本研究對(duì)制劑中白術(shù)、甘草建立了薄層色譜鑒別，結(jié)果可靠。用高效液相色譜法測(cè)定梔子苷的含量，方法簡(jiǎn)便，分離度好，結(jié)果準(zhǔn)確，可作為控制該制劑質(zhì)量的方法[1]。

1 儀器與材料

1.1 儀器 B3200S-T超聲機(jī)（上海必能信超聲）；高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent 1100液相色譜儀系統(tǒng)）。

1.2 材料 硅膠G、GF254由青島海洋化工有限公司提供；白術(shù)（批號(hào)：120925-201310）、甘草（批號(hào)：120904-201117）、梔子苷（批號(hào)：110749-201316）、芍藥苷（批號(hào)：110736-201438）等對(duì)照藥材/對(duì)照品均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；舒肝顆粒（批號(hào)：150821，昆明中藥廠有限公司）；缺有關(guān)藥味的陰性對(duì)照樣品自制。乙腈為色譜純，其他試劑為分析純。

2 鑒別

2.1 白術(shù)的鑒別 取本品30g或9g（低糖型），加沸水10mL或3mL（低糖型）使溶解，放冷，加乙酸乙酯30mL，振搖混合，超聲處理20min，靜置，傾取上清液，殘?jiān)m(xù)加乙酸乙酯20mL，振搖混合，超聲處理10min，靜置，傾取上清液，合并上清液，以3%碳酸鈉溶液振搖提取2次（20、15mL），合并堿水液，滴加濃鹽酸調(diào)至pH2～3，以乙酸乙酯振搖提取2次（30mL、20mL），合并乙酸乙酯萃取液，以水20mL洗滌，分取乙酸乙酯液蒸至近干，殘?jiān)蛹状?.5mL使溶解，作為供試品溶液。另取白術(shù)對(duì)照藥材0.5g，加水30mL煎煮，保持微沸30min，煎液濾過(guò)，殘?jiān)偌铀?0mL煎煮，保持微沸20min，煎液濾過(guò)，合并2次濾液，濃縮至約1mL，放冷，加乙酸乙酯15mL，振搖混合，自“超聲處理20min”起，同供試品溶液制備方法制成對(duì)照藥材溶液0.5mL。照薄層色譜法（中國(guó)藥典2015年版四部通則0502）試驗(yàn)[2]，吸取上述兩種溶液各10～20μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯（7∶[KG-*3/5]3）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，于105℃的烤箱中烘烤3～5min，置紫外光燈（365nm）下檢視，供試品與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。見(jiàn)圖1。

2.2 甘草、梔子的鑒別 取本品20g或6g（低糖型），加沸水7mL或2mL（低糖型）使溶解，放冷，加水飽和的正丁醇25mL，振搖混合，超聲處理20min，靜置，傾取上清液，殘留物再加水飽和的正丁醇15mL，振搖混合，超聲處理10min，靜置，傾取上清液，合并上清液，用正丁醇飽和的水洗滌2次（25mL、15mL），分取正丁醇液蒸至近干，放冷，殘?jiān)蛹状?mL使溶解，作為供試品溶液。另取甘草對(duì)照藥材0.5g，加水煎煮2次（40mL、30mL），每次保持微沸20min，煎液合并，離心，取上清液，濃縮至約3mL，加水飽和的正丁醇15mL，振搖混合，自“超聲處理20min”起，同供試品溶液制備方法制成對(duì)照藥材溶液0.5mL。再取梔子苷對(duì)照品1mg，加甲醇1mL，制成1mg/mL的對(duì)照品溶液。照薄層色譜法（中國(guó)藥典2015年版四部通則0502），吸取上述三種溶液各5～10μL，分別點(diǎn)于同一以含1%氫氧化鈉溶液制備的硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰乙酸-水（15∶1∶1∶2）為展開(kāi)劑，上行展至12cm以上，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，于105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品與對(duì)照藥材色譜中，顯相同顏色的主斑點(diǎn)；與對(duì)照品色譜，顯相同顏色的斑點(diǎn)。見(jiàn)圖2。

2.3 白芍、牡丹皮的鑒別 取2.2項(xiàng)下供試品溶液作為供試品溶液。取芍藥苷對(duì)照品1mg，加甲醇1mL，制成1mg/mL的對(duì)照品溶液。照薄層色譜法（中國(guó)藥典2015年版四部通則0502），吸取上述兩種溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以二氯甲烷-甲醇-乙酸乙酯（8∶4∶1）為展開(kāi)劑，在氨蒸汽飽和條件下展開(kāi)，上行展至12cm，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)清晰。供試品與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。見(jiàn)圖3。

3 含量測(cè)定

3.1 色譜條件 色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠柱（Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18柱，4.6×250mm，5μm）。柱溫：30℃；流速：1.0mL/min；流動(dòng)相：乙腈-水（10∶90）；檢測(cè)波長(zhǎng)238nm；進(jìn)樣量：10μL。理論板數(shù)按梔子苷計(jì)算不低于1500。

3.2 對(duì)照品溶液的制備 取梔子苷對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇制成50μg/mL的溶液，即得。

3.3 供試品溶液的制備 取本品裝量差異項(xiàng)下的內(nèi)容物，研細(xì)，取2g或0.7g（低糖型），精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25mL，稱(chēng)定重量，超聲處理30min，放冷，再稱(chēng)定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

3.4 陰性對(duì)照試驗(yàn) 取缺梔子的陰性對(duì)照樣品，照“3.3項(xiàng)”下方法制成陰性對(duì)照樣品溶液，將梔子苷對(duì)照品溶液、供試品溶液和梔子陰性對(duì)照溶液，分別注入液相色譜儀中，進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示供試品與梔子苷在相應(yīng)位置有對(duì)應(yīng)的峰，陰性對(duì)照在相應(yīng)位置無(wú)對(duì)應(yīng)峰。結(jié)果見(jiàn)圖4。

3.5 線性關(guān)系考察 精密稱(chēng)取梔子苷對(duì)照品16.7mg，置25mL容量瓶中，加甲醇至刻度，制成668g/mL的溶液。精密取上述對(duì)照品溶液分別稀釋成25.05、50.1、100.2、133.6、200.4、267.2μg/mL的對(duì)照品溶液，注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定峰面積；以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，以梔子苷進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)作線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y=1493.52597X+10.24901，結(jié)果表明，梔子苷在0.2505～2.672μg之間呈良好線性關(guān)系。

3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取舒肝顆粒同一供試品溶液，在0、2、4、7、9h分別進(jìn)樣10μL，其峰面積值分別為706.67590、729.11920、683.20715、716.02106、703.53308，RSD=2.39%，結(jié)果表明，在9h內(nèi)供試品溶液中的梔子苷穩(wěn)定。

3.7 精密度試驗(yàn) 分別精密吸取對(duì)照品溶液（176μg /mL）各5μL，按測(cè)定方法重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積值。各次測(cè)得的峰面積值分別是1543.17090、1503.70020、1536.67627、1535.26611、1533.99133、1500.86377，平均值為1525.61143，RSD為1.20%。

3.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取批號(hào)為150821的舒肝顆粒，按正文所列的含量測(cè)定方法，分別制備9份供試品溶液，分別測(cè)定梔子苷含量，梔子苷平均含量為0.5507mg/g，RSD為1.27%（n=9），說(shuō)明本方法重復(fù)性良好。

3.9 回收率試驗(yàn) 采取全程加樣法。取已知含量的樣品（批號(hào)：150821，梔子苷含量：0.5507mg/g）9份，精密稱(chēng)定，分成3組，分別精密加入高、中、低三組劑量的梔子苷對(duì)照品，按樣品測(cè)定方法測(cè)定梔子苷含量，平均回收率為97.98%，RSD=2.26%。結(jié)果見(jiàn)表1。

3.10 耐用性試驗(yàn) 取同一批號(hào)的樣品，照樣品含量測(cè)定方法，分別變動(dòng)樣品測(cè)定的色譜條件，測(cè)定梔子苷含量。以考察測(cè)定條件有小的變動(dòng)時(shí)，測(cè)定結(jié)果不受影響的承受程度。分別于不同流動(dòng)相乙腈-水（9∶91）、（10∶90）、（11∶89）測(cè)定樣品中梔子苷含量，RSD為2.59%；分別于不同流速（0.9、1.0、1.1mL/min）測(cè)定樣品中梔子苷含量，RSD為0.05%；分別于不同柱溫（20、30、40℃）測(cè)定樣品中梔子苷含量，RSD為2.31%；分別于不同波長(zhǎng)（228、238、248nm）測(cè)定樣品中梔子苷含量，RSD為2.32%；分別于不同色譜柱測(cè)定樣品中梔子苷含量，RSD為2.33%。其結(jié)果表明耐用性良好。

3.11 樣品測(cè)定結(jié)果 20批舒肝顆粒的測(cè)定結(jié)果，樣品含量見(jiàn)表2。

4 討論

4.1 含量測(cè)定中，首先進(jìn)行檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇：精密稱(chēng)取梔子苷對(duì)照品適量，加50%甲醇制成每1mL含17.568μg/mL的溶液，在紫外可見(jiàn)分光光度儀上進(jìn)行梔子苷的紫外光譜掃描，得到梔子苷的紫外吸收光譜，可見(jiàn)梔子苷在238nm處有最大吸收，故選擇238nm作為梔子苷的檢測(cè)波長(zhǎng)。流動(dòng)相的選擇：曾以甲醇-水（20∶80）；乙腈-水（9∶91）（10∶90）；乙腈-0.1%磷酸（10∶90）分別做流動(dòng)相試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果表明：采用乙腈-水（10∶90）作為流動(dòng)相，梔子苷與其他組分的分離度能達(dá)到要求，空白試驗(yàn)也無(wú)干擾，故選用。

4.2 分別對(duì)供試品制備中的提取溶劑、提取方法和提取時(shí)間、提取溶劑用量進(jìn)行了考察。分別采用甲醇、乙醇、70%乙醇、50%乙醇進(jìn)行提取，實(shí)驗(yàn)表明甲醇和50%乙醇提取的梔子苷含量相近，但因50%乙醇提取濾過(guò)液困難，故選取甲醇作為提取溶劑?？疾炝顺曁幚?0min、30min、40min、60min，對(duì)梔子苷含量的影響，結(jié)果表明超聲處理30min已提取完全?？疾炝?5mL、25mL、40mL三種不同用量，結(jié)果表明提取溶劑加入25mL基本提取完全。故確定供試品的制備方法為：加甲醇25mL超聲提取30min。

參考文獻(xiàn)

[1]國(guó)家藥品監(jiān)督管理局.中藥新藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究的技術(shù)要求[R].

[2]國(guó)家藥典委員會(huì)編.中華人民共和國(guó)藥典（一部）[S]. 北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015.

（編輯：熊金富）