張愛(ài)民++郝海燕++郝旺勝++馬振華

[摘要] 目的 探討斑貞1號(hào)、川芎嗪（TMP）和五氟尿嘧啶（5-FU）聯(lián)合逆轉(zhuǎn)人胃癌細(xì)胞系SGC-7901/ADR與ERCC1表達(dá)的影響。 方法 采用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR），監(jiān)測(cè)人胃癌細(xì)胞SGC-7901/ADR細(xì)胞在5-FU組、斑貞1號(hào)組、斑貞1號(hào)+5-FU組、斑貞1號(hào)+5-FU+TMP組切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1（ERCC1）mRNA的表達(dá)情況。 結(jié)果 5-FU組與陰性對(duì)照組比較，ERCC1 mRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），而5-FU聯(lián)合中藥斑貞1號(hào)及TMP處理組ERCC1mRNA表達(dá)量明顯升高（P<0.05）。 結(jié)論 斑貞1號(hào)、TMP和5-FU聯(lián)合逆轉(zhuǎn)SGC-7901/ADR細(xì)胞耐藥性可能與ERCC1基因相關(guān)，為當(dāng)前胃癌的治療提供了新的理論依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 胃癌；斑貞1號(hào)；TMP；5-FU；多藥耐藥；ERCC1基因

[中圖分類(lèi)號(hào)] R735.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2016）26-0034-03

胃癌是中國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，至今為止手術(shù)仍是胃癌的主要治療方法，因早癌診斷率低，70%患者失去手術(shù)機(jī)會(huì)，所以化療顯得非常重要，但目前最大的問(wèn)題是胃癌多藥耐藥性（MDR），近幾年發(fā)現(xiàn)[1，2]ERCC1參與胃癌的多藥耐藥，并起重要作用，本課題組侯培珍等[3]研究結(jié)果示斑貞1號(hào)、5-FU和TMP聯(lián)合對(duì)人胃癌有逆轉(zhuǎn)作用。本課題采用RT-PCR方法比較人胃癌細(xì)胞（SGC-7901/ADR）經(jīng)過(guò)不同藥物組治療后的ERCC1 mRNA的表達(dá)量，進(jìn)一步探討各藥物組對(duì)人胃癌SGC-7901/ADR細(xì)胞的作用機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系

胃癌SGC-7901/ADR細(xì)胞，第四軍醫(yī)大贈(zèng)。

1.2 藥物、試劑及主要儀器

自擬“斑貞1號(hào)”每毫升含露蜂房、山茱萸、斑蝥、女貞子各0.2 g。5-FU（規(guī)格：10 mL：0.25 g，國(guó)藥準(zhǔn)字H31020593，上海旭東海普藥業(yè)有限公司）、TMP（規(guī)格40 mg，國(guó)藥準(zhǔn)字H20031302，安徽制藥），RPMI1640培養(yǎng)基（RPMI為Roswell Park Memorial Institute縮寫(xiě)，1640是培養(yǎng)基代號(hào)，其中含有10%胎牛血清，美國(guó)GIBCO北京有限公司），二甲基亞砜、胰蛋白酶（美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品），新生小牛血清（杭州四季青公司），兩步法RT-PCR試劑盒（大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品），引物片段（上海生物工程公司），PCR擴(kuò)增儀（Ambion 公司）、電泳儀及紫外分光度計(jì)（北京六一公司），Trizol（TakaRa公司），紫外透視成像系統(tǒng)（上海精科實(shí)業(yè)有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1細(xì)胞處理 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，以5×104/mL濃度接種于6孔板上，每孔用吸管加入2 mL，然后培養(yǎng)24 h，然后分為五組；對(duì)照組、5-FU組、斑貞1號(hào)組、斑貞1號(hào)+5-FU、斑貞1號(hào)+ 5-FU+TMP，分別加入等量的新的培養(yǎng)液，5-FU稀釋液、斑貞1號(hào)稀釋液、斑貞1號(hào)+5-FU稀釋液、斑貞1號(hào)+5-FU+TMP稀釋液。培養(yǎng)48 h后，經(jīng)過(guò)PBS緩沖液沖洗，提取總mRNA。

1.3.2 RT-PCR 提取細(xì)胞中的總RNA：以mRNA為模板，采用Oligo隨機(jī)引物，利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。然后再以cDNA作為模板PCR擴(kuò)增，瓊脂糖電泳并拍照，分析電泳條帶灰度值，檢查基因mRNA轉(zhuǎn)錄相對(duì)量的變化。具體步驟如下：以mRNA為模板經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA， 每個(gè)反應(yīng)體系25 μL，目的基因引物各0.5 μL，Takara Taq 1 μL，10×PCR Buffer（Mg2+Plus）2.5 μL，dNTP Mixture 2 μL，ddH2O 13.5 μL；各樣品cDNA 5 μL，滅菌蒸餾水13.5 μL。經(jīng)過(guò)預(yù)變性→變性→退火→延伸，（PCR擴(kuò)增條件分別為94℃ 1 min，58℃ 30 s，72℃ 45 s，72℃ 10 min），共30個(gè)循環(huán)，最后延伸72℃ 10 min，擴(kuò)增結(jié)束，取10 μL樣品，跑電泳60 min，（經(jīng)100 V恒壓，2%瓊脂糖）然后采集電泳圖像，得出各電泳帶光密度值，β -action引物正義列為5-GTGGG GCGCAGGCACCA-3，反義列為5-CTCCTTAATACGCACGATTTC-3ERCC1基因引物序列的正義列引5-TCAGACCTTCGCCGTATATGC-3，反義列引物為5-ACATCCACATGGACCAG-CAGG-3。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，進(jìn)行方差分析及LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌SGC-7901/ADR細(xì)胞ERCC1 mRNA的表達(dá)情況

5-FU組與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。其他藥物組與對(duì)照組相比及組間比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表1。

2.2 ERCC1和對(duì)照基因β-action的RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖分離后電泳圖

切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1（ERCC1）和對(duì)照基因（β-action）的RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖分離后分別位于354bp和548bp，見(jiàn)圖1。

A、B、C、D、E 分別代表的是陰性對(duì)照組（5-FU組、斑貞1號(hào)組、斑貞1號(hào)+5-FU組、斑貞1號(hào)+5-FU+TMP組）ERCC1的表達(dá)，A1、B1、C1、D1、E1分別代表的是陰性對(duì)照組（5-FU組、斑貞1號(hào)組、斑貞1號(hào)+5-FU組、斑貞1號(hào)+5-FU+TMP組）β-action的表達(dá)

圖1 ERCC1和對(duì)照基因β-action的RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖分離后電泳圖

3 討論

目前我國(guó)胃癌發(fā)病率及死亡率位居惡性腫瘤第三位[4]，化療是胃癌治療中其重要作用，但大部分藥物因多藥耐藥（MDR）使化療失敗[5]。

近年研究發(fā)現(xiàn)ERCC1基因與惡性腫瘤的多藥耐藥及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、療效預(yù)測(cè)及預(yù)后相關(guān)。此基因在許多腫瘤組織中表達(dá)低下，對(duì)頭頸部鱗癌的研究發(fā)現(xiàn)，ERCC1水平低表達(dá)可能是發(fā)生頭頸部癌的危險(xiǎn)因素，在對(duì)食管癌和胃食管結(jié)合部癌的研究中，發(fā)現(xiàn)ERCC1的表達(dá)降低與惡性腫瘤的發(fā)病率增加有關(guān)，在胃癌的研究中也得到了相似的結(jié)果。在胃癌的研究中發(fā)現(xiàn)[6]ERCC1的表達(dá)水平與化療敏感性密切相關(guān)，認(rèn)為其表達(dá)水平對(duì)進(jìn)展期胃癌患者的臨床療效進(jìn)行有效預(yù)測(cè)。馬冬等[7]回顧性分析發(fā)現(xiàn)ERCC1 表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)而與腫瘤大小、浸潤(rùn)深度無(wú)關(guān)。而胡鏘、于東風(fēng)等[8]研究卻發(fā)現(xiàn)此基因表達(dá)水平與患者性別、年齡、組織學(xué)類(lèi)型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無(wú)相關(guān)性。而李紫燕等[9]研究發(fā)現(xiàn)此基因在胃癌組織中表達(dá)水平與患者年齡、腫瘤部位、組織學(xué)類(lèi)型、分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)均無(wú)關(guān)，而與性別有相關(guān)，趙國(guó)華、吳杰等[10]發(fā)現(xiàn)ERCC1陰性的胃癌患者采用5-Fu 和奧沙利鉑化療的療效更好。李紅等[11]研究發(fā)現(xiàn)ERCC1 在胃癌組織中的表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)及研究中，有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)明顯差異，本課題組先前已證實(shí)胃癌細(xì)胞對(duì)5-FU耐藥性，ERCC1（切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因）是Westerveld等在1984年發(fā)現(xiàn)的，此基因定位于人類(lèi)第19號(hào)染色體短臂13.2～13.3位點(diǎn)上，大小為15 kb，ERCC1基因擁有四種分子量的mRNA，但只有1.1kb mRNA具有核苷酸切除修復(fù)作用。關(guān)于腫瘤發(fā)生和發(fā)展的學(xué)說(shuō)認(rèn)為腫瘤是致癌相關(guān)的危險(xiǎn)因素暴露造成DNA損傷，再加上DNA修復(fù)基因表達(dá)低下造成基因損傷不斷地在上皮細(xì)胞內(nèi)累積導(dǎo)致癌基因和抑癌基因突變等一系列連續(xù)事件作用的結(jié)果。ERCC1基因表達(dá)低下影響細(xì)胞對(duì)DNA加合物及核苷酸損傷的修復(fù)，可導(dǎo)致p53、K-RAS基因突變?cè)黾?，從而增加惡性腫瘤的發(fā)生率[12]。ERCC1修復(fù)了損傷的基因，使基因組保持完好，減少了癌變相關(guān)基因的出現(xiàn)，使細(xì)胞能保持正常的生物學(xué)活性，從而減少癌變的幾率，降低了腫瘤的發(fā)病率[13，14]。

斑貞1號(hào)合劑（斑蝥、露蜂房、女貞子、山茱萸），斑蝥能抑制腫瘤細(xì)胞DNA和RNA合成，殺傷腫瘤。它對(duì)HeLa細(xì)胞及人食管、胃、肝、乳腺癌細(xì)胞均有抑制作用，能促進(jìn)造血干細(xì)胞分化，加速粒細(xì)胞的釋放，很好地對(duì)抗了放化療中血細(xì)胞下降，減少了不良反應(yīng)。TMP通過(guò)多種途徑對(duì)腫瘤起到治療和逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的作用。楊葉等[15]已證實(shí)TMP能增加5-FU對(duì)胃癌化療的敏感性。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)斑貞1號(hào)、5-FU和TMP三聯(lián)藥物處理組胃癌細(xì)胞ERCC1 mRNA 表達(dá)量高于其他用藥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說(shuō)明三種藥聯(lián)合可顯著提高ERCC1 mRNA的高表達(dá)，增強(qiáng)了治療效果。

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（收稿日期：2016-06-04）