陳愉生，涂洵崴，俞梅娥，陳正偉，李鴻茹，鐘秀容，周琳瑛

(福建醫(yī)科大學省立臨床醫(yī)學院，福州 350001)

?

裸鼠肺癌腦轉移模型中血腦屏障超微結構的觀察

陳愉生，涂洵崴，俞梅娥，陳正偉，李鴻茹，鐘秀容，周琳瑛

(福建醫(yī)科大學省立臨床醫(yī)學院，福州 350001)

目的 通過硝酸鑭示蹤電鏡技術觀察裸鼠肺癌腦轉移模型中血腦屏障的超微結構。方法 從8只BALB/c裸鼠隨機選取6只經左心室注射的方法，接種處于對數(shù)期生長的人肺腺癌細胞PC-9 (1×106/0.1 mL)，作為模型組；另2只裸鼠未經任何處理作為空白組。接種后觀察裸鼠狀態(tài)，在第4周行硝酸鑭示蹤電鏡技術觀察血腦屏障的超微結構，并留取肺、腦臟器，病理HE染色觀察。結果 模型組裸鼠于第3周開始出現(xiàn)體重減輕，并逐漸出現(xiàn)惡液質，全部裸鼠于第4周處死。肉眼取材時，胸廓、肺、腦、臟器均未見到轉移灶。HE染色示：模型組裸鼠均出現(xiàn)大小不一的多發(fā)腦轉移灶。硝酸鑭示蹤電鏡示，模型組可見硝酸鑭顆粒侵入到血管腔外，稀疏或者彌漫地分布在腦組織中，空白組鑭顆粒僅沉積在血管腔內。結論 彌散分布地鑭顆粒說明了模型中血腦屏障結構的不完整性，而肺癌腦轉移的發(fā)生伴隨著血腦屏障結構的破壞。

肺癌腦轉移；血腦屏障；硝酸鑭；透射電鏡；左心室注射；裸鼠

肺癌最常見的遠處轉移部位之一是腦部，肺癌腦轉移的發(fā)生率為23%～65%，是腦轉移性腫瘤中最常見的類型[1]。血腦屏障(blood-brain barrier, BBB)是位于腦組織與血液間的一個復雜系統(tǒng)，它能阻止血流中的大多數(shù)物質進入中樞神經系統(tǒng)，在維持中樞神經系統(tǒng)內環(huán)境的穩(wěn)定中起著十分重要的作用。相關研究表明[2-4]，外傷、缺血缺氧、感染、免疫、腫瘤發(fā)生及理化因素的改變等均可引起血腦屏障緊密連接的結構與功能發(fā)生改變，造成BBB的損害，進而導致中樞神經系統(tǒng)的相關病變。本研究首先通過建立肺癌腦轉移實驗動物模型，然后行硝酸鑭示蹤電鏡技術觀察腦轉移過程中血腦屏障超微結構的變化情況。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 裸鼠與細胞

BALB/c裸鼠購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司【SCXK(滬)2012-002】，8只，體重( 16±2)g/只，4～ 6周齡，均為雌性，飼養(yǎng)于福建醫(yī)科大學動物實驗中心SPF級動物室【SYXK(閩)2012-0001】；所用的飼料、水、墊料都經過嚴格滅菌處理，并按動物實驗的3R原則給予人道的關懷。PC-9人肺腺癌細胞系由華中科技大學同濟醫(yī)學院同濟醫(yī)院分子醫(yī)學中心惠贈。

1.1.2 試劑與設備

RPMI 1640培養(yǎng)基(HyClone，美國)、胎牛血清(杭州四季青，中國)、0.25% Trypsin-EDTA(Gibco，美國)、Pen-strep(Gibco，美國)、硝酸鑭LaNO3(成都，西亞)、25%戊二醛水溶液(上海，Alfa Aesar)、二甲砷酸鈉(成都，西亞)、氫氧化鈉(汕頭，西隴)、多聚甲醛(天津，科密歐)、倒置顯微鏡(奧林巴斯，日本)、生物安全柜和CO2培養(yǎng)箱(三洋，日本)，EM208型透射電子顯微鏡(Philips，荷蘭)。

1.2 方法

1.2.1 細胞準備

PC-9細胞常規(guī)培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)液(10% FBS + 1%雙抗 + 1% Glu)中，于37℃含有5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細胞，經胰酶消化制備細胞懸液，以1000 r/min離心5 min，棄去上清液。加入無血清的1640培養(yǎng)基，吹打、再次1000 r/min離心5 min，以無血清培養(yǎng)基稀釋至細胞密度為1×107個/mL的單細胞懸液。

1.2.2 裸鼠肺癌腦轉移實驗動物模型的建立

6只裸鼠經麻醉固定后，于胸骨左緣第二肋間旁開2 mm處進針(進針前調節(jié)好BD針頭至滯留空氣0.05 mL左右后，再吸取細胞液；進針3～5 mm,以觀察到血液噴射涌出作為進入左心室的標準；并在10 s內完成注射)，注入腫瘤細胞懸液0.1 mL(即1×106個腫瘤細胞)，注射完畢后快速拔針，棉簽按壓進針點。接種后的裸鼠置于SPF環(huán)境內繼續(xù)飼養(yǎng), 并密切觀察裸鼠的精神狀態(tài)、一般情況等。當裸鼠出現(xiàn)嚴重惡液質時行硝酸鑭示蹤電鏡技術觀察血腦屏障的超微結構，并予以處死，留取腦、肺臟器，經脫水固定、石蠟包埋、切片、HE染色觀察。

1.2.3 相關試劑的配置

1% LaNO3-2%多聚甲醛-0.1 mol/L 二甲砷酸鈉緩沖液(cacodylate buffer solution, CBS)灌流固定液的配置：稱取硝酸鑭0.5 g于燒杯中，加入蒸餾水5 mL，用1mol/L NaOH調制乳白色；再依次加入8%多聚甲醛12.6 mL，0.2 mol/L二甲砷酸鈉緩沖液25 mL，最后加蒸餾水定容至50 mL左右(注意：當加入多聚甲醛時，燒杯中會出現(xiàn)白色沉淀，期間可于60℃水浴箱加熱，并且不斷攪拌，待白色沉淀逐漸減少，1mol/L NaOH調溶液pH值至7.4左右即可)。

1% LaNO3-3%戊二醛-1.5%多聚甲醛-0.1 mol/L CBS前固定液的配置：稱取硝酸鑭0.5 g于燒杯中，加入蒸餾水5 mL，用1mol/L NaOH調制乳白色；再依次加入25%戊二醛6 mL，8%多聚甲醛9.5 mL，0.2 mol/L二甲胂酸鈉緩沖液25 mL，最后加蒸餾水定容至50 mL左右。

1% LaNO3-0.1 mol/L CBS漂洗液的配置：先稱取2 g硝酸鑭溶于100 mL蒸餾水中，配成2% LaNO3溶液；再與等體積的0.2 mol/L CBS混合，即為1% LaNO3-0.1mol/L CBS漂洗液。

其他后固定、脫水液等試劑的配置都必須保證其內含有1份子水平的LaNO3。

1.2.4 硝酸鑭示蹤電鏡技術

8只裸鼠經5%水合氯醛0.2 mL腹腔麻醉后，打開胸腔，固定心臟，左心室進針，右心房開小口，先用0.9%生理鹽水灌注約10 mL至右心房流出液體變淺、肝臟變白，再經1% LaNO3-2%多聚甲醛-0.1 mol/L CBS灌流固定液灌注5 mL左右(裸鼠出現(xiàn)四肢強直即可)，開顱取出腦組織，隨機剪取多個1 mm3大小組織塊，經1% LaNO3-0.1 mol/L CBS漂洗液漂洗，1% LaNO3-3%戊二醛-1.5%多聚甲醛-0.1 mol/L CBS前固定液4℃固定過夜，1%鋨酸-1% LaNO3后固定，系列酒精、丙酮脫水，環(huán)氧樹脂618包埋。超薄切片經鉛染色后，EM208型透射電子顯微鏡下觀察并拍照。

注: A.第四周惡液質裸鼠(模型組)；B、C、D.裸鼠胸腔-肺-腦形態(tài)(模型組)；E、F. 病理HE示多發(fā)腦轉移灶(模型組)(HE 染色. ×10)。圖1 裸鼠解剖-病理形態(tài)Note. A: A model nude mouse showing cachexia at the fourth week; B-D: Thorax, lung and brain at autopsy in a mouse of the model group; E-F: Metastatic lesions in the brain of a model mouse. Fig.1 Gross and histological features of the nude mice

2 結果

2.1 裸鼠情況

模型組裸鼠于第3周普遍開始出現(xiàn)體重減輕，并逐漸出現(xiàn)惡液質(具體表現(xiàn)為弓背、消瘦、精神萎靡、呼吸急促、偏癱等)(圖1-A)，全部裸鼠于第4周處死。開胸后：胸腔視野未見異常(圖1-B)；肺、腦臟器肉眼取材時未見到轉移灶(圖1C-D)。病理HE示：模型組6只裸鼠均出現(xiàn)大小不一的多發(fā)腦轉移灶(圖1E-F)。肺組織切片未見轉移灶形成。

2.2 血腦屏障超微結構觀察

血腦屏障主要是由腦微血管內皮細胞及其間的緊密連接、基底膜、星形膠質細胞組成。硝酸鑭作為小分子物質，正常情況下不能通過血腦屏障，進入腦組織內，所以硝酸鑭可作為早期示蹤劑用于判斷BBB的完整性。如圖2A-B可見硝酸鑭顆粒稀疏或者成團點狀地分布于血管腔內，內皮細胞間以及內皮細胞與基底膜間完整，鑭顆粒并未滲透到管腔外、周圍腦組織中，見于空白組，提示完整的BBB結構；圖2C-D見于模型組腦組織中，可見硝酸鑭顆粒部分殘留于血管腔內，部分則稀疏或者彌散地分布在腦組織中，提示BBB結構的破壞。另外，在模型組取材時，幸運地取到帶有結節(jié)灶的腦組織塊，如圖2E-F所示，可見成團分布的PC-9人肺腺癌細胞，期間尚可見到正常腦組織的髓鞘，而硝酸鑭顆粒散落分布在PC-9細胞周圍。

注：A、B.硝酸鑭顆粒沉積在血管腔內(空白組)；C.硝酸鑭顆粒彌散地分布在腦組織中，伴腦組織水腫(模型組)；D.硝酸鑭顆粒部分沉積在血管腔，部分彌散到管腔外、腦組織中(模型組)；E、F. PC-9腫瘤細胞團(模型組)。圖2 血腦屏障超微結構Note. A-B: Lathanum nitrate tracer remained in the inner wall of capillary in a control mouse. TEM, ×16000/20000. C-D: Lathanum nitrate tracer distributed sparsely or diffusely in the brain parenchymal tissues in the model mice. TEM, ×8000/31500; E-F: Lathanum nitrate tracer was seen between the tumor cells, TEM, ×5000/6300. Arrows pointed to the lathanum nitrate tracer).Fig.2 Ultrastructure of the blood-brain barrier

3 討論

鑭作為重金屬元素，在電鏡下因電子密度高而易見其沉淀物。硝酸鑭顆粒分子量為433 U，粒徑約為4 nm，在正常情況下，難以通過完整的細胞膜和緊密連接結構。在某些病變的早期，雖然未見細胞形態(tài)學改變，但細胞膜或者緊密連接結構已有部分破壞，此時鑭顆?？赏ㄟ^細胞膜和緊密連接為早期病變提供形態(tài)依據[5]。血腦屏障主要由腦微血管內皮細胞、星形膠質細胞足突、周細胞和基底膜組成，而腦微血管內皮及其間的緊密連接又是血腦屏障結構功能的基礎。故本實驗擬通過硝酸鑭示蹤技術觀察裸鼠肺癌腦轉移中血腦屏障結構情況。

根據課題組前期建模[6]發(fā)現(xiàn)，經左心室注射的方法可以保證100%的腦部成瘤率，且裸鼠生存情況相對一致，故在本次實驗中選擇建模第4周的裸鼠行硝酸鑭示蹤電鏡技術觀察血腦屏障超微結構的變化情況(此時，裸鼠出現(xiàn)嚴重惡液質并且體重下降到原來20%)。電鏡結果顯示：空白對照組可見硝酸鑭顆粒成團地、不規(guī)則地沉積在血管腔內，但未滲透到管腔外、腦組織中，切面中可見的內皮細胞及基底膜結構保持完整；而模型組中，硝酸鑭顆粒除了部分沉積在血管腔內，部分則稀疏或者彌漫地分布在腦組織中，但圖中并未見到明顯的內皮細胞或者基底膜的破壞，我們考慮這可能與標本取材、切面方向等有關。另外，我們幸運地取到帶有轉移灶的腦組織塊，雖然當時肉眼并未見到瘤結，但電鏡結果卻看到了成團分布的PC-9腫瘤細胞，細胞周圍可見到正常髓鞘組織，而硝酸鑭顆粒零星地分布在腫瘤細胞周圍，并未進入腫瘤細胞內。再結合病理HE結果，我們推測，肺癌腦轉移的發(fā)生伴隨著血腦屏障超微結構的改變：腫瘤細胞在破壞血腦屏障結構的完整性后，才有可能穿過血腦屏障，進入腦組織形成轉移灶。而腫瘤細胞是如何引起血腦屏障緊密連接結構功能的改變？腦轉移形成的具體機制？尚需進一步研究。有研究表明鈣激活鉀通道的激活[7]能導致了BBB通透性的改變。

硝酸鑭作為示蹤劑，近年來被廣泛用于觀察體內某些生物屏障超微結構的變化情況[8-14]。硝酸鑭示蹤電鏡技術與常規(guī)電鏡觀察技術相比的優(yōu)勢，在于其能夠早期發(fā)現(xiàn)病灶的微小變化。但是硝酸鑭示蹤電鏡技術對材料試劑的準備、配置要求比較高；試劑的劑量、酸堿度、濃度值是影響實驗結果的關鍵。由于電鏡取材塊大小要求在1 mm3左右，故可將剩余組織用于病理HE染色觀察成瘤情況。鐘秀容等[15]提到使用1% LaNO3-1%戊二醛-1%多聚甲醛-0.1 mol/L CBS比例的灌流液，但考慮到戊二醛會影響光鏡下病理HE染色的觀察，故在本實驗中考慮不使用戊二醛成分參與灌流液的配置，而相應地提高了多聚甲醛的濃度，故最終使用1% LaNO3-2%多聚甲醛-0.1 mol/L CBS的灌流液。

吳松笛等[16]在研究急性腦缺血再灌注損傷中血腦屏障變化情況時，就通過硝酸鑭示蹤電鏡的方法觀察缺血再灌注不同時間點血腦屏障超微結構變化情況，結果動態(tài)地反應了鑭顆粒滲透通過BBB的過程及細胞微結構的變化。而在本次實驗中，我們僅對末期裸鼠進行硝酸鑭示蹤實驗，倘若對同批裸鼠在分不同時間段進行硝酸鑭示蹤，是否能夠進一步客觀動態(tài)地觀察到肺癌腦轉移早、中期血腦屏障超微結構的變化：如硝酸鑭顆粒滲透到內皮細胞間；滲透到內皮細胞層與基底膜間，內皮細胞及基底膜或者星形膠質細胞足突的破壞等。此外，吳波等[17]在研究大鼠腦膠質瘤血腦屏障結構時，發(fā)現(xiàn)膠質瘤可以導致緊密連接開放，進而導致BBB通透性增大，而膠質瘤誘導屏障功能破壞的能力隨其距腫瘤距離增加而減弱。而在本次實驗中，由于肉眼取材時并不能見到轉移灶，且取材塊小，存在隨機性，因此我們就腦轉移灶與其附近微血管屏障結構功能的關系尚無法判斷。但彌散分布在腦組織中的硝酸鑭顆粒間接說明了血腦屏障緊密連接結構的破壞，因此我們推測，肺癌腦轉移的發(fā)生伴隨著血腦屏障結構的改變。

[1] Preusser M, Capper D, Ilhan-Mutlu A, et al. Brain metastases: pathobiology and emerging targeted therapies [J]. Acta Neuropathol, 2012, 123(2): 205-222.

[2] Wolburg H, Lippoldt A. Tight junctions of the blood brain barrier: development, composition and regulation [J].Vascul Pharmacol, 2002, 38: 323-337.

[3] Hawkins BT, Davis TP. The blood brain barrier/neurovascular unit in health and disease [J]. Pharmacol Rev, 2005, 57: 173-185.

[4] Gloor SM, Wachtel M, Bolliger MF, et al. Molecular and cellular permeability control at the blood brain barrier [J]. Brain Res Rev, 2001, 36: 258-264.

[5] 鐘秀容，周琳瑛， 陳文列，等. 三種電鏡技術在細胞緊密連接研究中的應用 [J]. 福建醫(yī)科大學學報，2002, 36(1): 103-105.

[6] 陳愉生，涂洵崴，俞梅娥, 等. 胸腔原位種植與經左心室注射建立肺癌腦轉移動物模型的比較 [J]. 中國實驗動物學報，2015, 23(5): 490-494.

[7] Ningaraj NS, Rao M, Hashizume K, et al. Regulaiton of blood brain tumor barrier permeability by calcium-activated potassium channels [J]. J Pharmacol Exp Ther, 2002, 301(3): 838-851.

[8] 劉增波，梅長林，胡惠民, 等. 鑭示蹤法透射電鏡顯示腎臟細胞糖萼的方法學研究 [J].臨床腎臟病雜志，2015，15(1): 42-46.

[9] 賈勤惠，賈國良，裴其應, 等. 兔頓抑心肌局部5-HT NE血小板聚集率及心肌超微結構改變 [J]. 心肺血管病雜志，2001, 20(1): 106-108.

[10] 彭頁，程義成，梅盛林, 等. 電磁脈沖輻照對小鼠血-睪屏障早期影響及TGFβ表達意義[J].中國體視學與圖像分析，2007, 12(1): 11-15.

[11] 邱萍，張作明，姜勇, 等. 次聲暴露對大鼠血視網膜屏障超微結構的損害 [J]. 中華眼科雜志，2002, 38(8): 499-501.

[12] 孔武明，龔均，董蕾, 等. 腸易激綜合征患者腸道屏障-緊密連接改變的示蹤電鏡觀察 [J]. 南方醫(yī)科大學學報，2007, 27(8): 1167-1172.

[13] 朱瑾，劉兆華. 水楊酸鈉對豚鼠內耳血管通透性的影響 [J]. 臨床耳鼻喉喉科雜志，2002, 16(12): 687-688.

[14] 崔光彬，魏經國，王瑋, 等. 博萊霉素對大鼠肺微血管內皮細胞緊密連接改變及Cx43表達變化的影響 [J]. 中華勞動衛(wèi)生職業(yè)病雜志，2006, 24(2): 99-102.

[15] 鐘秀容，昊翊欽，陳文列, 等. 大鼠松果體血腦屏障的電鏡細胞化學實驗觀察 [J]. 解剖學雜志，2001, 24(5): 440-443.

[16] 吳松笛，萬琪，夏峰, 等. 大鼠急性腦缺血再灌注后血腦屏障通透性的超微結構與血清S100B蛋白水平的動態(tài)變化 [J]. 第四軍醫(yī)大學學報，2006，27(10): 902-904.

[17] 吳波，游潮，黃光富, 等. 大鼠C6腦膠質瘤血腦屏障的硝酸鑭示蹤電鏡研究 [J]. 中國臨床神經外科雜志，2007, 12(1): 28-33.

Ultrastructural observation of blood-brain barrier in the nude mouse model of brain metastases from lung cancer

CHEN Yu-sheng*, TU Xun-wei, YU Mei-e, CHEN Zheng-wei,LI Hong-ru, ZHONG Xiu-rong， ZHOU Lin-ying

(Fujian Provincial Hospital, Fujian Medical University, Fuzhou 350001, China)

Objective To observe the ultrastructure of blood-brain barrier in the nude mouse model of brain metastases from lung cancer by transmission electron microscopy using lanthanum nitrate tracing. Methods PC-9 cells (1×106/0.1 mL) in logarithmic phase were respectively injected into six nude mice (model group) selected from eight nude mice randomly via the left ventricle, the other two mice without any treatment as the control group. The general status of the mice was observed after implantation. In the fourth week all the mice were sacrificed and brain tissue samples were taken and prepared for transmission electron microscopic observation using lanthanum nitrate tracing. besides, the lung and brain were removed and stained with HE to detect the presence of tumor metastasis. Results Mice in the model group began to lose weight almost simultaneously in the third week and became moribund slowly, and were all sacrificed at the fourth week when showing clear signs of cachexia. At autopsy, the thoraxes were clear, with normal lungs. Histology showed evidence of brain metastasis in all the six mice. The electron microscopy showed that lathanum nitrate tracer was escaped from the capillaries and diffusely or sparsely distributed in the brain tissues of the model group mice, however lathanum nitrate tracer was still confined in the capillary lumen in the mice of control group. Conclusions The diffuse lathanum nitrate tracer in the brain parenchymal tissue indicates the impairment of blood-brain barrier in the nude mouse model of lung cancer brain metastasis and the formation of these metastases is accompanied with the destruction of blood brain barrier.

Brain metastasis, lung cancer; Blood-brain barrier; Lanthanum nitrate; Transmission electron microscopy; Left ventricular injection; Nude mice

CHEN Yu-sheng. E-mail: slyyywb@126.com

國家衛(wèi)生和計劃生育委員會科研基金 (WKJ-FJ-17,2013-2016)；福建省立醫(yī)院優(yōu)秀青年醫(yī)師項目 (2014YNQN03)；福建省自然科學基金(2015J01376)。

陳愉生(1957年-)，女，教授，博士生導師。E-mail： slyyywb@126.com

研究報告

Q95-33

A

1005-4847(2016)05-0494-05

10.3969/j.issn.1005-4847.2016.05.010

2016-04-11