張利棕，方明筍，楊偉吉，蔡月琴，徐劍欽，壽旗揚(yáng)，陳民利

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)，杭州 310053)

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Lewis大鼠下丘腦中腎陽虛相關(guān)mRNA表達(dá)及超微結(jié)構(gòu)觀察

張利棕，方明筍，楊偉吉，蔡月琴，徐劍欽，壽旗揚(yáng)*，陳民利

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)，杭州 310053)

目的 通過對Lewis大鼠下丘腦腎陽虛相關(guān)基因表達(dá)和超微結(jié)構(gòu)的觀察，進(jìn)一步對Lewis大鼠腎陽虛體質(zhì)進(jìn)行研究。方法 采用Lewis大鼠與皮下注射氫化可的松法的腎陽虛模型進(jìn)行比較，并通過檢測各組大鼠下丘腦中TNF-α、IFN-γ、IL-10、CRH、MR、GR mRNA表達(dá)和下丘腦、腎上腺組織超微結(jié)構(gòu)的觀察等,對Lewis大鼠腎陽虛體質(zhì)機(jī)制進(jìn)行研究。結(jié)果 與正常Wistar大鼠比較，Lewis組大鼠下丘腦GR、IL-2 mRNA表達(dá)明顯升高(P<0.01)，而下丘腦CRH、TNF-α、IFN-γ、IL-10 mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.01)；Lewis大鼠腎上腺皮質(zhì)束狀帶略變薄，線粒體減少，且有輕微變形腫脹；Lewis大鼠下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞體胞核大，核形不規(guī)則，線粒體明顯減少，神經(jīng)細(xì)胞突觸減少，突觸前部的分泌小泡減少。結(jié)論 Lewis大鼠下丘腦和腎上腺存在一定程度的超微結(jié)構(gòu)改變，且免疫相關(guān)細(xì)胞因子和CRH mRNA的異常表達(dá)，這可能與其自身HPA軸的功能失衡有關(guān)。

Lewis大鼠；腎陽虛；mRNA表達(dá)；超微結(jié)構(gòu)

中醫(yī)認(rèn)為，腎陽是人之根本，腎陽虧虛造成機(jī)體酸冷、夜尿增多、脈象無力、舌淡苔白等虛寒癥候，即為腎陽虛證[1]。腎陽虛證動物模型是最早建立的中醫(yī)證候動物模型之一。腎陽虛證涉及多系統(tǒng)和多器官的功能失衡，與神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)關(guān)系密切，諸多腎陽虛動物模型確有類似腎陽虛證的臨床表現(xiàn)，但一定程度上有違腎陽虛患者下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamic-pitultary-adrenal，HPA)軸功能減退、血漿皮質(zhì)醇減少的病理改變，尚需從整體、微觀以及基因分子水平等方面對腎陽虛證進(jìn)行更加深入的研究。

Lewis大鼠作為一種實驗性腦脊髓炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等自身性免疫性疾病造模常用的實驗動物，其自身存在HPA軸功能的缺陷[2-3]。前期我們通過對Lewis大鼠表觀的一般體征、行為學(xué)和臨床腎陽虛證相關(guān)指標(biāo)(血清ACTH、CRH、Cort、尿液17OHCS)等的測定，發(fā)現(xiàn)Lewis大鼠可能具有先天性腎陽虛體質(zhì)[4]。

為進(jìn)一步探尋Lewis大鼠自發(fā)性腎陽虛的基因、分子及超微結(jié)構(gòu)等方面的證據(jù)，從微觀層次來解釋Lewis大鼠所具有的腎陽虛癥狀。本研究擬用Lewis大鼠與皮下注射氫化可的松(HYD)腎陽虛大鼠模型進(jìn)行比較，并通過對各組大鼠下丘腦中TNF-α、IFN-γ、IL-10、CRH、MR、GR mRNA表達(dá)和腎上腺、下丘腦組織超微結(jié)構(gòu)的觀察，為Lewis大鼠作為自發(fā)性腎陽虛體質(zhì)模型提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

SPF級雄性Lewis大鼠10只，7～8周齡， 體重240～260 g，購自北京維通利華實驗動物有限公司【SCXK(京)2012-0001】；SPF級雄性Wistar大鼠20只，7～8周齡，體重220～240 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司【SCXK(滬)2012-0002】。本實驗所有手術(shù)、操作均在浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心的屏障手術(shù)室中進(jìn)行【SYXK(浙)2013-0184】；所有涉及到實驗動物的使用與操作均遵循3R原則。

1.1.2 試劑

氫化可的松注射液：天津金耀藥業(yè)有限公司，批號：20130415，100 mg/20 mL(5 mg/mL)，5支/盒；戊巴比妥鈉：德國進(jìn)口分裝，批號：WS20120112，規(guī)格：25 g/瓶，含量>99.0%；戊二醛：上海化學(xué)試劑采購供應(yīng)五聯(lián)化工廠，批號：20110415；丙酮：杭州化學(xué)試劑有限公司，批號：20120730； ERL-4221(脂環(huán)肪族環(huán)氧樹脂)、DER(736聚二醇二縮水甘油醚樹脂)、DMAE(二甲氨基酸乙醇，美國SPI公司)；四氧化鋨(北京中鏡科儀技術(shù)有限公司)。

1.1.3 儀器設(shè)備

MLS-3020高壓滅菌鍋(日本三洋公司)；AF100雪花狀制冰機(jī)(美國Scotsman)；超低溫冰箱(Thermo)；AG204-電子分析天平(瑞士Mettler)；熒光定量PCR儀(Bio-Rad)；勻漿機(jī)(IKA)；冷凍高速離心機(jī)(Thermo)；微量核酸測定儀(Thermo)；生物安全柜(Thermo)；透射電鏡(日本Hitachi H7650型)；超薄切片機(jī)(德國Leica)。

1.2 方法

1.2.1 造模、分組及樣本取樣

(1)Lewis組：取10只Lewis大鼠，不作任何干預(yù)，飼養(yǎng)于IVC中，自由采食飲水，連續(xù)3周。

(2)Wistar正常組：隨機(jī)取10只Wistar大鼠，處理同Lewis組。

(3)Wistar-HYD組：隨機(jī)取10只Wistar大鼠，每只大鼠以15 mg/(kg·d)的劑量連續(xù)3周皮下注射HYD，建立腎陽虛模型。

造模過程中一周2次對各組大鼠的體重、肛溫、大便干濕程度、脫毛情況等體征指標(biāo)進(jìn)行測定和觀察。一周1次對各組大鼠測定24 h代謝、飲食量、飲水量和尿量，并記錄各項一般體征；處理動物前進(jìn)行曠場實驗和Morris水迷宮的行為學(xué)測定。造模完成后，各組大鼠麻醉后心臟抽血，斷頭取腦，在冰浴上分離出下丘腦，一部分裝入凍存管后迅速置于液氮罐中；取小塊腎上腺和下丘腦組織樣本，置于裝有2.5 %戊二醛的離心管中，用眼科剪剪碎至每粒約0.1 mm3大小。

1.2.2 下丘腦中TNF-α、IFN-γ、IL-10、CRH、MR、GR mRNA表達(dá)

以Trizol法提取5 μg各組大鼠下丘腦的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，用SYBR Green嵌合熒光法進(jìn)行實時PCR檢測TNF-α、IFN-γ、IL-10、CRH、MR、GR基因表達(dá)。實時定量PCR引物見表1。

表1 實時定量PCR引物

操作步驟：①取100 mg左右的下丘腦，置于2 mL的PE管中，剪碎，加入1 mL RNAiso Plus，冰浴上勻漿后抽提RNA；②用分光光度計紫外吸收測定RNA濃度及檢測其純度，凝膠電泳對RNA純度及完整性進(jìn)行檢測；③參考試劑盒說明書將樣品RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；④將轉(zhuǎn)錄好的cDNA模板參考說明書加入到PCR反應(yīng)混合液中，進(jìn)行實時定量PCR反應(yīng)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果計算目的基因和內(nèi)參基因的平均CT值以及△CT值，進(jìn)一步通過cDNA濃度梯度的log值對△CT值作圖，所得直線斜率絕對值接近于0，說明目標(biāo)基因和內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率相同，就可以通過2-△△CT方法進(jìn)行相對定量。

1.2.3 腎上腺和下丘腦組織超微結(jié)構(gòu)的觀察

將采集到的腎上腺和下丘腦組織樣本，進(jìn)行脫水，包埋，切片，透射電鏡觀察組織超微結(jié)構(gòu)的變化。

操作步驟：① PBS漂洗(15 min×3次)；② 鋨酸固定(1～2 h)；③ PBS漂洗(15 min×3次)；④ 脫水；⑤ 純酒精脫水3次，每次15 min；⑥ 純丙酮脫水3次，每次15 min；⑦ 包埋劑滲透:丙酮與包埋劑1∶1配置溶液滲透1 h；丙酮與包埋劑1∶3配置溶液滲透3 h；⑧ 包埋及70 ℃聚合；⑨ 取出聚合完成的樣品切片。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠下丘腦中CRH、GR、MR mRNA的變化

由表2結(jié)果可見，與Wistar正常組比較， Lewis組大鼠下丘腦GR mRNA表達(dá)明顯升高(P<0.01)，而下丘腦CRH mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.01)；Wistar-HYD組大鼠下丘腦CRH、GR、MR mRNA表達(dá)明顯升高(P<0.01)；說明未經(jīng)干預(yù)的Lewis組大鼠自身存在CRH基因表達(dá)低水平的現(xiàn)象。

表2 各組大鼠CRH、GR、MR mRNA的變化

注：與Wistar正常組比較，**P<0.01。

Note. Compared with the Wistar normal group,**P<0.01.

2.2 各組大鼠下丘腦中TNF-α、IL-2、IFN-γ、IL-10 mRNA的變化

由表3結(jié)果可見，與Wistar正常組比較， Lewis組大鼠下丘腦TNF-α、IFN-γ、IL-10 mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.01)，而下丘腦IL-2 mRNA表達(dá)明顯升高(P<0.01)；Wistar-HYD組大鼠下丘腦TNF-α、IFN-γ mRNA表達(dá)明顯升高(P<0.01)。

2.3 腎上腺和下丘腦組織超微結(jié)構(gòu)的觀察

由圖1結(jié)果可見，電鏡下觀察可見，Wistar正常組大鼠腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞呈規(guī)則多邊形，且成束排列，胞核呈圓形，較少異染色質(zhì)，胞內(nèi)存在大量形態(tài)規(guī)整的線粒體和較多的大而圓的脂滴。Lewis組大鼠腎上腺皮質(zhì)束狀帶略變薄，線粒體減少，且有輕微變形腫脹。Wistar-HYD組大鼠腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞排列的束狀帶變薄，細(xì)胞萎縮變小，細(xì)胞核質(zhì)比變大，胞核異染色質(zhì)增多，線粒體減少，且有明顯的變形腫脹，脂滴顆變小，并常見其中有高電子密度的物質(zhì)。

由圖2結(jié)果可見，Wistar正常組大鼠下丘腦細(xì)胞核圓整，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)正常豐富，突觸膜結(jié)構(gòu)清晰。Lewis組大鼠下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞體胞核大，核形不規(guī)則，線粒體明顯減少，神經(jīng)細(xì)胞突觸減少，突觸前部的分泌小泡減少。Wistar-HYD組大鼠模型組下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞體胞核大，核基質(zhì)變淡并出現(xiàn)空泡，核形輕微不規(guī)則，線粒體減少。

表3 各組大鼠TNF-α、IL-2、IFN-γ、IL-10 mRNA的變化

注：與Wistar正常組比較，**P<0.01。

Note. Compared with the normal Wistar rat group,**P<0.01.

圖1 三組大鼠腎上腺超微結(jié)構(gòu)觀察Fig.1 Observation of the ultrastructure of adrenal gland in rats of the three groups

通過電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，Lewis大鼠在腎上腺和下丘腦組織的超微結(jié)構(gòu)上均有與HYD組腎陽虛大鼠有著類似的病變，與Wistar正常組大鼠均有明顯的差異，提示Lewis大鼠自發(fā)性腎陽虛體質(zhì)的發(fā)生可能與HPA軸有關(guān)組織的超微結(jié)構(gòu)改變有著密切聯(lián)系。

3 討論

腎陽虛證常伴有體重、體溫下降，飲水尿量增多，下丘腦、垂體、腎上腺的病理改變以及HPA軸的功能失調(diào)等?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，HPA軸在維持著中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定方面起著重要作用，在HPA軸功能低下時，皮質(zhì)類固醇能抑制Th1細(xì)胞的產(chǎn)生，Th1細(xì)胞則分泌IL-2、INF-γ和TNF-α能刺激B淋巴細(xì)胞而產(chǎn)生大量的自身抗體，同時誘導(dǎo)TGF-β的生成，使機(jī)體易患自身免疫性疾病[5]。HPA軸不同環(huán)節(jié)和不同程度的功能失調(diào)是腎陽虛證的主要病理環(huán)節(jié)之一[6-7]，而腎陽虛證的主要病理基礎(chǔ)是下丘腦細(xì)胞的損傷和功能紊亂[8]。

構(gòu)建腎陽虛動物模型是腎陽虛證研究規(guī)范化、客觀化乃至科學(xué)化的重要環(huán)節(jié)。常見的腎陽虛模型主要有：藥物造模方法、手術(shù)造模方法及根據(jù)中醫(yī)病因病機(jī)造模方法等[9]，其中經(jīng)典的是外源性糖皮質(zhì)激素所致的腎虛模型。上述腎陽虛模型造模方法多單純模擬腎陽虛證某一方面的機(jī)體變化和病理損傷，雖建立了多種客觀診斷指標(biāo)，但總體上這類模型缺乏方法學(xué)和相關(guān)影響因素的研究，與臨床腎陽虛病癥表現(xiàn)及病機(jī)并不相符[10]。因此，建立符合中醫(yī)理論與中醫(yī)臨床證候特點相近，基于病因和病機(jī)的腎陽虛動物模型是腎陽虛證研究方面迫切需要解決的難題。

我們前期實驗證明了Lewis大鼠體內(nèi)存在HPA軸缺陷，與Wistar正常大鼠比較，Lewis大鼠體溫、抓力、曠場中水平運(yùn)動總距離均明顯降低；水迷宮上平臺時間和尿量略微明顯升高；尿液中17OHCS和血清中Cort、CRH、ACTH、cGMP均顯著降低(P<0.01)[4]。這些研究結(jié)果表明Lewis大鼠與腎陽虛大鼠在一般體征、行為學(xué)和17OHCS、Cort、CRH等腎陽虛標(biāo)志性指標(biāo)上存在著相似之處，因此我們認(rèn)為Lewis大鼠可能具有自發(fā)性腎陽虛體質(zhì)。

本實驗擬基于Lewis大鼠腎陽虛體質(zhì)的外在表現(xiàn)，通過Lewis大鼠與腎陽虛大鼠下丘腦中TNF-α、IFN-γ、IL-10、CRH、MR、GR mRNA表達(dá)和腎上腺、下丘腦組織超微結(jié)構(gòu)的對比，進(jìn)一步深入探尋Lewis大鼠自發(fā)性腎陽虛體質(zhì)的內(nèi)在證據(jù)。

通過實驗發(fā)現(xiàn)，與正常Wistar大鼠比較，Lewis組大鼠下丘腦GR、IL-2 mRNA表達(dá)明顯升高(P<0.01)，而下丘腦CRH、TNF-α、IFN-γ、IL-10 mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.01)；Lewis大鼠腎上腺皮質(zhì)束狀帶略變薄，線粒體減少，且有輕微變形腫脹；Lewis大鼠下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞體胞核大，核形不規(guī)則，線粒體明顯減少，神經(jīng)細(xì)胞突觸減少，突觸前部的分泌小泡減少。以上實驗結(jié)果證明，未經(jīng)干預(yù)處理的Lewis組大鼠存在自發(fā)性的CRH基因低水平表達(dá)、HPA軸的功能失衡，存在免疫相關(guān)細(xì)胞因子基因的異常表達(dá)，下丘腦和腎上腺組織一定程度的病理改變，提示Lewis大鼠具有自發(fā)性腎陽虛體質(zhì)，關(guān)于Lewis大鼠腎陽虛體質(zhì)機(jī)制有待進(jìn)一步的深入研究。

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Changes of the mRNA expression of "kidney yang deficiency"-related genes and ultrastructural observation of the hypothalamus in Lewis rats

ZHANG Li-zong, FANG Ming-sun , YANG Wei-ji , CAI Yue-qin,XU Jian-qin, SHOU Qi-yang*, CHEN Min-li

(Zhejiang Chinese Medical University. Hangzhou 310053, China)

Objective To observe the changes of mRNA expression related to kidney yang deficiency and the ultrastructure of hypothalamus in Lewis rats, and further study the constitution of kidney yang deficiency in Lewis rats. Methods Ten 7-8-week old SPF male Lewis rats and twenty 7-8-week old SPF male Wistar rats were used in this study. The rats received subcutaneous injection of hydrocortisone to establish kidney yang deficiency model. The expressions of TNF-α, IFN-γ, IL-10, CRH, MR and GR mRNA in the hypothalamus of the two groups were detected and the ultrastructural changes of hypothalamus and adrenal gland were observed to compare the differences between the two groups, and to explore the mechanism of kidney yang deficiency constitution in the Lewis rats. Results Compared with the normal Wistar rats, the expressions of GR and IL-2 mRNA in the hypothalamus were significantly increased (P<0.01), while the expressions of CRH, TNF-α, IFN-γ and IL-10 mRNA were significantly decreased in the Lewis rats (P<0.01). The zona fasciculata of the adrenal cortex was slightly thinner, the mitochondria were slightly swollen and the amount of mitochondria was decreased. The nuclei of hypothalamic neurons were larger, and the mitochondria, neuron synapses and secretory vesicles in the presynaptic neurons were decreased. Conclusions There are abnormal expression of immune-related cytokines and CRH mRNA, and ultrastructural changes in the hypothalamus and adrenal gland of Lewis rats with kidney yang deficiency. Such changes may be related to the functional imbalance of the hypothalamus-pituitury-adrenal axis.

Lewis rats; Wistar rat; Kidney yang deficiency; mRNA expression; Ultrastructure

SHOU Qi-yang. E-mail: sqy133@126.com

浙江省公益性技術(shù)應(yīng)用研究計劃(2015C37091)；國家自然科學(xué)基金(81573677)；浙江省自然科學(xué)基金(LY15H280006)；浙江中醫(yī)藥大學(xué)校級科技創(chuàng)新團(tuán)隊(XTD201301)。

張利棕(1981-)，男，實驗師，研究方向：實驗動物與動物實驗。E-mail： ryan_zlz@163.com

壽旗揚(yáng)(1979-)，男，副研究員，研究方向：比較醫(yī)學(xué)。E-mail： sqy133@126.com

研究報告

Q95-33

A

1005-4847(2016)05-0511-05

10.3969/j.issn.1005-4847.2016.05.013

2016-01-22