李清，王杰玉，張曉丹，張旭垠，馮煒煒，華克勤

(復旦大學附屬婦產科醫(yī)院，上海 200090)

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子宮腺肌病小鼠的藥物療效及其疼痛機制

李清，王杰玉，張曉丹，張旭垠，馮煒煒，華克勤*

(復旦大學附屬婦產科醫(yī)院，上海 200090)

目的 了解腺肌病小鼠藥物治療療效及疼痛機制。方法 他莫昔芬法建模。以不同藥物治療后，監(jiān)測小鼠動情周期，檢測5-HT、GnRH-R、NGF、NF的水平。結果 對照組5-HT水平明顯高于造模組。GnRH-R及NGF在正常內膜、在位內膜的表達顯著低于異位內膜。NF在正常內膜的表達顯著低于在位內膜、異位內膜。結論 與全量抑那通相似，半量抑那通可減緩腺肌病進展，但對動情周期影響無明顯優(yōu)勢。全量抑那通后使用達英-35可鞏固療效。5-HT可能在腺肌病疼痛機制中發(fā)揮作用。

子宮腺肌?。籌CR小鼠；模型；疼痛；治療

子宮腺肌病是一種常見的婦科疾病，在手術切除的子宮標本中，6%～40%有子宮腺肌病[1]。臨床上GnRH-a(gonadotropin-releasing hormone agonist，促性腺激素釋放激素類似物)可有效緩解癥狀，但長期應用易出現(xiàn)圍絕經期癥狀；低劑量GnRH-a可應用于子宮肌瘤及體重較輕的腺肌病患者，改善癥狀同時降低圍絕經期癥狀，但應用尚不普遍。研究指出，疼痛可能通過5-HT(5-hydroxytryptamine，5-羥色胺)和其他神經元系統(tǒng)起作用。而5-HT的代謝產物-褪黑素，可用來減輕內異癥患者的疼痛。本文擬構造腺肌病小鼠模型，并以褪黑素、GnRH-a、達英-35等處理小鼠，檢測與疼痛密切相關的抗體NGF(nerve growth factor，神經生長因子)，NF(neurofilament，神經纖絲)的表達，并檢測小鼠血清中5-HT水平及小鼠子宮GnRH-R(gonadotropin-releasing hormone receptor，促性腺激素釋放激素受體)，從而了解子宮腺肌病小鼠不同藥物治療方法及疼痛機制。

1 材料與方法

1.1 動物模型的制作

SPF級ICR雌性小鼠70只，體重1.8～2.2 g，來源于上海西普爾-必凱實驗動物有限公司[SCXK(滬)2013-0016]。無菌術在復旦大學醫(yī)學院實驗動物部屏障動物實驗設施[SYXK(滬)2014-0029]進行并按3R原則給予人道關懷。隨機分為造模組與對照組(各35只)。造模組小鼠于2～5 d ( day, 日齡)滴喂5 μL/g的花生油/卵磷脂/煉乳混合液(體積比2∶0.2∶3)，并加入2.7 μmol/kg的他莫昔芬( Sigma，T5648-100MG)。所有小鼠每天光照12 h，1～21 d均由母鼠哺乳飼養(yǎng)，22 d起與母鼠分籠，自由攝食飲水。

1.2 動物分組及藥物處理

造模組(M)及對照組(C)按照藥物處理的不同各分為7個亞組，每亞組5只小鼠。①模型驗證組(M1,C1)：49 d處死，驗證造模是否成功。②褪黑素組(M2,C2)：小鼠50 d起予褪黑素(上海源葉生物，Z01022LA13)100 μg灌胃，共10 d。③全量抑那通組(M3,C3)：小鼠50 d，予醋酸亮丙瑞林(上海源葉生物，TL0249-25MG)20 μg皮注處理，51～71 d予生理鹽水75 μg灌胃。④全量抑那通后達英組(M4,C4)：小鼠50 d，予醋酸亮丙瑞林20 μg皮注處理，51～71 d予達英-35 75 μg灌胃。⑤半量抑那通組(M5,C5)：小鼠50 d，予醋酸亮丙瑞林10 μg皮注處理， 51～71 d予生理鹽水75 μg灌胃。⑥半量抑那通后達英組(M6,C6)：小鼠50 d，予醋酸亮丙瑞林10 μg皮注處理，51～71 d予達英-35 75 μg灌胃。⑦空白組(M7,C7)：小鼠50 d時，予生理鹽水每只20 μg皮注處理。

1.3 動情周期檢測

隨機選擇造模組與對照組各組10只小鼠，于42、70 d，連續(xù)5 d行陰道脫落細胞法以瑞氏染液染色觀察其動情周期。

1.4 組織形態(tài)學觀察

M1、C1組于49 d、余亞組于75 d摘除雙側眼球取血后處死，取小鼠子宮石蠟包埋后行HE染色，光學顯微鏡下觀察肌層是否出現(xiàn)內膜成分浸潤并拍照。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附法檢測5-HT值

采用雙抗體夾心ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay，酶聯(lián)免疫吸附測定)法檢測小鼠血清中5-HT水平。比色法測定A(optical density，光密度)值，通過標準曲線得到細胞因子的質量濃度( ng/L)。試劑盒(北京城林生物，E-20434)。

1.6 免疫組化法檢測小鼠子宮NGF，NF，GnRH-R的表達

免疫組化法檢測小鼠子宮NGF ( Ab6199, 1∶100)，NF ( Ab24574, 1∶100)，GnRH-R ( Ab183079, 1∶30) 的表達，抗體均購自Abcam公司。兩位研究者雙盲閱片，讀取400倍視野中PP值(percentage of positive cells，陽性細胞百分比)(0：0%～25%；1：26%～50%；2：51%～75%；3：>75%)及SI值(staining intensity，染色強度)(0=陰性，1=弱陽性，2=中陽性，3=強陽性)，對于胞核表達指標，計算PP與SI乘積，采用IRS(immunoreactive score，免疫反應積分法)系統(tǒng)進行評分；對于胞質表達指標，根據(jù)SI得出IHC-score(immunohistochemical score,免疫組化評分)。

2 結果

2.1 小鼠建模情況

70只小鼠中，M5組死亡1只，M7組死亡1只，病檢未及明顯異常，余小鼠無死傷。各組小鼠子宮外形未見明顯異常。以腺體或間質成分侵入子宮肌層診斷為小鼠子宮腺肌病。不同疾病進展的HE染色結果如圖1所示，A、B、C、D分別提示無腺肌病，輕、中、重度腺肌病。對照組35只小鼠均未發(fā)展為腺肌病。造模組中，M1組5只小鼠均發(fā)展為腺肌病(輕度1，中度4)，造模成功率100%。隨著時間推移，M7組小鼠腺肌病進展，4只小鼠均為重度腺肌病。經不同藥物治療后，M2-M6組小鼠腺肌病病情較M7組均有所緩解，甚至M4組中一只小鼠達到病理性治愈。具體造模情況為：M2組(輕度1，中度3，重度1)，M3組(輕度1，中度4)，M4組(無病1，輕度1，中度1，重度2)，M5組(輕度1，重度3)，M6組(輕度1，中度3，重度1)。

2.2 小鼠動情周期

小鼠動情周期為4～6 d。本文連續(xù)5 d檢測小鼠動情周期，以5 d內出現(xiàn)2個及以下相為異常。統(tǒng)計后發(fā)現(xiàn)，42 d，對照組動情周期異常比例為0%，造模組異常比例為20%；70 d，對照組異常比例為50%，造模組異常比例為30%。42 d，全量抑那通組異常比例為0%，半量抑那通組為50%；70 d，異常比例分別為25%，50%。兩組差異無顯著性。

2.3 小鼠血清5-HT水平

由圖2可見，對照組5-HT水平明顯高于造模組(P<0.001)。經藥物處理后，C2組5-HT水平高于C7組，M2組5-HT水平高于M7組，但差異無顯著性。

2.4 小鼠子宮NGF、NF、GnRH-R表達情況

三個指標在在小鼠內膜及病灶的免疫組化半定量分析如圖3所示，GnRH-R在正常內膜(P<0.001)、在位內膜(P<0.001)的表達水平顯著低于異位內膜。NGF在正常內膜(P<0.05)、在位內膜(P<0.01)的表達水平顯著低于異位內膜。NF在正常內膜的表達水平顯著低于在位內膜(P<0.01)、異位內膜(P<0.001)。進一步分析各亞組表達情況，發(fā)現(xiàn)經抑那通治療后，M3、M4、M5、M6組小鼠在異位內膜NGF、NF的表達水平低于M7組，但無統(tǒng)計學差異。經褪黑素治療后M2組小鼠在異位內膜NF的表達水平低于M7組，但無統(tǒng)計學差異。

注：縱坐標：免疫組化得分/免疫反應積分；A.對照組正常內膜；B.造模組在位內膜；C.造模組異位內膜； *, P<0.05; **, P<0.01; ***, P<0.001。GnRH-R在造模組異位內膜免疫組化評分明顯高于對照組正常內膜及造模組在位內膜；NGF在造模組異位內膜免疫組化評分明顯高于對照組正常內膜及造模組在位內膜；NF在對照組正常內膜免疫反應積分明顯低于造模組在位內膜及造模組異位內膜。差異具有顯著性。圖3 GnRH-R、NGF及NF三個指標在小鼠內膜及病灶的免疫組化半定量分析Note. A. Control (normal endometrium); B. Model (eutopic endometrium); C. Model (ectopic endometrium); Ordinate scale: immunohistochemical score/ immunoreactive score; *, P<0.05; ** , P<0.01; *** , P<0.001. IHC-score for GnRH-R in group C was higher than in group A and group B; IHC-score for NGF in group C was higher than in group A and group B; IRS for NF in group A was higher than in group B and group C.Fig.3 Semi-quantitative immunohistochemical analysis of GnRH-R, NGF and NF in endometrium and lesions in the mice

3 討論

3.1 動物模型

目前國際上主要以小鼠作為腺肌病模型動物。SHN小鼠腺肌病自發(fā)率高，通過垂體-宮腔移植可顯著縮短發(fā)病時間，加重疾病進展，故常用SHN小鼠作為模型動物[2]。Suzuki[3]則將臨床患者腺肌病組織通過腹腔注射移植到裸鼠體內構造腺肌病小鼠模型。2001年，Parrott利用他莫昔芬誘導新生CD1小鼠構造腺肌病模型。2005年，Green[4]首次使用ICR小鼠構造腺肌病模型。因SHN系小鼠引進困難，并發(fā)癥多，利用垂體移植術增加造模難度及小感染概率。故以他莫昔芬誘導新生ICR小鼠構造腺肌病這一模型在國內得以普及[5]。本文于ICR小鼠49 d時已成功構造腺肌病小鼠模型，75 d小鼠腺肌病程度進展；對照組小鼠均未出現(xiàn)內膜成分侵入肌層。故本文利用他莫昔芬造模成功，腺肌病嚴重程度與造模后時間有關。M2-M6組小鼠腺肌病程度不一，內膜成分侵入肌層程度均低于M7組，其中M4組中一只小鼠子宮肌層完全無內膜成分侵入，提示藥物作用后，腺肌病內膜入侵程度得到緩解，甚至病理上治愈。此外，42 d，對照組出現(xiàn)動情周期異常比例為0%，造模組出現(xiàn)動情周期異常比例為20%；70 d，對照組出現(xiàn)動情周期異常比例為50%，造模組出現(xiàn)動情周期異常比例為30%。提示腺肌病造模后，小鼠出現(xiàn)一定程度動情周期異常。而70 d對照組與造模組均出現(xiàn)動情周期紊亂，考慮藥物應用所致。

3.2 5-HT與褪黑素

5-HT是調節(jié)疼痛的重要神經遞質，隨著疼痛的增加，表達水平下降[6]。國內學者龔萍等[7]發(fā)現(xiàn)痛經可能系激素與大腦雌孕激素受體結合，引起邊緣系統(tǒng)5-HT水平下降。而5-HT的代謝產物褪黑素，經Schwertner[8]研究發(fā)現(xiàn)，可用來減輕內異癥患者的疼痛。本文首次研究了腺肌病小鼠5-HT的表達水平，并使用褪黑素治療。發(fā)現(xiàn)對照組小鼠5-HT水平明顯高于造模組。經褪黑素治療小鼠(C2、M2組)的5-HT水平高于空白組(C7、M7)，但其水平無統(tǒng)計學差異，可能與樣本較小有關。相比空白組(M7)，經褪黑素處理的小鼠，腺肌病嚴重程度較輕(見表1)，疼痛緩解，M2組在異位內膜NF的表達水平低于M7組(無統(tǒng)計學差異)。本文大膽推測，5-HT低表達與腺肌病疼痛密切相關，其代謝產物的應用可提高5-HT水平，抑制腺肌病疾病進展，減緩疼痛。

3.3 NGF、NF

NGF本身是一種疼痛介質,隨著腺肌病疼痛程度的加重，其表達水平不斷升高[9-11]。研究表明，NGF可增加靶器官對疼痛的敏感性，可營養(yǎng)交感神經結神經元，營養(yǎng)小感覺神經纖維，介導疼痛發(fā)生[12]。此外NGF能夠誘導NF等的表達，可作為疼痛評估指標之一[13-15]。目前，有關腺肌病NGF、NF的研究較少。本研究檢測了造模組與對照組小鼠用藥后NGF、NF的表達情況，發(fā)現(xiàn)：NGF、NF在腺肌病異位內膜中呈高表達，在正常內膜中呈低表達，而在腺肌病在位內膜中，NGF呈低表達，NF呈高表達。Yang[16]實驗得出，脂質體介導的NGF基因轉染僅能增加磷酸化的神經纖絲水平，并不能增加其蛋白總量?？紤]NGF、NF兩者在腺肌病在位內膜、異位內膜的疼痛機制可能不同。子宮腺肌病在位內膜與異位內膜的分離提純存在技術難關，目前相關文獻仍以免疫組化為主半定量分析蛋白表達，故其疼痛的具體機制、通路，有待進一步探索。

3.4 GnRH-R

GnRH-R在在位內膜、異位內膜的表達，提示GnRH可直接作用并影響靶器官。本文發(fā)現(xiàn)，腺肌病小鼠在位內膜、異位內膜均有GnRH-R的表達，與文獻相符[17]，其在異位內膜的表達水平明顯高于在位內膜，提示腺肌病疾病的進展伴隨GnRH-R表達水平的改變。在抑那通治療后，M3、M4組小鼠疾病緩解，在經達英-35后續(xù)處理后，M4組中有一只小鼠甚至達到病理治愈。M3、M4組小鼠子宮異位內膜NF的表達水平低于M7組(無統(tǒng)計學意義)，提示GnRH可一定程度上緩解腺肌病進展。臨床上GnRH-a應用廣泛，可以有效緩解子宮腺肌病相關癥狀，但長期應用易出現(xiàn)更年期等副反應。在位內膜及異位內膜均存在GnRH-R，這為低劑量GnRH-a的應用提供了理論依據(jù)。在低劑量抑那通治療后，M5、M6組小鼠疾病得到一定程度控制，M5、M6組小鼠子宮異位內膜NF的表達水平低于M7組(無統(tǒng)計學意義)，提示半量抑那通可也緩解腺肌病進展。鑒于小鼠卵巢較小本文未行卵巢切除及相關功能檢查，且處死小鼠時無法保證所有小鼠處于動情間期，故未對其內分泌水平進行檢測。本文隨機抽取對照組與造模組各10只小鼠，檢測其5 d動情周期的變化，發(fā)現(xiàn)70 d M3、M4組出現(xiàn)動情周期異常比例為25%，而M5、M6組出現(xiàn)動情周期異常比例為50%。并未能提示半量抑那通對動情周期影響小，可能與樣本量相關。是否能夠有效控制腺肌病癥狀，同時減少副反應，有待進一步推廣研究。

總之，本文利用他莫昔芬法成功建立腺肌病小鼠模型，該法易于操作，成功率高。與全量抑那通相似，半量抑那通可一定程度上減緩腺肌病進展，改善小鼠疼痛，但對動情周期的影響無明顯優(yōu)勢。全量抑那通后序貫使用達英-35可鞏固其療效，甚至達到病理性治愈。5-HT在腺肌病疼痛機制中可能發(fā)揮一定作用，其代謝產物褪黑素可在一定程度上改善疼痛，減緩疾病進展。

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Drug therapy and mechanism of pain in mice with induced adenomyosis

LI Qing, WANG Jie-yu, ZHANG Xiao-dan, ZHANG Xu-yin,FENG Wei-wei, HUA Ke-qin*

(Obstetrics and Gynecology Hospital, Fudan University, Shanghai 200090, China)

Objective To investigate the effects of different drugs and to explore the mechanism of pain in mice with adenomyosis (ADM). Methods The mouse model of adenomyosis was induced by oral administration of tamoxifen. The vaginal smear was examined by cytology, and serum levels of 5-HT, GnRH-R, NGF and NF were determined. Results Higher level of 5-HT was detected in the controls compared with the models. The expression of GnRH-R and NGF in normal endometrium and eutopic endometrium were significantly lower than those in ectopic endometrium. The expression on NF in normal endometrium was significantly lower than that in the eutopic and ectopic endometria. Conclusions Similar with regular dose of GnRH-a, half dose of GnRH-a can slow down the progress of ADM as well as reducing pain. Combination of regular dose of GnRH-a and Diane-35 could consolidate the therapeutic effect and even achieve pathological cure. 5-HT may take an active part in the mechanism of pain in ADM.

Adenomyosis; ICR mice; Model; Pain; Treatment

HUA Ke-qin， E-mail: huakeqin@126.com

李清(1991-)，女，博士研究生，專業(yè)：臨床技能。Email: liqing11@fudan.edu.cn

華克勤(1962-)，女，主任醫(yī)師，博導，主要從事婦產科研究。Email: huakeqin@126.com

研究報告

Q95-33

A

1005-4847(2016)05-0516-05

10.3969/j.issn.1005-4847.2016.05.014

2016-04-11