甄玉花，宋陽*，關永格，李坤寅，胡光云，廖慧慧

(1. 廣州中醫(yī)藥大學，廣州 510405；2.廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，廣州 510405)

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NOD/SCID雌性小鼠動情周期的觀察

甄玉花1，宋陽1*，關永格2，李坤寅1，胡光云1，廖慧慧2

(1. 廣州中醫(yī)藥大學，廣州 510405；2.廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，廣州 510405)

目的 觀察NOD/SCID小鼠動情周期及卵巢切除術后陰道涂片的變化。方法 連續(xù)觀察9 d NOD/SCID鼠，每日進行兩次陰道涂片，計算動情周期時間及發(fā)生率。卵巢切除后，陰道涂片并觀察陰道涂片變化。結果 NOD/SCID小鼠動情周期為4～6 d。有規(guī)律動情的小鼠占80%。陰道口狀態(tài)與動情周期無明顯相關。卵巢切除術后，陰道涂片呈動情后期或動情間期改變。結論 采用陰道脫落細胞涂片法可判斷NOD/SCID雌性小鼠的動情周期及特點，NOD/SCID雌性小鼠卵巢切除手術有效。

NOD/SCID小鼠；動情周期；陰道涂片；卵巢切除術

非肥胖糖尿病/嚴重聯(lián)合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠是非肥胖糖尿病小鼠NOD/Lt與SCID小鼠雜交而成的免疫缺陷小鼠[1]，該小鼠除了具有先天缺陷的特點，還缺乏T細胞、B細胞和NK細胞，免疫滲漏不到10%，目前廣泛應用于糖尿病、白血病、腫瘤等疾病的研究[2, 3]。目前已經有文獻報道關于KM小鼠、ICR小鼠等動情周期情況，NOD/SCID雌性小鼠動情周期特點尚未有文獻報道。對于小鼠動情周期的判斷，文獻報道有宮頸粘液結晶法、陰道脫落細胞法、角化細胞計數(shù)法幾種[4]。本研究主要采用陰道脫落細胞法研究NOD/SCID小鼠的動情周期及卵巢去勢后陰道涂片變化，為今后利用該品系生物醫(yī)學方面的研究提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

雌性SPF級NOD/SCID小鼠15只，6周齡，體重17.9～20.4 g，平均(19.4±0.63)g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供【SCXK(京)2012-0001】。適應性飼養(yǎng)一周，每籠5只，溫度26℃，濕度60%～70%，12 h明暗交替，實驗期間自由飲用蒸餾水。實驗在廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心的SPF級實驗室內進行【SYXK(粵)2013-0001】。

1.1.2 器材和試劑

光學倒置顯微鏡(Olympus IX-71，日本)，顯微鏡載玻片(江蘇世泰實驗器材有限公司，中國)，1%亞甲基藍染色液(北京雷根生物技術有限公司，中國)，氫氧化鉀(天津市瑞金特化學品有限公司，中國)，水合氯醛(Ceres Chemical)，氨基甲酸乙酯(Maya Reagent)，多聚甲醛(北京雷根生物技術有限公司，中國)，生理鹽水(貴州天地藥業(yè)有限責任公司，中國)。1.2 方法

1.2.1 陰道涂片

第1～9天陰道涂片，每日2次(8:00-9:00，16:00-17:00)。進行陰道涂片前，將陰道口狀態(tài)進行記錄。用拇指和食指固定小鼠背部皮膚，將小鼠握于掌心，無名指和小指固定尾根，暴露陰道口。用沾有生理鹽水的細軸棉棒緩慢插入小鼠陰道，輕輕旋轉一周，將棉棒抽出，將粘液均勻涂抹在載玻片上。玻片晾干后，用4%的多聚甲醛固定30 min。

1.2.2 卵巢切除術

第10天行卵巢切除術，過程如下：以水合氯醛(5%)+氨基甲酸乙酯(10%)腹腔注射麻醉，俯臥位，固定雙后肢。從后肢前緣1 cm正中處做一長約1 cm橫切口，正中線左側旁開1 cm逐層鈍性分離，進入腹腔，眼科鑷輕夾白色脂肪團，緩慢拉出切口外，輕輕分離脂肪團，可見到鮮紅色或淡紅色橢圓形小米粒大小卵巢組織。眼科鑷鈍性分離穿過子宮角下方組織，注意避開血管，3-0絲線結扎子宮角處，再結扎卵巢周圍脂肪，眼科剪摘除卵巢，將脂肪墊和子宮送回腹腔。同法處理右側卵巢，縫合皮膚。術后每日陰道涂片2次，持續(xù)7 d。

1.2.3 美蘭染色液的配制

亞甲藍溶液(1%)60 mL，加入95%乙醇30 mL，加入0.01 g KOH，加蒸餾水10 mL，混合均勻。

1.2.4 陰道涂片染色

將固定后的陰道涂片載玻片放在玻片架上，放入美蘭染色液中進行染色，10 min后，取出載玻片，用蒸餾水沖洗玻片緩慢沖洗邊緣，晾干后，顯微鏡觀察(左，×40，右×200)，拍照。

2 結果

2.1 NOD/SCID小鼠動情周期情況

大量文獻資料總結[5]，采用陰道脫落細胞法，小鼠不同動情周期陰道涂片的變化如下：動情前期，大量橢圓形有核上皮細胞少量白細胞(圖1A,B)；動情期，大量無核角化上皮細胞(圖1C,D)；動情后期，無核角化上皮細胞、橢圓形有核細胞、白細胞同時存在(圖1E,F)；動情間期：大量白細胞，少量有核上皮細胞(圖1G,H)。據(jù)此，判斷NOD/SCID小鼠的各個動情階段的陰道涂片。NOD/SCID小鼠動情周期為4～6 d，6只鼠觀察到1次動情，占40%；6只鼠觀察到2次動情，占40%。小鼠發(fā)生規(guī)律動情的有12只，占80%。在動情期持續(xù)時間方面，由于本實驗每日進行兩次陰道涂片，每日兩次均見到動情期變化的有4次，時間大約7～8 h左右。見圖1。

2.2 NOD/SCID小鼠外陰變化

文獻報道[6]，ICR小鼠隨動情周期變化，陰門口顏色呈明顯變化，動情期陰門口為紅色，皺襞明顯腫脹。NOD/SCID小鼠陰門口顏色一般呈粉色，未見明顯陰門皺襞變化，陰道口呈現(xiàn)開或閉合的狀態(tài)。將陰道口狀態(tài)與動情周期進行對比，賦值如下：陰道口閉合為0，張開為1；動情間期為0，動情前期為1，動情期為2，動情后期為3。進行Spearman相關分析，P=0.085，二者無明顯相關。

2.3 卵巢切除術后陰道涂片變化

卵巢切除術后1～3 d，陰道涂片呈動情后期或動情間期狀態(tài)。卵巢切除術后3 d：大量白細胞，少量有核上皮細胞(圖I,J)。卵巢切除術后3～7 d，陰道涂片呈連續(xù)動情間期狀態(tài)。以此證明，卵巢切除手術有效。

3 討論

本實驗系統(tǒng)研究N0D/SCID雌性小鼠的動情周期，并且觀察卵巢切除術后的陰道涂片。文獻指出[6]，手術應激對小鼠動情周期的時間、各期持續(xù)時間無明顯影響，且NOD/SCID小鼠價格昂貴，故本實驗未專門設立正常對照組和假手術組。

NOD/SCID小鼠2～3周齡離乳，6～7周齡達到性成熟，一般選用6～8周齡用于實驗研究。本實驗研究結果顯示，NOD/SCID小鼠6周齡，17.9～20.4 g，動情周期為4～6 d，波動范圍相對較大，80%小鼠有規(guī)律動情周期。卵巢切除術后1～2 d，由于小鼠體內殘留的雌激素作用，小鼠陰道涂片出現(xiàn)動情后期狀態(tài)。隨時間推移，體內殘留雌激素代謝以后，陰道涂片呈連續(xù)動情間期狀態(tài)。采用陰道脫落細胞法進行動態(tài)觀察，可有效判斷NOD/SCID小鼠的的動情周期。在受孕實驗中，將處于動情前期或動情期的雌鼠交配，可有效提高受孕率[7]。

注：A，B：動情前期；C，D：動情期；E，F(xiàn)：動情后期；G，H：動情間期；I，J：卵巢切除術后。(左側×40，比例尺：×200 μm;右側×200，比例尺：×40 μm)。圖1 NOD/SCID小鼠不同動情周期陰道涂片Note. A,B: Preoestrus stage.C,D: Estrus stage. E,F: Metestrus stage. G,H: Diestrus stage. I,J: After ovariectomy.Fig.1 Vaginal smears of the NOD/SCID mice at different stages of estrous cycle.(left panel:×40;Right panel:×200)

未經染色時，陰道涂片可見結晶，固定染色后，結晶消失。動情前期，可見到云霧狀結晶。動情期，未見到典型結晶。動情后期及動情間期的陰道涂片，除了見到細胞形態(tài)外，還可見到大量金魚草樣結晶，考慮是由于粘液導致的。這與人類排卵期出現(xiàn)的羊齒狀結晶不同，僅憑看到規(guī)則結晶，尚不能確定NOD/SCID小鼠處于動情期，這與文獻報道一致[4]。對于無規(guī)律動情期的NOD/SCID小鼠，非動情期也可出現(xiàn)羊齒狀結晶，這一特點和普通KM小鼠有相似之處[4]。卵巢切除術后3～7 d的陰道涂片，除了少量有核上皮細胞，大量白細胞，亦可見到大量規(guī)則金魚草狀結晶，這與排卵與否無關。

在本實驗中，動情周期陰道口狀態(tài)與動情周期無明顯相關，通過陰道口無法判斷NOD/SCID小鼠處于動情周期的哪一個階段，這與相關研究一致[6]。在36只SD大鼠的研究中，15只動情期大鼠外陰出現(xiàn)腫脹，相符率達到42%[7]。而本研究中，陰道口呈張開狀態(tài)的NOD/SCID小鼠不一定處于動情期，還可能是動情后期、動情間期。有2只NOD/SCID小鼠在動情期出現(xiàn)陰道口濕潤，分泌物清稀。

一般在觀察動物動情期持續(xù)時間時，需要嚴格按照每隔幾小時進行一次陰道涂片。本實驗由于受實驗室條件限制，每日進行陰道涂片兩次，具體動情期持續(xù)時間無法嚴格判斷。

在本實驗中，卵巢切除術后進行連續(xù)陰道涂片，可確認卵巢去勢是否成功。去卵巢NOD/SCID小鼠在國外文獻中應用較多，一般配合補充雌孕激素緩釋片，用于建立移植異體子宮肌瘤的模型[8]。

[1] Fiebitz A, Fritsch M, Reichelt U, et al. Optimized culture conditions for tissue explants of uterine leiomyoma[J]. ClinLab,2012,58:1153-1164.

[2] 張欣，于亮. NOD/SCID小鼠-白血病模型在白血病研究中的應用現(xiàn)狀及進展[J]. 臨床血液學雜志,2015, 28(03):451-454.

[3] Shultz LD, Schweitzer PA, Christianson SW, et al. Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice[J]. J Immunol,1995,154(1):180-191.

[4] 李靖，李炫誠，吳云霞. 確定小鼠動情周期的三種方法[J]. 實驗動物科學,2007, 24(03):63-64.

[5] 孫艷浮，李瑞玉. 中醫(yī)藥治療子宮肌瘤的現(xiàn)狀及展望[J]. 中國民間療法,2015, 23(09):96-97.

[6] 杜納納，許丹丹，黃莉莉. 去卵巢和性成熟期ICR雌性小鼠動情周期的觀察[J]. 中國病理生理雜志,2015, 31(12):2301-2304.

[7] 肖尚杰，慧敏，秋明. 大鼠陰道涂片的觀察[J]. 廣州醫(yī)學院學報,2007,35(4):54-56.

[8] Wang G, Ishikawa H, Sone K, et al. Nonobese diabetic/severe combined immunodeficient murine xenograft model for human uterine leiomyoma[J]. Fertil Steril,2014,101(5):1485-1492.

Observation of the estrous cycle in female NOD/SCID mice

ZHEN Yu-hua1, SONG Yang1*, GUAN Yong-ge2, LI Kun-yin1, Hu Guang-yun1, LIAO Hui-hui2

(1. Guangzhou University of TCM,Guangzhou 510405, China;2.The First Affiliated Hospital,Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405)

Objective To observe the changes in estrous cycle and vaginal smears in ovarectomized NOD/SCID mice.Methods To continuously observe the estrous cycle time by vaginal smears of NOD/SCID mice in consecutive nine days, twice daily. After ovariectomy, the changes of estrous cycle were observed by vaginal smears for 7 days.Results The estrous cycle in NOD/SCID mice was 4-6 days. Regular estrous mice accounted for 80%. There was no significant correlation between vaginal opening and estrous cycle status. After ovariectomy, the vaginal smears showed characteristics of metestrus or diestrus. Conclusions Vaginal smear cytology can be used to determine the estrous cycle and characteristics of NOD/SCID female mice.The ovariectomized operation of NOD/SCID female mice is effective.

NOD / SCID mice; Estrous cycle; Vaginal smear;Ovariectomy

SONG Yang.E-mail: fau20@126.com

廣東省自然科學基金(2014A030313401)。

甄玉花(1987-)，女，博士研究生，主要從事補腎活血法治療婦科腫瘤及月經病的研究。Email: drzhenyuhua@163.com

宋陽，男，博士，教授，主要從事促進女性生殖健康等方面的研究. Email: fau20@126.com

研究報告

Q95-33

A

1005-4847(2016)05-0526-04

10.3969/j.issn.1005-4847.2016.05.016

2016-05-11