楊曉娟 張生林 郭洪波

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【實(shí)驗(yàn)研究】

健腦益智湯對(duì)阿爾茨海默病大鼠P53的影響*

楊曉娟1張生林1郭洪波2△

目的 研究健腦益智湯對(duì)阿爾茨海默病(AD)大鼠海馬P53蛋白表達(dá)的影響，探討其對(duì)AD細(xì)胞凋亡的防治作用機(jī)制。方法 正常老年大鼠60只，分為對(duì)照組、模型組、安理申組、健腦益智湯小、中和大劑量組，采用側(cè)腦室注射聚集態(tài)Aβ25～35建立AD模型，藥物灌胃4周，Western-blot法檢測(cè)海馬P53蛋白及磷酸化P53(Ser15)蛋白(pP53-Ser15)表達(dá)水平。結(jié)果 與對(duì)照組比，模型組P53及pP53-Ser15的表達(dá)增多(P<0.01)；與模型組比，安理申組P53蛋白降低(P<0.01)，pP53-Ser15降低無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，健腦益智湯隨劑量增加，P53蛋白及pP53-Ser15呈下降趨勢(shì)(P<0.05，P<0.01)；健腦益智湯大劑量組pP53-Ser15下降較安理申組明顯(P<0.05)。結(jié)論 健腦益智湯降低AD大鼠細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制是通過降低P53及pP53-Ser15蛋白的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。

阿爾茨海默??；健腦益智湯；P53；磷酸化P53(Ser15)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是發(fā)生于老年和老年前期、以進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙和行為損害為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性變，是老年期癡呆的最常見類型，其病因及發(fā)病機(jī)制仍不清楚。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)估計(jì)，每四秒鐘就會(huì)出現(xiàn)一個(gè)新的癡呆癥病例。根據(jù)目前老年人口的增長(zhǎng)速度，未來40年全球會(huì)有1.15億人患有癡呆癥，AD已經(jīng)成為嚴(yán)重危害人類健康的疾病，因此對(duì)癡呆的防治己成為醫(yī)務(wù)工作者面臨的嚴(yán)峻問題。近年來，世界各國學(xué)者不斷的對(duì)該病進(jìn)行研究，但目前仍沒有特效藥物及治療指南，中醫(yī)藥是一個(gè)巨大的寶庫，所以國內(nèi)許多學(xué)者也將目光轉(zhuǎn)向了中醫(yī)藥，試圖找到一條新的治療途徑[1,2]。中醫(yī)認(rèn)為癡呆的病理機(jī)制為“腎精虧虛以致髓海不充，腦竅失養(yǎng)”，治療應(yīng)當(dāng)滋補(bǔ)肝腎、填精益髓，少佐活血化瘀之法。課題組使用張生林教授臨床經(jīng)方復(fù)方健腦益智湯(由何首烏15 g，枸杞子10 g，黨參6 g，五味子10 g，田三七10 g，山萸肉10 g，當(dāng)歸10 g，丹參10 g，白芍10 g，淫羊霍10 g等組成)進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，該藥已多年運(yùn)用于臨床，主要治療老年癡呆，并且療效肯定[3]。課題組前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，使用健腦益智湯后，阿爾茨海默病大鼠的腦細(xì)胞凋亡百分率降低[4]，但機(jī)制不明，此研究旨在進(jìn)一步探討健腦益智湯抑制細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制，從而開發(fā)出一種新型的抗AD制劑，延緩癡呆患者病情進(jìn)展，減輕癡呆患者的家庭負(fù)擔(dān)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 18～24月齡雄性SD大鼠，體質(zhì)量400～500 g，山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(動(dòng)物合格證號(hào)：山醫(yī)字第070101號(hào))。1.2 藥物及試劑 安理申，衛(wèi)材(中國)藥業(yè)有限公司；健腦益智湯，山西醫(yī)科大學(xué)制劑室制備；Aβ25～35，P53，Phosphor-P53(Ser15)抗體，Cell Signaling Technology (CST)，美國Sigma公司；組織蛋白抽提試劑盒、二辛寧可酸(BCA) 蛋白定量試劑盒、蛋白示蹤上樣緩沖液、高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒、抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)鼠單克隆抗體、山羊抗小鼠IgG-辣根過氧化物酶抗體，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組、造模和給藥 選出正常雄性老年大鼠60只，隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、安理申組、健腦益智湯小、中和大劑量組。采用左側(cè)側(cè)腦室注射聚集態(tài)Aβ25～35制備阿爾茨海默病大鼠模型[5]。造模成功后，分別給予安理申0.525 mg/(kg×d)；健腦益智湯10.6 g/(kg×d)、21.2 g/(kg×d)、42.4 g/(kg×d) 灌胃，其余組給予生理鹽水，每天1次,連續(xù)4周。

1.4 Western-blot方法檢測(cè)海馬P53蛋白及pP53-Ser15表達(dá) 使用組織蛋白抽提試劑盒提取海馬蛋白，使用BCA蛋白定量試劑盒給予蛋白定量，調(diào)整各組海馬蛋白濃度至同一水平。每組加入2倍濃度等體積蛋白示蹤上樣緩沖液，沸水煮沸5min。使用10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離樣品，上樣體積20μl，80V恒壓2h。恒流400 mA濕式轉(zhuǎn)膜95min后，使用5%脫脂牛奶封閉2h，一抗孵育，4℃過夜，磷酸鹽吐溫緩沖液搖床清洗15min，4次，二抗37℃孵育2h，緩沖液洗后增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光顯色。采用凝膠分析系統(tǒng)對(duì)P53蛋白及pP53-ser15蛋白相對(duì)表達(dá)水平進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

與對(duì)照組相比，模型組P53及磷酸化P53(Ser15)蛋白的表達(dá)水平顯著增高(P<0.01)；與模型組相比，安理申組P53蛋白的表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)，磷酸化P53(Ser15)表達(dá)水平有所降低，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；隨健腦益智湯劑量的增大，健腦益智湯各劑量組較模型組大鼠海馬P53蛋白及磷酸化P53(Ser15)蛋白表達(dá)水平呈下降趨勢(shì)(P<0.05，P<0.01)；健腦益智湯大劑量組大鼠海馬磷酸化P53(Ser15)蛋白表達(dá)水平較安理申組明顯降低(P<0.05)。見圖1、表1。

1.對(duì)照組，2.模型組，3.安理申組，4.健腦益智湯小劑量組，5.健腦益智湯中劑量組，6.健腦益智湯大劑量組圖1 健腦益智湯對(duì)AD大鼠海馬p53蛋白及pP53-ser15蛋白測(cè)定結(jié)果

組別(mg/kg)P53pP53-ser15對(duì)照組056±024037±008模型組166±1002)056±0112)安理申組061±0144)051±014健腦益智湯小劑量組132±0523)050±010健腦益智湯中劑量組126±0694)045±0104)健腦益智湯大劑量組075±0364)043±0174)5)

注：與對(duì)照組比1)P<0.05,2)P<0.01; 與模型組比3)P<0.05,4)P<0.01; 與安理申組比5)P<0.05

3 討論

由于阿爾茨海默病的病因及發(fā)病機(jī)制不明，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為有諸多因素共同參與AD的發(fā)病過程，如β-淀粉樣蛋白過度沉積，氧化應(yīng)激、Tau蛋白異常磷酸化、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)障礙、炎性機(jī)制及線粒體功能障礙等等，但最終導(dǎo)致的是神經(jīng)細(xì)胞病理性的凋亡。盡管遺傳因素和環(huán)境因素在神經(jīng)退行性疾病中都起作用，但引起細(xì)胞凋亡過程的生物反應(yīng)是一致的。P53作為一種腫瘤抑制蛋白，是多種細(xì)胞功能的重要調(diào)節(jié)者，可誘發(fā)包括神經(jīng)細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞凋亡。以往研究者將P53作為“分子警察”，其作用就是監(jiān)視細(xì)胞基因組的完整性，一旦DNA出現(xiàn)損傷或突變，則P53表達(dá)增加，從而進(jìn)行DNA的修復(fù)，并且P53表達(dá)發(fā)生在大量DNA片斷化之前，提示在損傷神經(jīng)元中 P53轉(zhuǎn)錄水平參與了DNA片段化，從而導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡[6]。

研究者在阿爾茨海默病等神經(jīng)退行性疾病中檢測(cè)到神經(jīng)細(xì)胞凋亡并且有P53表達(dá)，有細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了P53表達(dá)與神經(jīng)細(xì)胞死亡有關(guān)[7,8]。AD病人大腦組織中Aβ蛋白的堆積被認(rèn)為是進(jìn)行性退化和神經(jīng)細(xì)胞死亡的原因[9]。而且在AD病人的腦組織損傷的神經(jīng)元中P53免疫反應(yīng)性增加，在過表達(dá)Aβ轉(zhuǎn)基因小鼠大腦中發(fā)現(xiàn)P53水平增加[10]，在這種轉(zhuǎn)基因模型中神經(jīng)元中P53水平與細(xì)胞質(zhì)中Aβ表達(dá)及凋亡標(biāo)志物DNA斷裂有關(guān)。調(diào)節(jié)P53穩(wěn)定性和活化的主要機(jī)制包括磷酸化和泛素連接酶介導(dǎo)的蛋白降解，P53多在Ser15,33,46位點(diǎn)發(fā)生磷酸化[11],從而抑制P53的泛素化降解，促進(jìn)P53的激活和積累，這種磷酸化有助于突變型P53蛋白的穩(wěn)定。DNA損傷可以引起P53在Serl5位點(diǎn)磷酸化(pP53-ser15), 磷酸化的P53在神經(jīng)細(xì)胞調(diào)亡中起重要作用，而且P53Ser15磷酸化及P53蛋白高水平表達(dá)可能會(huì)有助于神經(jīng)退行性疾病進(jìn)展更快。調(diào)節(jié)P53活性的機(jī)制是復(fù)雜的，包括了許多不同的信號(hào)通路，P53通過這些機(jī)制調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞存活和死亡，因此在AD引起的神經(jīng)細(xì)胞死亡病理進(jìn)程中P53起重要作用，這些為許多慢性神經(jīng)退行性疾病治療提供了新的神經(jīng)保護(hù)靶點(diǎn)。

本課題研究表明，健腦益智湯可以使阿爾茨海默病的大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞P53蛋白及磷酸化P53蛋白表達(dá)下降，且隨著健腦益智湯劑量的增加，大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡呈下降趨勢(shì)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)健腦益智湯在降低磷酸化P53蛋白表達(dá)水平時(shí)作用優(yōu)于安理申，推斷健腦益智湯可能是通過阻斷P53蛋白Ser15位點(diǎn)發(fā)生磷酸化，從而阻止細(xì)胞凋亡的，而安理申可能是阻斷其他位點(diǎn)的磷酸化而實(shí)現(xiàn)抑制細(xì)胞凋亡作用，這有待于我們進(jìn)一步的研究。因此認(rèn)為：健腦益智湯可以使阿爾茨海默病的大鼠P53蛋白及磷酸化P53蛋白表達(dá)下降，從而使其凋亡減少，進(jìn)而防止AD的發(fā)生，進(jìn)一步為中西醫(yī)結(jié)合治療AD研究提供了基礎(chǔ)理論。

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Effect of Jiannao Yizhi Decoction on Hippocampal Proteins Expression of P53 in Rats with Alzheimer's Disease

YANG Xiaojuan1ZHANG Shenglin2GUO Hongbo2△

(Department of Gereology, The First Clinical Medical College, Shanxi Medical University, Shanxi, Taiyuan 030001, China)

Objective To explore the effect of JiannaoYizhi decoction on hippocampal expression level of P53 and pP53-Ser15 in rats with Alzheimer's disease, and to investigate the mechanism of the prevention and treatment of AD cell apoptosis. Methods Selecting normal old rats that were randomly divided into six groups. We used injected accumulation Aβ25-35 in lateral ventricles to make AD models. Each group was given the regulation lavage four weeks. The levels of apoptosis related proteins expression level of P53 were detected by Western-blot. Results Comparing with the control group, the expression of hippocampal apoptosis related proteins P53 and pP53-Ser15 of the model group were increased. Comparing with the model group, P53 protein of the aricept group reduced (P < 0.01), phosphorylation P53 (Ser15) reduced, and there was no statistical significance. And with the increase of Jiannao Yizhi decoction, there were a down-regulation of the protein expression patterns of P53 and pP53-Ser15 (P<0.05, P<0.01). Phosphorylation P53 of the Jiannao Yizhi decoction high-dose group significantly decreased than the aricept group (P<0.05). Conclusions Jiannao Yizhi decoction could reduce the expression level of apoptosis related proteins P53 and pP53-Ser15 in order to increase hippocampal apoptosis of Alzheimer's disease.

Alzhimer's disease; Jiannao Yizhi decoction; P53; The pP53-Ser15

本課題為山西省科技攻關(guān)項(xiàng)目(No.041079-2)

1.山西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年病科(太原 030001); 2.山西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院中醫(yī)科(太原 030001)

△通訊作者

10.3969/j.issn.1003-8914.2016.06.019

1003-8914(2016)-06-0794-03

?常新

2015-04-22)