雷宇平 張仲萍 羅甜甜 （山西省動物疫病預防控制中心 030027)

山西省豬胸膜肺炎放線桿菌分離及藥敏實驗

雷宇平 張仲萍 羅甜甜 （山西省動物疫病預防控制中心 030027)

為了解山西省胸膜肺炎放線桿菌的流行分布及耐藥情況，以確定有效的防控措施和用藥計劃，從山西省20個豬場采集疑似豬傳染性胸膜肺炎的病料組織，經(jīng)分離培養(yǎng)、生化鑒定、PCR檢測和藥敏實驗。確定3株分離株為豬胸膜肺炎放線桿菌。藥敏實驗結(jié)果表明，3株菌對頭孢克肟、氟苯尼考和氨芐西林最為敏感；對阿莫西林、恩諾沙星、環(huán)丙沙星等7種抗菌藥物為中敏；而對鏈霉素、慶大霉素、強力霉素、四環(huán)素和氯霉素表現(xiàn)出耐藥性。

胸膜肺炎放線桿菌；分離鑒定；PCR檢測；耐藥性

胸膜肺炎放線桿菌 （Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）屬于巴氏桿菌科嗜血桿菌屬，是革蘭氏陰性桿菌，有很強的致病性，能夠引起豬傳染性胸膜肺炎。豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌可以經(jīng)消化道和呼吸道感染各年齡段的豬群[1]，最常見的病理變化是肺臟出血、壞死和纖維素性滲出。急性感染的豬死亡率高，慢性感染的豬生長緩慢、飼料報酬低[2]。該病在我國的發(fā)生率逐年上升，已經(jīng)嚴重危害到我國養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展[3-5]。APP血清型有15種[6]，地域分布廣，再加上長期不合理地使用抗菌藥物使其產(chǎn)生耐藥性，導致該病的診斷和防控工作異常艱巨。為了解山西省APP的流行分布及耐藥情況，以確定有效的防控措施和用藥計劃，本研究于2014年對山西省11個地區(qū)的20個豬場進行了調(diào)查。

1 材料與方法

1.1 病料

2014年1月至12月，從山西省11個地區(qū)豬場采集病死豬的肺臟、肝臟、心臟、脾臟等病變組織。

1.2 培養(yǎng)基和試劑

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基購于國藥集團化學試劑有限公司；微量生化管、藥敏紙片購于杭州天和微生物試劑有限公司；Premix Taq，DL2000 DNA Marker ladder購于寶生物工程 （大連）有限公司。

1.3 細菌分離培養(yǎng)

無菌取病料，用接種環(huán)在血平板上劃線，置于10%CO2，37℃培養(yǎng)24h，將疑似菌落接種到麥康凱培養(yǎng)基上。

1.4 生化試驗

將純化的細菌接種到微量生化管中，置于10%CO2，37℃培養(yǎng)24～48h，觀察結(jié)果。

1.5 藥敏試驗

采用K-B藥敏紙片法，將純化的菌落均勻涂布于瓊脂平板上，將藥敏紙片貼于培養(yǎng)基表面，37℃培養(yǎng)12～16h，觀察結(jié)果，并依據(jù)藥敏試驗抑菌環(huán)直徑判斷標準來判定試驗結(jié)果。

1.6 致病性試驗

將分離獲得的菌株活化后接種于5% （v/v）的綿羊血瓊脂培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)18～24h后，稀釋菌液，使其濃度為3×1010cfu/ml。取80只40日齡的豬，隨機分成試驗組1（菌株1），試驗組2（菌株2），試驗組3（菌株3）和對照組，每組20只，試驗組各豬予肌肉注射3ml各分離菌株，對照組各豬肌肉注射等體積滅菌生理鹽水。觀察發(fā)病和死亡情況、剖檢變化，并進行細菌分離。

1.7 PCR檢測

根據(jù)Alain[7]等的方法，設計并合成一對針對APP保守序列APXIV的特異性引物：上游：5'-TGGCACTGACGGTGATGA-3'，下游：5'-GGCCATCGACTCAACCAT-3'，對分離株進行PCR檢測。用DNA提取試劑盒制備分離株的基因組DNA作為PCR擴增的模板，加入酶、引物和ddH2O后，按照以下程序進行擴增：94℃預變性5min，94℃變性30s，54℃退火30s，72℃延伸40s，30個循環(huán)，72℃后延伸10min。取5μL PCR產(chǎn)物，用1%瓊脂糖凝膠進行電泳分析。

2 結(jié)果

2.1 細菌分離培養(yǎng)特征

該菌在10%CO2，37℃培養(yǎng)條件下生長良好，24h形成1～2mm濕潤、半透明、邊緣整齊的菌落。經(jīng)革蘭氏染色，鏡檢為陰性小桿菌，菌體平直，單個或雙個存在。

2.2 生化實驗

3株分離株生化鑒定結(jié)果完全相同 （表1），葡萄糖、甘露糖、果糖、麥芽糖、VP試驗、尿素酶、氧化酶、透明質(zhì)酸酶和過氧化氫酶實驗均為陽性；甘露醇、山梨醇和MR實驗為陰性。

表1 菌株的生化鑒定結(jié)果

2.3 PCR鑒定

對菌株進行PCR檢測，擴增出422bp的片段 （附圖），說明該菌株為胸膜肺炎放線桿菌。

附圖 PCR檢測結(jié)果

2.4 致病性試驗

40日齡試驗豬感染后，各實驗組第2天豬群開始發(fā)病，試驗組1有13只發(fā)病，試驗組2有15只發(fā)病，試驗組3有14只發(fā)病，第3天各試驗組試驗豬均發(fā)病并出現(xiàn)臨床癥狀，主要癥狀為精神沉郁，高溫，呼吸困難。第4天出現(xiàn)死亡高峰，剖檢可見纖維素性胸膜炎非常明顯，嚴重的發(fā)現(xiàn)肺實質(zhì)黏附在胸膜壁上。取病死豬的肺部進行細菌分離鑒定，其生化特性與接種菌一致。

2.5 藥敏試驗

由表2可見，3株菌對頭孢克肟、氟苯尼考和氨芐西林最為敏感；對阿莫西林、恩諾沙星、環(huán)丙沙星等7種抗菌藥物為中敏；對鏈霉素、慶大霉素、強力霉素、四環(huán)素和氯霉素表現(xiàn)出耐藥。

表2 分離豬傳染性胸膜放線桿菌藥敏試驗

3 討論

目前，實驗室常用的APP診斷方法有血清學試驗包括間接凝集試驗、補體結(jié)合反應、玻片凝集試驗、乳膠凝集試驗、瓊脂擴散試驗和ELISA等方法。由于APP有很多血清型，各血清型之間沒有很好的交叉反應[8]，從而會影響血清學試驗的準確性。而細菌分離培養(yǎng)、生化試驗等方法費時費力。因此，建立一種方便快捷并且靈敏度高的診斷方法非常必要。

根據(jù)瑞士Alain Schaller[7]報道，以App所有血清型菌株做模板，用PCR方法都能擴增出APX IVA基因片段，而從其他親緣關系相近的細菌中無法擴增這一片段，說明APX IVA基因具有很高的種特異性。因此本研究參照Alain的方法，對3株分離株進行PCR鑒定。結(jié)果顯示，3株分離株均為胸膜肺炎放線桿菌。在此基礎上，本研究繼續(xù)對這3株APP進行常用抗菌藥物敏感性試驗。結(jié)果顯示3株胸膜肺炎放線桿菌對鏈霉素、慶大霉素、強力霉素、四環(huán)素和氯霉素表現(xiàn)出耐藥性且都表現(xiàn)出多重耐藥，這與國內(nèi)其他地區(qū)的報道[9-11]存在一定差異。究其原因可能是各地區(qū)使用的抗菌藥物種類和用藥時間有差異，也可能與細菌的血清型不同有關。

本研究通過對山西省11個地區(qū)20個豬場采集病料組織，經(jīng)過細菌分離培養(yǎng)、生化培養(yǎng)和PCR鑒定，獲得3株胸膜肺炎放線桿菌。對3株分離株進行藥物敏感性試驗測定，結(jié)果顯示對鏈霉素、慶大霉素、強力霉素、四環(huán)素和氯霉素表現(xiàn)出耐藥性。本研究為山西地區(qū)豬場防控APP，指導臨床合理使用抗菌藥物提供了科學依據(jù)。

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山西省科技攻關項目；項目名稱：豬工廠化健康養(yǎng)豬精準技術體系研究——豬呼吸系統(tǒng)主要細菌病綜合防控技術研究；項目編號：20140311020—6。