李煥斌 熊愛(ài)輝 （湖南省邵陽(yáng)市新寧縣一渡水鎮(zhèn)動(dòng)物防疫站 422714)

豬口蹄疫O型滅活疫苗制苗毒株的篩選

李煥斌 熊愛(ài)輝 （湖南省邵陽(yáng)市新寧縣一渡水鎮(zhèn)動(dòng)物防疫站 422714)

目前我國(guó)豬群中主要流行O型口蹄疫病毒，分屬于古典中國(guó) （Cathay)拓?fù)湫汀⒅袞|-南亞 （ME-SA)拓?fù)湫?、東南亞 （SEA)拓?fù)湫?。長(zhǎng)期以來(lái)，豬群中一直以Cathay拓?fù)湫驼純?yōu)勢(shì)，經(jīng)過(guò)多年的遺傳演化，進(jìn)一步可以分為老毒株和新型毒株。在豬群中不時(shí)有中東南亞拓?fù)湫偷姆簛喍局炅餍小?010年前后由于新毒株侵入，又有東南亞拓?fù)湫偷木挼?98型毒株流行。選擇從臨床發(fā)病豬最新分離鑒定的病毒材料12株，經(jīng)綜合分析后篩選發(fā)現(xiàn)O/HB/07/4、O/GX/09/7、O/XJ/10-11 3個(gè)毒株對(duì)豬毒力強(qiáng)，對(duì)BHK-21細(xì)胞具有良好的適應(yīng)性，免疫原性好，生物學(xué)特性符合疫苗毒株的要求，但其單苗免疫覆蓋面有限，需要進(jìn)一步進(jìn)行組合制備免疫覆蓋面廣的新型疫苗。

豬口蹄疫；滅活疫苗；疫苗毒株；免疫

我國(guó)豬口蹄疫主要是O型口蹄疫，偶爾也感染亞洲I型和A型口蹄疫。從20世紀(jì)60年代中期開(kāi)始，O型豬口蹄疫發(fā)病逐漸上升，主要流行毒株為古典中國(guó) （Cathay）拓?fù)湫筒《荆?jīng)過(guò)50年的流行，該譜系病毒的感染發(fā)病率發(fā)生明顯變化，出現(xiàn)了所謂老毒株、變異毒株和新變異毒株，病毒的變異使得其致病力越來(lái)越強(qiáng)，防控難度越來(lái)越大[1]。使口蹄疫疫情更加復(fù)雜和嚴(yán)重的是1999年泛亞毒株侵入我國(guó)，該毒株初期主要感染牛群，經(jīng)過(guò)10多年在豬群中的變異，出現(xiàn)了泛亞豬體適應(yīng)毒株，該毒株致病力強(qiáng)，曾造成南方數(shù)省豬只死亡。近年來(lái)，特別是2010年，由于新型的緬甸-98毒株侵入我國(guó)，該毒株對(duì)豬群、牛群感染力均很強(qiáng)，造成了重大損失。目前我國(guó)豬群中，流行的O型口蹄疫有3個(gè)拓?fù)湫?，多個(gè)譜系病毒共存的復(fù)雜局面[2]。

我國(guó)采取以免疫為主的綜合防控措施，20世紀(jì)60年代，曾使用弱毒疫苗防疫，80年代研制出了第1代滅活疫苗。雖然推出不少種類(lèi)的疫苗，但面臨豬口蹄疫病毒流行復(fù)雜的局面，須對(duì)豬群中未來(lái)可能流行的口蹄疫病毒進(jìn)行1次綜合評(píng)價(jià)，篩選出免疫普廣的疫苗毒株。

本研究將通過(guò)綜合分析我國(guó)豬群中流行的主要病毒株，研究高效、廣譜的新型疫苗以覆蓋目前國(guó)內(nèi)豬群中主要流行毒株為目標(biāo)。選擇免疫原性好、抗原普廣、對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物及本動(dòng)物致病力強(qiáng)、毒力穩(wěn)定，以及對(duì)研制疫苗材料具有良好適應(yīng)性的制苗種毒，是疫苗研制和免疫成敗的關(guān)鍵。本試驗(yàn)將從臨床發(fā)病豬分離鑒定的12株病毒材料分別進(jìn)行VP1核苷酸序列測(cè)定、乳鼠適應(yīng)性及毒力測(cè)定、細(xì)胞適應(yīng)性及毒力比較、試驗(yàn)室細(xì)胞傳代和生產(chǎn)用轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)特性比較和毒力測(cè)定，部分毒株對(duì)豬感染性測(cè)定、抗原關(guān)系分析、免疫普及免疫原性測(cè)定，篩選符合制苗毒株要求的候選制苗毒株。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

乳鼠：為疾病預(yù)防控制中心引進(jìn)的SPF3日齡乳鼠。

豬：仔豬和健康長(zhǎng)白豬均為購(gòu)自非口蹄疫疫區(qū)，未曾免疫過(guò)口蹄疫O型滅活疫苗，經(jīng)檢驗(yàn)口蹄疫O型血清抗體為陰性 （乳鼠中和抗體效價(jià)＜1∶4， 或者細(xì)胞中和抗體效價(jià)＜1∶8，或者ELISA抗體效價(jià)＜1∶8和3ABC抗體檢測(cè)D值小于0.2）。交叉攻毒試驗(yàn)用豬體重40kg左右，安全性檢驗(yàn)用豬為30～40日齡。

1.2 細(xì)胞

為疾病預(yù)防控制中心引進(jìn)的BHK-21細(xì)胞，傳代后凍存于液氮中；PK15細(xì)胞由疾病預(yù)防控制中心引進(jìn)。

1.3 毒株的遺傳關(guān)系分析

將原始病毒材料和本研究傳代3代的病毒材料，按照常規(guī)RT-PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增毒株的VP1基因，PCR產(chǎn)物直接測(cè)序，確認(rèn)序列并確定基因型。同時(shí)與國(guó)內(nèi)外口蹄疫參考毒株進(jìn)行比較，繪制系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)。根據(jù)VP1基因核苷酸序列的同源性，分析毒株之間的遺傳學(xué)關(guān)系。

1.4 毒株主要生物學(xué)特性分析

1.4.1 病毒的乳鼠適應(yīng)性研究

將國(guó)家口蹄疫參考試驗(yàn)室提供的12株病毒乳鼠組織毒，分別按照1∶10比例加入MEM培養(yǎng)基研磨制成懸液，4℃浸潤(rùn)過(guò)夜，2～3日齡昆明系小白鼠每只背部皮下注射0.2 mL，逐日觀察記錄乳鼠的發(fā)病死亡情況，棄掉10h內(nèi)死亡的乳鼠，收獲10h后瀕死或者死亡的乳鼠，去掉頭部、皮毛、爪子后，剪成小塊后加入磷酸甘油，于-70℃保存，同時(shí)如前步驟處理連續(xù)傳代使乳鼠發(fā)病死亡時(shí)間縮短穩(wěn)定在16～30h。記錄各毒株不同代次乳鼠發(fā)病、死亡時(shí)間。當(dāng)傳代毒株穩(wěn)定后制備種子批，并測(cè)定其對(duì)乳鼠的半數(shù)死亡量，以此來(lái)評(píng)價(jià)對(duì)乳鼠的毒力[3]。

1.4.2 病毒的細(xì)胞適應(yīng)性研究

對(duì)12株病毒的傳代乳鼠病毒進(jìn)行BHK-21細(xì)胞適應(yīng)試驗(yàn)，病毒接種量為10%，培養(yǎng)時(shí)間為細(xì)胞出現(xiàn)病變?yōu)橹?，記錄具體時(shí)間，連續(xù)傳代使收毒時(shí)間穩(wěn)定在24h以?xún)?nèi)。連續(xù)盲傳4代不能產(chǎn)生細(xì)胞病變的病毒，通過(guò)傳代PK15細(xì)胞和BHK-21細(xì)胞交叉?zhèn)鞔姆椒ㄟM(jìn)行，接毒量為10%，細(xì)胞病變達(dá)到90%以上時(shí)收獲病毒。

1.5 對(duì)豬致病性的研究和康復(fù)血清的制備

將對(duì)乳鼠致病力強(qiáng)、細(xì)胞適應(yīng)性好的候選毒株——O/HB/07-4株、O/GX/09-7株和O/XJ/10-11株乳鼠MF4代病毒作1∶10研磨浸潤(rùn)過(guò)夜處理后，肌肉注射2頭易感豬，觀察記錄發(fā)病情況和對(duì)豬的毒力，并在21d采血、分離血清，56℃滅活30min后過(guò)濾無(wú)菌處理后分裝保存，并采用O型口蹄疫抗體液相阻斷ELISA檢測(cè)試劑盒和細(xì)胞中和試驗(yàn)測(cè)定血清效價(jià)，用于r值的測(cè)定。

1.6 免疫原性的測(cè)定

將備選毒株各試一批疫苗進(jìn)行交叉攻毒試驗(yàn)，每種疫苗各免疫40kg左右的健康豬40頭，每頭免疫1頭份，分為4組，每組10頭，免疫28d后分別用檢驗(yàn)用毒進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，設(shè)立對(duì)照組，統(tǒng)計(jì)結(jié)果并計(jì)算保護(hù)率。

1.7 制苗候選毒株的確定

綜合分析各毒株的生物學(xué)特性、遺傳關(guān)系、抗原關(guān)系、免疫原性，從不同的譜系中選擇適宜的制苗毒株。

2 結(jié)果

2.1 病毒的鑒定

2.1.1 病毒序列測(cè)定及定型

將12株病毒進(jìn)行VP1核苷酸序列分析，并與國(guó)內(nèi)外參考毒株進(jìn)行比較，結(jié)果表明，12株病毒均為O型口蹄疫病毒，同源性見(jiàn)表1。12株病毒與OZK的VP1序列的同源性為 76～97%。

2.2 病毒的生物學(xué)特性

2.2.1 對(duì)豬的致病力研究和康復(fù)血清的制備

O/HB/07-4株、O/GX/09-7株和O/XJ/10-11株乳鼠MF4代病毒接種豬后，分別于24～48h后發(fā)病，表現(xiàn)明顯的口蹄疫臨床癥狀。最早可見(jiàn)蹄部病變，隨后10d后開(kāi)始康復(fù)。

2.2.2 抗原關(guān)系分析

選擇血清抗體效價(jià)較高的豬血清用于中和試驗(yàn)，將O/HB/07-4株、O/GX/09-7株和O/XJ/10-11細(xì)胞毒分裝，上述3種血清分別與4個(gè)病毒株進(jìn)行交叉細(xì)胞中和試驗(yàn)，試驗(yàn)重復(fù)3次計(jì)算平均值，見(jiàn)表2。

由表中數(shù)據(jù)可知O/GX/09-7和O/XJ/10-11可以作為疫苗毒株以最大限度覆蓋目前的豬口蹄疫病毒。

2.2.3 制苗候選毒株的確定

通過(guò)對(duì)12株病毒生物學(xué)特性的研究和遺傳學(xué)關(guān)系分析，選擇了分屬于Cathay拓?fù)湫汀⒅袞|-南亞拓?fù)湫秃蜄|南亞拓?fù)湫偷?株病毒O/HB/07-4株、O/GX/09-7株和O/XJ/10-11株，其對(duì)乳鼠、細(xì)胞都表現(xiàn)出良好的適應(yīng)性和較強(qiáng)的毒力，3株病毒均表現(xiàn)出良好的免疫原性，綜合分析O/GX/09-7和O/XJ/10-11可以作為制苗株的候選毒株。

3 結(jié)論與討論

經(jīng)VP1核苷酸序列測(cè)定，分析研究12株病毒屬于中國(guó)拓?fù)湫?、中東-南亞拓?fù)湫?、東南亞拓?fù)湫腿齻€(gè)拓?fù)湫蚚4]，分別經(jīng)過(guò)乳鼠適應(yīng)性及毒力測(cè)定、細(xì)胞適應(yīng)性及毒力比較、試驗(yàn)室細(xì)胞傳代和生產(chǎn)用轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)特性比較和毒力測(cè)定、對(duì)豬感染性測(cè)定和康復(fù)學(xué)清制備、細(xì)胞中和試驗(yàn)r值測(cè)定、單價(jià)疫苗制備和豬體攻毒交叉保護(hù)試驗(yàn)、免疫原性測(cè)定，綜合分析后篩選發(fā)現(xiàn)O/HB/07/4、O/GX/09/7、O/XJ/10-11 3個(gè)毒株對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物和本動(dòng)物毒力強(qiáng)，對(duì)BHK-21細(xì)胞具有良好的適應(yīng)性，免疫原性好，生物學(xué)特性符合疫苗毒株的要求，但其單苗免疫覆蓋面有限，需要進(jìn)一步進(jìn)行組合制備免疫覆蓋面廣德新型疫苗。

表1 12株病毒VP1核苷酸序列分析結(jié)果

表2 3種血清抗原關(guān)系

采用O/HB07-4株、O/GX/09-7株和O/XJ/10-11株的遺傳關(guān)系分析、乳鼠及細(xì)胞適應(yīng)性研究、抗原關(guān)系測(cè)定、免疫原性等方法綜合研究，全面對(duì)豬群中流行的不同拓?fù)湫設(shè)型口蹄疫病毒進(jìn)行分析，初步掌握了豬群中O型病毒的抗原關(guān)系，為研究保護(hù)覆蓋面較為寬的豬O型口蹄疫滅活疫苗提供了支持。

目前我國(guó)豬群中主要流行O型口蹄疫病毒，分屬于Cathay拓?fù)湫?、中東-南亞拓?fù)湫汀|南亞拓?fù)湫?，長(zhǎng)期以來(lái)，豬群中一直以Cathay拓?fù)湫驼純?yōu)勢(shì)，經(jīng)過(guò)多年的遺傳演化，進(jìn)一步可以分為老毒株和新型毒株。在豬群中不時(shí)有中東南亞拓?fù)湫偷姆簛喍局炅餍小?010年前后由于新毒株侵入，又有東南亞拓?fù)湫偷木挼?98型毒株流行。

緬甸-98譜系從2003年就已有該譜系病毒流行，近年來(lái)逐漸流行面擴(kuò)大，從一個(gè)側(cè)面反映出現(xiàn)流行疫苗存在一些問(wèn)題。該譜系病毒不易直接適應(yīng)BHK-21細(xì)胞，但是經(jīng)過(guò)傳代3次后收毒，綜合評(píng)價(jià)其細(xì)胞毒價(jià)和乳鼠毒價(jià)，有良好的乳鼠適應(yīng)性和細(xì)胞適應(yīng)性。綜合考慮，O/HB/07-4株、O/GX/09-7株和O/XJ/10-11株MF 4代病毒接種豬后，發(fā)現(xiàn)部分豬肌肉注射接種病毒后無(wú)任何反應(yīng)，觀察10d后再采血檢測(cè)血清抗體仍然維持陰性，提醒試驗(yàn)研究時(shí)應(yīng)注意選擇動(dòng)物和疫苗質(zhì)量評(píng)價(jià)，選擇動(dòng)物時(shí)不僅要注意有無(wú)口蹄疫抗體，還要注意豬的易感性，同時(shí)提醒應(yīng)注意研究口蹄疫不同感染途徑與致病性的關(guān)系。

[1]王繼華,邵明,施程洪,等.抗原濃縮純化工藝降低口蹄疫O型和Asia 1型二價(jià)滅活疫苗免疫副反應(yīng)研究[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2011(1):58-61.

[2]王繼華,邵明,施程洪,等.抗原濃縮純化工藝對(duì)口蹄疫滅活疫苗免疫效果評(píng)價(jià)[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào),2011,31(5):684-686.

[3]庫(kù)大亮,李冬.口蹄疫滅活疫苗的生產(chǎn)工藝概述[J],中國(guó)獸藥雜志,2011,45(1):41-44.

[4]周春雷,李冬.口蹄疫及其防制簡(jiǎn)介[J].中國(guó)動(dòng)物保健,2011(10):40-44.