黃淑燕，鄭郁善

（福建林業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院園林系，福建南平353000）

蔗糖、碳粉對雷公藤不定根生長和次生代謝產(chǎn)物含量的影響

黃淑燕，鄭郁善

（福建林業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院園林系，福建南平353000）

生根培養(yǎng)階段，添加不同濃度蔗糖及碳粉，置于黑暗及光照條件下分別培養(yǎng)，15d后觀測記錄不定根生長情況，30d后，觀測根系生長情況并測定根系中次生代謝產(chǎn)物（甲素）含量。試驗(yàn)結(jié)果表明，黑暗條件下培養(yǎng)，生根率及最早生根時(shí)間均優(yōu)于光照條件，而光照條件下根系增長量優(yōu)于黑暗條件，40g·L-1蔗糖及0.5g·L-1碳粉（Ac）利于甲素含量的提高，而根系生長情況對甲素含量影響不明顯。

蔗糖；碳粉；雷公藤；不定根生長；次生代謝產(chǎn)物含量

雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook.f.）屬于衛(wèi)矛科（Celastrace ae）雷公藤屬（Tripterygium）植物，又常稱黃藤根、黃臘藤、水莽草、紅藥、斷腸草、菜蟲藥等；多年生落葉蔓性灌木。雷公藤是我國傳統(tǒng)的中藥材，同時(shí)其次生代謝產(chǎn)物甲素具多方面的藥用效果，因而近年來市場對其需求不斷上升，導(dǎo)致野生雷公藤資源急劇減少，由于土地資源利用的局限性且自然條件下雷公藤生長周期長及甲素含量低等原因，使得其不能很好地滿足市場的需求，所以尋找一種能夠滿足市場需求及提高雷公藤甲素含量的方法是當(dāng)前科學(xué)研究是重要方向[1]。就目前來看，通過組織培養(yǎng)的方式來生產(chǎn)雷公藤的有用次生代謝產(chǎn)物，不僅能降低其生長周期，還能通過一定的方法提高其有用次生代謝產(chǎn)物含量，具重要實(shí)用價(jià)值[2-7]。

1 試驗(yàn)方法

1.1 試驗(yàn)材料

雷公藤組織培養(yǎng)生根階段獲得的無菌外植體。

1.2 雷公藤甲素提取工藝

將經(jīng)組織培養(yǎng)獲得的雷公藤完整植株經(jīng)60℃烘干，精密稱取2.0g，用研缽加少許78.64%的甲醇研碎，最后定容至0.072L，然后用聚乙烯膜封口，浸提12h，然后超聲處理39min，過濾，殘?jiān)眉状紱_洗2～3次每次0.01L，合并濾液，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，在65℃水浴鍋減壓濃縮蒸去甲醇，待蒸至膏狀時(shí)，將其移至分液漏斗中，加0.02L氯仿萃取，重復(fù)三次。合并萃取液，再次減壓蒸去氯仿，待蒸干后，稱取9g的中性氧化鋁，用甲醇:乙酸乙酯:乙醚=1:2:1的洗脫液適量濕潤后倒入中性氧化鋁柱上（200目，1.6cm×20cm），用洗脫液分兩次，每次0.04L洗脫，收集洗脫液并將其利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)至干燥狀態(tài)，并將干狀物質(zhì)用色譜甲醇進(jìn)行少量多次溶解，然后將其完全轉(zhuǎn)移至0.01L比色管中，用色譜甲醇定容至0.01L處并搖勻，最后使用用0.45um濾膜過濾液體，轉(zhuǎn)入樣品瓶待測，每個(gè)樣品三個(gè)重復(fù)[8]。

1.3 雷公藤甲素的HPLC測定

LCMS中LC的各項(xiàng)指標(biāo)如下：

流速為0.001L·min-1；時(shí)間梯度為0.01s～10.00 min；B泵色譜甲醇比例48%；A泵水比例52%，10min停止本次樣品工作，開始下一個(gè)樣品進(jìn)樣。

LC沖洗梯度：0.01sB泵色譜甲醇比例10%，60 minB泵色譜甲醇比例90%，65min沖洗結(jié)束。

紫外燈檢測器波長：218nm。

色譜柱柱溫：40℃。

色譜柱型號：Sinoc Chrom ODS-BP5μm。

尺寸：4.6mm×150mm。

柱號：E1913672。

進(jìn)樣量：0.00002L。

1.4 雷公藤甲素標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

利用天平準(zhǔn)確量取雷公藤甲素標(biāo)準(zhǔn)品0.0124g，并用甲醇溶解且定容于0.025L容量瓶中，配成濃度為0.496g·L-1的雷公藤甲素標(biāo)準(zhǔn)液，再以次稀釋成濃度為0.248、0.124、0.062、0.031、0.0155、0.00775g·L-1的雷公藤甲素標(biāo)準(zhǔn)液，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

在上述色譜條件下，以對照品峰面積為橫坐標(biāo)，對照品濃度為縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，雷公藤甲素在濃度0.00775～0.496g·L-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，且成分之間分離清晰?；貧w方程為：y=0.0116x+1.3596，R2=0.99972

圖1 甲素標(biāo)樣

1.5 試驗(yàn)方案

每種處理分為暗培養(yǎng)和光培養(yǎng)兩種培養(yǎng)方式[5]。

1.5.1 蔗糖不同濃度添加對雷公藤組織培養(yǎng)不定根誘導(dǎo)及甲素含量的影響研究[9-11]

將蔗糖的添加濃度設(shè)定為0、20、30、40g·L-1，在配置培養(yǎng)基階段按上述處理相應(yīng)加入，經(jīng)過高壓滅菌后備用。培養(yǎng)15d后，觀測不定根生長狀況，培養(yǎng)30d后，測定其甲素含量。

1.5.2 碳粉不同濃度添加對雷公藤組織培養(yǎng)不定根誘導(dǎo)及甲素含量的影響研究[9-11]

將Ac的添加濃度設(shè)定為0、0.5、1.0、1.5g·L-1，在配置培養(yǎng)基階段按上述處理相應(yīng)加入，經(jīng)過高壓滅菌后備用。培養(yǎng)15d后，觀測不定根生長狀況，培養(yǎng)30d后，測定其甲素含量。

2 數(shù)據(jù)收集整理

生根率、平均根量的計(jì)算公式見式（1）、式（2）。

生根率（%）=生根總株數(shù)/接種總株數(shù)×100%（1）

平均根量（%）=根系總數(shù)/接種總株數(shù)×100%（2）

最早生根時(shí)間(d)：待外植體接入培養(yǎng)基中之日起，每天觀察外植體生長狀況，待第一條根系長出并記錄即為最早生根時(shí)間。

最長根長（cm）：接種30d后，將每個(gè)處理的所有外植體從培養(yǎng)基中用鑷子取出后，洗凈根系上殘留的培養(yǎng)基，用卷尺測量最長根系的長度即為最長根長。

3 結(jié)果與分析

表1 培養(yǎng)因子濃度水平

表2 不同培養(yǎng)基組合處理

表3 接種15d，不定根誘導(dǎo)結(jié)果分析

據(jù)表3統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：

（1）觀察發(fā)現(xiàn)，黑暗條件下生根率明顯高于光照條件下，原因在于在黑暗條件下，植物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收加強(qiáng)，植物細(xì)胞內(nèi)內(nèi)源激素水平及激素間平衡的變化，導(dǎo)致了生根率的提高。這與Hammerschlag(1982)研究結(jié)果一致。黑暗條件下，所有處理平均根量均高于光照處理。因而，在生根培養(yǎng)前期，若進(jìn)行1個(gè)星期左右黑暗處理，利于外植體的根系誘導(dǎo)。

（2）上述處理最早生根時(shí)間為9d，大部分出現(xiàn)在暗培養(yǎng)處理中，上述處理的最早生根時(shí)間，暗培養(yǎng)明顯比光培養(yǎng)生根時(shí)間早，因而進(jìn)一步驗(yàn)證了上述結(jié)論，處理7在黑暗與光照條件下的最早生根時(shí)間均是9d，因而對該種處理來說，黑暗及光照處理對根系誘導(dǎo)在出現(xiàn)的時(shí)間上無太大區(qū)別。

（3）外植體根系長度并無一定規(guī)律性，因而只能認(rèn)為根系長度可能與外植體的生長狀況相關(guān)，平均根長長表明外植體生長狀況良好，利于外植體縱向生長，根系短表明外植體生長較弱，但其不能被采用來判定某處理是否為最佳生根方案。

表4 接種30d，不定根誘導(dǎo)及甲素含量結(jié)果分析

據(jù)表4統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：

（1）接種30d后，光照或黑暗條件下培養(yǎng)，生根率均達(dá)100%。因而，上述基本培養(yǎng)基處理，均適宜雷公藤生根培養(yǎng)。

（2）對試驗(yàn)獲得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析可知，與接種15d相比，所有處理的平均根量均提升1～2倍，但總體而言，光照條件下平均根量增長更快，黑暗條件下增長較慢，同時(shí)在該階段，光照條件下平均根量多于黑暗條件。因而，在雷公藤生根培養(yǎng)的階段中，1個(gè)星期左右的暗培養(yǎng)利于根系誘導(dǎo)，若暗培養(yǎng)時(shí)間延長，則根系誘導(dǎo)受到抑制，可能原因是根系誘導(dǎo)無需消耗太多營養(yǎng)物質(zhì)，一個(gè)星期的暗培養(yǎng)阻斷了一些營養(yǎng)物質(zhì)的大量供給，但當(dāng)根系誘導(dǎo)之后，根系需要吸收一定的營養(yǎng)物質(zhì)方能維持正常的生長增殖，若一直處于黑暗條件下，則營養(yǎng)供應(yīng)不足，根系誘導(dǎo)便受到抑制。因而生根培養(yǎng)最佳的培養(yǎng)方式為在接種后進(jìn)行1個(gè)星期左右暗培養(yǎng)，然后將其轉(zhuǎn)至光照條件下培養(yǎng)，這樣便可獲得更多根量。

（3）最長根長與營養(yǎng)物質(zhì)吸收狀況及外植體的生長狀況相關(guān)，上述試驗(yàn)結(jié)果表明，培養(yǎng)30d后，根系長度有所延長，但無一定規(guī)律性，表3亦表明，甲素含量不隨根系長度延長而增加。因而，根系長短并不能作為判定其是否利于根系誘導(dǎo)及甲素含量提高的依據(jù)。

（4）試驗(yàn)結(jié)果表明，所有處理光照條件下甲素含量低于黑暗條件，但處理7（蔗糖40g·L-1，Ac0.5g·L-1）在光照或是黑暗條件均獲得了最高的甲素含量，即光照條件下18.07μg·gFW-1，黑暗條件下26.26μg·gFW-1。綜上所述，黑暗條件下利于雷公藤甲素的合成；暗培養(yǎng)環(huán)境，處理7甲素含量最高。（詳見圖2、圖3）。

（5）表4表明，以蔗糖濃度為計(jì)算基準(zhǔn)，不論Ac使用濃度多少，不論培養(yǎng)條件是黑暗或光照，40g·L-1的蔗糖濃度可獲得最大甲素含量，20g·L-1及30g·L-1的蔗糖含量，甲素含量相差不多；對于Ac使用濃度試驗(yàn)結(jié)果，0.5g·L-1為最佳使用濃度。

圖2 光照條件下蔗糖、Ac添加對不定根誘導(dǎo)甲素含量影響

圖3 黑暗條件下蔗糖、Ac添加對不定根誘導(dǎo)甲素含量影響

4 結(jié)論

在基本培養(yǎng)基培養(yǎng)因子不同濃度添加對雷公藤不定根誘導(dǎo)及甲素含量影響研究試驗(yàn)中得出：不論培養(yǎng)因子使用濃度多少，其對雷公藤的生根率均沒有顯著影響作用，培養(yǎng)30 d后，雷公藤不定根生長均能達(dá)100%，但對于甲素含量，40 g·L-1蔗糖及0.5 g·L-1碳粉（Ac）組合的濃度使用能取得較好試驗(yàn)效果。本試驗(yàn)結(jié)果亦得出，雷公藤不定根接種后，1個(gè)星期暗培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)至光照培養(yǎng)，可令雷公藤在根系生長階段根量增加，且根系生長狀況得到提高。

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（責(zé)任編輯：陳果）

An Effect on the Adventitious Root Grow th and Secondary M etabolite Content of Tripterygium Wilfordii for the Sucrose Toner

HUANG Shuyan，ZHENG Yushan
（Department of Landscape Architecture，F(xiàn)ujian Forestry Vocational Technical College，Nanping,Fujian 353000)

In the rooting culture stage of Tripterygium Wilfordii,adding different concentrations of sucrose and carbon,under dark and light conditions respectively.The root growth of adventitious root was recorded after 15d.After 30d,the root growth was observed and the contents of secondary metabolites were measured.The experiment results showed that the cultivation of the light condition was better than the condition in the dark for the rooting rate and rooting time.But under the light condition,the root growth was better than that of the dark.40 g·L-1sucrose and 0.5 g·L-1carbon were in favor of the increase for the content of the secondary metabolites,but the effect of root growth was not obvious.

sucrose；toner;tripterygium wilfordii;adventitious root growth;secondary metabolite content

S567.19

A

1674－2109(2016)09－0025－04

2016-01-15

國家科技支撐計(jì)劃(2009BAI73B01)；福建省科技重大專項(xiàng)(2004YZ02-05)；福建省科技創(chuàng)新平臺(tái)(2008Y2001)。

黃淑燕(1986-),女,漢族，助教,主要從事園林植物組織培養(yǎng)和中藥材GAP研究。

鄭郁善(1960-),男,漢族,教授,博士生導(dǎo)師,主要從事森林培育學(xué)和中藥材研究。