張麗芳 盛晚香 繆澤群 宋繼權(quán)

TL1A及其受體DcR3在尋常型銀屑病皮損中的表達(dá)

張麗芳 盛晚香 繆澤群 宋繼權(quán)

目的: 檢測(cè)TL1A及其受體DcR3在尋常型銀屑病患者皮損組織中的表達(dá)。方法: 采用免疫組織化學(xué)法和實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法對(duì)30例尋常型銀屑病患者皮損中TL1A和DcR3水平進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果: 銀屑病組中TL1A和DcR3蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別為93.3%和90%，正常對(duì)照組中TL1A和DcR3蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別為20%和60%；銀屑病組TL1A mRNA和DcR3mRNA表達(dá)CT值分別為4.909±1.607和3.430±1.449，正常對(duì)照組TL1AmRNA和DcR3mRNA表達(dá)CT值分別為1.250±0.650和1.011±0.150，銀屑病組中TL1A和DcR3蛋白及mRNA水平明顯高于正常對(duì)照，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。銀屑病皮損中TL1A與DcR3的表達(dá)以及TL1A mRNA與DcR3 mRNA蛋白的表達(dá)均呈正相關(guān)性(r＝0.735，P＜0.01和r＝0.2436，P＞0.05)。結(jié)論: TL1A和DcR3可能參與銀屑病炎癥的發(fā)生機(jī)制。

尋常型銀屑??； 腫瘤壞死因子樣配體1A； 誘騙受體3

目前認(rèn)為銀屑病是一種在多種內(nèi)外環(huán)境因素影響下由多基因遺傳背景控制的T細(xì)胞功能異常的免疫性疾病，涉及到免疫、炎癥、細(xì)胞增殖與凋亡、微血管異常等多方面原因，其發(fā)病機(jī)制尚未完全明了[1]。本文通過(guò)檢測(cè)銀屑病皮損中TL1A和DcR3的表達(dá)情況，進(jìn)一步探討銀屑病的發(fā)病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 30例尋常型銀屑病患者，其中男17例，女13例；年齡11～65歲，平均36.5歲；病程3個(gè)月～20年，平均5.8年；所有患者近2個(gè)月內(nèi)未系統(tǒng)應(yīng)用維A酸、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等藥物，2周內(nèi)未使用任何外用藥物及接受光療，女性患者排除妊娠哺乳期、月經(jīng)期。15例正常對(duì)照來(lái)自皮膚科及本院整形外科，其中男7例，女8例，年齡18～60歲，平均28.6歲。銀屑病患者的皮損面積和嚴(yán)重程度按PASI評(píng)分為8～24.2，平均17.697±4.547。每一例活檢標(biāo)本均一分為二，一份經(jīng)10%中性福爾馬林液固定24 h，常規(guī)石蠟包埋用于免疫組化實(shí)驗(yàn)；另一份裝入凍存管中液氮保存，用于RT-PCR實(shí)驗(yàn)。

1.2 試劑 兔抗人TL1A多克隆抗體，兔抗人DcR3多克隆抗體均購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，免疫組化SP試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，TL1A抗體工作濃度為1∶50，DcR3抗體工作濃度為1∶50。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化SP法 將組織蠟塊作4μm厚連續(xù)切片，分別做常規(guī)HE染色和免疫組化染色。具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。陽(yáng)性結(jié)果為陽(yáng)性染色定位于細(xì)胞漿或細(xì)胞間連接處，并出現(xiàn)黃色或棕褐色的細(xì)小顆粒著色。光鏡下隨機(jī)選取高倍視野5處，采用雙評(píng)分方法:根據(jù)染色強(qiáng)度評(píng)分:無(wú)顯色為0分，淺棕黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占的百分率評(píng)分:陽(yáng)性細(xì)胞率≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，≥51%為3分。雙盲法獨(dú)立檢測(cè)的兩次結(jié)果取平均值，兩種評(píng)分的平均值之和為其最終評(píng)分。1～2分判為“+”，3～4分判為“++”，5～6分判為“+++”。以(+)者為弱陽(yáng)性、(++)為陽(yáng)性、≥(+++)為強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法 PCR試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司。RNA提取按照試劑盒操作步驟采用Trizol法提取RNA，提取后用紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD260/OD280比值，該值在1.8～2.0之間提示純度滿足實(shí)驗(yàn)要求。引物序列由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成，使用引物設(shè)計(jì)軟件Primer 5.0輔助設(shè)計(jì)。引物序列:TL1A:上游引物序列CAAGTCTGTATGCGAAGTAGGT，下游引物序列AAGAAGGCTCCAAAGAAGGT，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為156 bp。DcR3:上游引物序列CTCAATGTGCCAGGCTCTTC，下游引物序列 CCTGGAAAGCCACAAAGTCG，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為 127 bp。β-actin:上游引物序列AGCGAGCATCCCCCAAAGTT，下 游 引 物 序 列GGGCACGAAGGCTCATCATT，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為285 bp。按照說(shuō)明書(shū)操作，反應(yīng)條件:50℃ 2 min，95℃ 10 min；95℃30 s，60℃30 s，40個(gè)循環(huán)。行溶解曲線，最終采用2-△△Ct法計(jì)算TL1A及DCR3的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以ˉx±s表示，計(jì)量資料均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用四格表卡方χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TL1A、DcR3與PASI評(píng)分的相關(guān)性，TL1A與DcR3間表達(dá)相關(guān)性分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TL1A的表達(dá) TL1A在正常皮膚未見(jiàn)明顯表達(dá)，極少可見(jiàn)微弱的免疫反應(yīng)定位于基底角質(zhì)形成細(xì)胞，但在深層真皮或血管周?chē)峭耆笔У?圖1a)。與之形成鮮明對(duì)比，在銀屑病皮損中TL1A表達(dá)于表皮內(nèi)全層細(xì)胞、炎性浸潤(rùn)細(xì)胞胞漿及真皮小血管周?chē)?，以?yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性為主(圖1b)。銀屑病患者組TL1A陽(yáng)性表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組(χ2＝21.787，P＜0.01)。見(jiàn)表1。

表1 TL1A、DcR3在銀屑病皮損和正常皮膚中的陽(yáng)性表達(dá)情況 例(%)

2.2 DcR3的表達(dá) 在大多數(shù)正常皮膚中可檢測(cè)到DcR3的表達(dá)，主要位于除角質(zhì)層以外的表皮各層角質(zhì)形成細(xì)胞的胞質(zhì)中。另外，在血管周?chē)鷧^(qū)域，也可見(jiàn)到DcR3的微弱表達(dá)(圖2a)。在銀屑病組中DcR3表達(dá)主要以表皮內(nèi)細(xì)胞胞漿、真皮乳頭層及血管周?chē)鷧^(qū)域?yàn)橹?圖2b)。DcR3在銀屑病皮損中的表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組(χ2＝3.906，P＜0.05)。見(jiàn)表1。

2.3 RT-PCR 見(jiàn)圖3、4。銀屑病組TL1A mRNA與DcR3 mRNA表達(dá)CT值分別為4.909±1.607和3.430 ±1.449，正常對(duì)照組TL1A mRNA與DcR3 mRNA表達(dá)CT值分別為1.250±0.650和1.011±0.150，兩組比較銀屑病組TL1A與DcR3的基因表達(dá)水平均明顯高于正常對(duì)照組(P＜0.01)(表2、圖5)。

表2 TL1A mRNA與DcR3 mRNA在銀屑病皮損和正常皮膚中的定量表達(dá)(ˉx±s)

圖1 TL1A在正常皮膚(1a)及銀屑病皮損(1b)中的表達(dá)(SP，×100)

圖2 DCR3在正常皮膚(2a)及銀屑病皮損(2b)中的表達(dá)(SP，×100)

圖3 TL1A mRNA在尋常型銀屑病皮損組織和正常皮膚組織中的表達(dá)(1～6為正常人，7～13為尋常型銀屑病患者)

圖5 TL1AmRNA、DcR3mRNA在銀屑病皮損組織及正常組織中的表達(dá)

2.4 相關(guān)性分析 運(yùn)用Spearman等級(jí)相關(guān)性分析顯示:銀屑病皮損中TL1A與DcR3的蛋白表達(dá)呈正相關(guān)性(r＝0.735，P＜0.01)，見(jiàn)表3。銀屑病皮損中TL1A mRNA與DcR3 mRNA表達(dá)水平之間及它們分別與PASI之間的相關(guān)性分析，見(jiàn)表4。

表3 銀屑病皮損中TL1A與DcR3的相關(guān)性

表4 銀屑病組皮損TL1AmRNA、DcR3mRNA與PASI及TL1A mRNA與DcR3 mRNA間相關(guān)性分析

3 討論

有大量研究表明，腫瘤壞死因子(tumor necrosis factorα，TNF-α)作為一種促炎癥性細(xì)胞因子，在銀屑病炎癥反應(yīng)、免疫-信號(hào)傳導(dǎo)及新型治療等方面都起到了關(guān)鍵性的作用，這提示家族中的其它成員也可能參與慢性皮膚炎癥反應(yīng)[2，3]。

腫瘤壞死因子樣配體1A(TNF-like ligand 1 aberrance，TL1A)與TNF-α同屬于TNF超家族成員，是一種內(nèi)皮衍生的T細(xì)胞共刺激因子，TL1A不僅能抑制腫瘤生長(zhǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，還具有獨(dú)特的Th1極化特性，通過(guò)與其受體DR3或DcR3的結(jié)合，增加輔助性T細(xì)胞因子分泌的生理學(xué)活性，為T(mén)細(xì)胞的活化提供第二信號(hào)。同時(shí)TL1A還能夠增強(qiáng)Th1和Th17細(xì)胞的分化和增殖，Th17細(xì)胞主要分泌IL-17、IL-22、IL-23和TNF-α等細(xì)胞因子，其中IL-17具有很強(qiáng)的促炎癥作用，在多種自身免疫性疾病及慢性炎癥反應(yīng)性疾病中都有豐富的表達(dá)[4，5]。目前認(rèn)為細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)及多種免疫活性物質(zhì)的共同參與在銀屑病的發(fā)病和持續(xù)反復(fù)發(fā)作過(guò)程中起關(guān)鍵作用，而TL1A與銀屑病的相關(guān)報(bào)道很少，Bamias等利用免疫組化和定量RT-PCR技術(shù)首次發(fā)現(xiàn)并證實(shí)銀屑病皮損中TL1A及其受體DR3、DcR3蛋白水平和mRNA表達(dá)水平比正常皮膚增高，提示TL1A參與了銀屑病的病理過(guò)程[6]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫組化和RT-PCR的方法，對(duì)銀屑病皮損進(jìn)行研究，結(jié)果顯示TL1A無(wú)論在蛋白還是mRNA水平都有明顯的高表達(dá)，與正常對(duì)照組相比較差異有顯著性意義，這與Bamias等的研究結(jié)果相符合。因而它極有可能在銀屑病的免疫反應(yīng)及其慢性炎癥反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮作用。

誘騙受體3(decoy receptor3，DcR3)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種新型免疫分子，是屬于腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族成員。目前已知DcR3的配體主要有:FasL、LIGHT、TL1A，它與這3種配體的親和力依次為:TL1A＞FasL＞LIGHT[7]。DcR3與DR3競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合TL1A，可以抑制T細(xì)胞的凋亡，調(diào)節(jié)T細(xì)胞向Th2分化，抑制致炎細(xì)胞因子分泌，降低IL-2的反應(yīng)性活性。另外它與TL1A相互作用能上調(diào)MMP-2mRNA的水平及酶活性，在體內(nèi)促成新生血管的生成[8]。DcR3通過(guò)NF-кB依賴途徑上調(diào)ICAM-1、VCAM-1和IL-8的表達(dá)，增加單核細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的黏附性，吸引大量炎癥細(xì)胞在皮膚損害處聚集[8]。目前DcR3在消化系統(tǒng)腫瘤、肺癌、泌尿系統(tǒng)腫瘤、婦科腫瘤及內(nèi)分泌腫瘤中的研究已有較多報(bào)道[9]。在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎[10]、克羅恩腸病[11]、系統(tǒng)性紅斑狼瘡[12]及急性呼吸窘迫征中[13]，亦發(fā)現(xiàn)DcR3表達(dá)增高現(xiàn)象。DcR3與銀屑病的關(guān)系在國(guó)外也有報(bào)道，Wu等利用ELISA和免疫組化發(fā)現(xiàn)銀屑病患者血清和皮損中DcR3蛋白水平表達(dá)增高，表明DcR3可能參與了銀屑病慢性炎癥及血管生成的過(guò)程[7]。同時(shí)也說(shuō)明DcR3非腫瘤細(xì)胞所特有，在銀屑病這種角質(zhì)形成細(xì)胞過(guò)度增殖性疾病中亦存在表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)表明，DcR3在正常皮膚與銀屑病皮損中均表達(dá)，二者比較差異有顯著意義。由此推測(cè)銀屑病皮損中真皮淺層新生血管的生成及慢性炎癥的過(guò)程可能是DcR3陽(yáng)性表達(dá)增高的結(jié)果。

TL1A與 DcR3在銀屑病皮損組織中共表達(dá)上調(diào)，提示兩者之間可能以協(xié)同或互補(bǔ)的方式共同促進(jìn)銀屑病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。銀屑病患者皮損中DcR3 mRNA水平與PASI呈正相關(guān)趨勢(shì)(P＜0.05)，提示DcR3與銀屑病的活動(dòng)性有一定的相關(guān)性。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)TL1A、DcR3在銀屑病中的表達(dá)特征及相互關(guān)系的研究證實(shí)了兩者在銀屑病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中都發(fā)揮了重要作用，這也為T(mén)L1A、DcR3應(yīng)用于銀屑病的基因治療及生物治療提供了理論依據(jù)。由于條件所限，本研究所涉樣本量小，且尚未對(duì)銀屑病發(fā)病過(guò)程中的各個(gè)時(shí)期及非皮損處TL1A及DcR3的表達(dá)進(jìn)行對(duì)照研究，在今后的研究中應(yīng)擴(kuò)大樣本量并充實(shí)研究?jī)?nèi)容，并從分子學(xué)水平研究其在銀屑病皮損中的異常表達(dá)。

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Expression of TL1A and its receptor DcR3 in the skin lesions of psoriasis vu lgaris

ZHANG Lifang，SHENGWanxiang，MIAO Zequn，SONG Jiquan.
Department of Dermatology，Zhongnan Hospital，Wuhan University，Wuhan 430071，China Corresponding author:SHENGWanxiang，E-mail:shengwanxiang@126.com

Objective:To investigate the expression of TNF-like ligand 1 aberrance(TL1A)and its receptor decoy receptor3(DcR3)in the skin lesions of the patients with psoriasis vulgaris(PV).M ethods: The expression of TL1A and DcR3 in the skin lesions of 30 patientswith PV was tested with SP immunohistochemical and real-time fluorescence quantitative RT-PCRmethod.Results:The positivity rates of TL1A and DcR3 proteinswere 93.3%and 90%in PV，and were 20%and 60%in the normal samples.The expression levels of TL1A mRNA and DcR3 mRNA were(4.909±1.607)and(3.430±1.449)in PV，and(1.250± 0.650)and(1.011±0.150)in normal skin.The level of TL1A and DcR3 protein and mRNA were significantly higher in PV than that in normal tissue，with a significant difference.There was a positively correlation between the protein level of TL1A and DcR3 in PS(P＜0.01)；TL1A mRNA and DCR3 mRNA expression in psoriatic lesion was a positive correlation(P＜0.05)；TL1A mRNA expression in PSand PASIshows no correlation(P＞0.05)；DcR3 mRNA expression in PS was positively correlation with PASI(P＜0.05). Conclusion:TL1A and DcR3may participate in the pathogenesis of chronic skin inflammation in psoriasis.

psoriasis vulgaris；TNF-like ligand 1 aberrance；decoy receptor3

湖北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào):2014CFB360)

武漢大學(xué)中南醫(yī)院皮膚科，湖北武漢，430071

盛晚香，E-mail:shengwanxiang@126.com