范向華 繆 旭 林 樺 施 健

朗格漢斯細(xì)胞表面分子與尖銳濕疣復(fù)發(fā)的相關(guān)性

范向華 繆 旭 林 樺 施 健

目的: 確定朗格漢斯細(xì)胞(Langerhans cells，LC)表面分子與尖銳濕疣(condyloma acum inatum，CA)復(fù)發(fā)的相關(guān)性。方法: 采用免疫組化方法對(duì)正常包皮、CA初發(fā)和復(fù)發(fā)患者皮損組織中LC進(jìn)行CD1a、S100、HLA-DR標(biāo)記，并對(duì)其表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行半定量分析。結(jié)果: 正常對(duì)照組、CA初發(fā)組及CA復(fù)發(fā)組CD1a免疫組化染色I(xiàn)OD值分別為7644.84±2865.10、4075.62±2410.39和2308.08±1256.34；S100分別為4400.34±2962.29、1815.78±1013.35及1414.46±1337.13，CA組織中LC的CD1a及S100分子表達(dá)較正常組織顯著下降(P＜0.05)，在復(fù)發(fā)組尤為明顯。HLA-DR IOD值分別為583.91±592.85、2262.87±2983.09和1191.75±1698.36。HLA-DR的表達(dá)在CA初發(fā)組和復(fù)發(fā)組均強(qiáng)于正常組，但復(fù)發(fā)組較初發(fā)組下降。結(jié)論: HPV感染人體后，會(huì)導(dǎo)致HPV感染的免疫逃避，造成CA的持續(xù)感染和易復(fù)發(fā)。

尖銳濕疣； 人乳頭瘤病毒； 免疫組化； 朗格漢斯細(xì)胞

尖銳濕疣(CA)是臨床常見的性傳播疾病(sexually transmitted diseases，STD)，在國內(nèi)監(jiān)測(cè)的STD中發(fā)病率為第三位[1]。CA治療后極易復(fù)發(fā)，短期難以根治。免疫機(jī)制為影響CA轉(zhuǎn)歸的主要因素，其決定病毒被清除或長期在體內(nèi)存活繼而引起相關(guān)腫瘤[2]。LC為樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)系統(tǒng)中的一種獨(dú)特類型，作為皮膚、黏膜的抗原提呈細(xì)胞，在免疫系統(tǒng)中起重要作用。HPV感染后，LC在數(shù)量、密度、形態(tài)和功能上亦有不同程度的改變[3]。LC表面有多種分子，其中CD1a、S100和HLA-DR被認(rèn)為是LC區(qū)別于其他DC的標(biāo)志性表面標(biāo)記[4]，并在LC的各種生物學(xué)行為中起主導(dǎo)作用。

本研究通過免疫組化標(biāo)記正常皮膚組織、CA初發(fā)和CA復(fù)發(fā)患者皮膚LC表面功能分子CD1a、S100和HLA-DR，并測(cè)定三組皮膚組織LC表面功能分子表達(dá)水平，進(jìn)而分析及探討其與HPV感染和復(fù)發(fā)的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 病例資料 40例尖銳濕疣患者來自2009-2015年本院門診就診患者。均符合尖銳濕疣診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]。排除標(biāo)準(zhǔn):合并有其他局部感染或性傳播疾病、慢性嚴(yán)重感染、嚴(yán)重系統(tǒng)疾病、糖尿病、精神病、器官移植、惡性腫瘤、自身免疫性疾病等；近期內(nèi)系統(tǒng)使用過糖皮質(zhì)激素及免疫調(diào)節(jié)劑或免疫抑制劑等。其中初發(fā)患者20例，男13例，女7例，年齡20～61歲，平均34.25歲；病程1周～1年，平均63.30天。復(fù)發(fā)組20例，男12例，女8例，年齡21～63歲，平均32.90歲，復(fù)發(fā)病程以復(fù)發(fā)皮損至本次就診時(shí)間計(jì)為3天～9個(gè)月。初發(fā)病程與復(fù)發(fā)病程無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。正常對(duì)照組10人來自于包皮環(huán)切術(shù)后正常包皮，病理及HPV試劑盒檢測(cè)為陰性，年齡16～38歲，平均33.5歲。

1.2 試劑 抗CD1a、S100、HLA-DR抗體、DAB顯色試劑盒及HRP偶聯(lián)的山羊抗兔二抗購置自福州邁新公司；封閉血清購置自Sigma公司。

1.3 方法 所有組織予10%福爾馬林溶液固定后常規(guī)制成蠟塊，對(duì)石蠟切片標(biāo)本和正常包皮組織分別予ELIVISION二步法進(jìn)行CD1a、S100、HLA-DR免疫組化染色，采用OLYMPUSCX41顯微鏡及江蘇省捷達(dá)軟件工程公司JD-801病理圖文工作站，相同曝光條件下取圖，每張切片在高倍鏡(10×40)下隨機(jī)選擇5個(gè)不連續(xù)視野，用Image pro-plus 6專業(yè)圖像分析軟件對(duì)圖像進(jìn)行半定量分析，計(jì)算出每張切片的累積光密度值(IOD)。

2 結(jié)果

2.1 LC表面分子免疫組化染色 對(duì)三組標(biāo)本LC表面分子CD1a、S100、HLA-DR進(jìn)行免疫組化染色，其中棕色部分為陽性染色。CD1a、S100染色標(biāo)本中，陽性染色LC數(shù)量和形態(tài)方面，正常包皮組織中見表皮內(nèi)較多陽性染色LC，細(xì)胞結(jié)構(gòu)輪廓清晰，胞體呈圓形、橢圓形或不規(guī)則形，樹突狀突起較多且細(xì)長，可見二級(jí)突起(圖1a，1d)；初發(fā)組CA皮損表皮中LC數(shù)目較正常包皮組織減少，LC細(xì)胞結(jié)構(gòu)輪廓尚清晰，胞體呈類圓形、橢圓形或不規(guī)則形，樹突狀突起減少、變短(圖1b，1e)；復(fù)發(fā)組CA皮損表皮中LC數(shù)量明顯減少，胞體較小，樹突狀突起明顯減少、縮短或消失，部分LC結(jié)構(gòu)不完整，個(gè)別標(biāo)本表皮局部LC消失(圖1c，1f)。LC表面分子CD1a、S100陽性染色強(qiáng)度方面，CA患者較正常對(duì)照組明顯下降，且復(fù)發(fā)組下降尤為顯著。而HLA-DR染色標(biāo)本中，正常對(duì)照組陽染細(xì)胞數(shù)量較少，胞體多呈類圓形，樹突狀結(jié)構(gòu)不明顯(圖1g)；CA初發(fā)組則較正常對(duì)照組數(shù)量明顯增多，胞體及分枝清晰(圖1h)；CA復(fù)發(fā)組中陽染細(xì)胞數(shù)量雖仍較正常對(duì)照組增多，但較初發(fā)組下降，胞體小且分枝短小(圖1i)。在LC表面分子HLA-DR陽性染色強(qiáng)度方面，CA患者初發(fā)及復(fù)發(fā)組均較正常對(duì)照組升高，但復(fù)發(fā)組較初發(fā)組下降。

2.2 免疫組化染色I(xiàn)OD測(cè)定 采用圖像分析軟件進(jìn)行半定量分析發(fā)現(xiàn)，并采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。在CD1a、S100免疫組化染色中，CA初發(fā)及復(fù)發(fā)組IOD值顯著低于正常對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，復(fù)發(fā)組較初發(fā)組IOD值降低，兩組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。而對(duì)于HLA-DR，CA初發(fā)組較正常對(duì)照組增高(P＜0.05)，復(fù)發(fā)組IOD值雖仍較正常對(duì)照組增加，但較初發(fā)組降低，且未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，見表1。

3 討論

LC來源于骨髓造血干細(xì)胞，為一種特殊類型的樹突狀細(xì)胞。正常免疫狀態(tài)下，當(dāng)遭遇感染或炎癥后，LC的數(shù)量、密度較正常反應(yīng)性增加，主要發(fā)揮攝取、加工、處理抗原的作用，同時(shí)亦會(huì)發(fā)生形態(tài)學(xué)變化，逐步離開表皮移行至局部引流淋巴結(jié)，并將抗原呈遞給T輔助細(xì)胞，在協(xié)同刺激因子的作用下使之活化，從而啟動(dòng)免疫應(yīng)答。LC表面分子CD1a、S100和HLA-DR為LC發(fā)育成熟的不同階段的標(biāo)記并在免疫活動(dòng)中承擔(dān)不同角色[5，6]，其中CD1a是標(biāo)記人LC細(xì)胞的最可靠方法[7，8]。隨著LC不斷成熟，其吞噬和處理抗原的能力下降，而呈遞抗原和激活特異性T細(xì)胞的能力不斷加強(qiáng)。本研究顯示，CA皮損中，CD1a陽染LC數(shù)量較之正常組織明顯下降，細(xì)胞出現(xiàn)胞體變小，分枝變少，且其IOD值明顯降低，這些改變?cè)趶?fù)發(fā)組尤為明顯。HPV感染后，其病毒抗原僅在終末分化成熟的皮膚或黏膜上皮細(xì)胞內(nèi)表達(dá)[9]，而表皮中的LC通過其伸展的樹突結(jié)構(gòu)形成擴(kuò)張性網(wǎng)絡(luò)以識(shí)別外源性抗原[10]。當(dāng)抗原與LC表面受體Langerin結(jié)合后進(jìn)入胞內(nèi)，與Birbeck顆粒結(jié)合，再通過CD1a的特殊結(jié)構(gòu)通道表達(dá)于LC表面，從而為進(jìn)一步激活T細(xì)胞做好準(zhǔn)備[6]。CA組織中LC的數(shù)量、形態(tài)及功能分子的這些改變大大降低LC攝取和處理抗原的能力，進(jìn)而進(jìn)一步影響抗原傳遞和特異性T細(xì)胞的激活。而S100分子被認(rèn)為是LC的活化標(biāo)記，表達(dá)于成熟LC[11，12]。LC通過S100調(diào)節(jié)T細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，參與激活T細(xì)胞的過程[13]，本研究顯示，CA組織中S100陽染 LC數(shù)量、形態(tài)及表達(dá)強(qiáng)度出現(xiàn)與CD1a相似改變，表明HPV感染后，LC的成熟活化明顯受到阻礙，從而直接影響其抗原遞呈功能，進(jìn)而影響T細(xì)胞激活。HLA-DR是人類主要組織相容性復(fù)合物(MHC-II)類分子的主要抗原，表皮中主要表達(dá)于成熟的LC表面，在抗原遞呈中充當(dāng)?shù)谝恍盘?hào)的作用。其通過將抗原從胞內(nèi)囊泡傳遞到細(xì)胞表面，進(jìn)而被CD4+T細(xì)胞識(shí)別進(jìn)行抗原傳遞，是LC細(xì)胞實(shí)現(xiàn)抗原遞呈功能的前提和必需條件[14]。本研究表明，初發(fā)組CA患者中，HLA-DR較正常對(duì)照組表達(dá)增強(qiáng)，說明HPV感染上皮組織后，刺激了HLA-DR的表達(dá)，機(jī)體發(fā)揮免疫保護(hù)作用。而復(fù)發(fā)組CA患者，HLA -DR雖仍較對(duì)照組增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且較初發(fā)組下降，表明隨著病程的進(jìn)一步發(fā)展，病毒抗原刺激引起的免疫保護(hù)反應(yīng)不能抗衡病毒的免疫逃避機(jī)制，導(dǎo)致HLA-DR介導(dǎo)的抗原提呈作用下降。

表1 CA患者和正常對(duì)照組表面分子免疫組化染色I(xiàn)OD測(cè)定 (ˉx±s)

圖1 LC表面分子表達(dá)(IHC，×400)

本研究通過免疫組化染色觀察正常對(duì)照組、CA初發(fā)組和CA復(fù)發(fā)組LC表面三種分子表達(dá)，并進(jìn)行半定量分析，發(fā)現(xiàn)LC表面分子CD1a、S100表達(dá)強(qiáng)度在CA患者均有顯著下降，且復(fù)發(fā)組下降尤為顯著，這一改變降低了LC的抗原呈遞功能，從而導(dǎo)致HPV的持續(xù)感染和復(fù)發(fā)。其發(fā)生機(jī)制與HPV感染后表皮的E-cadherin蛋白的降低直接相關(guān)[15]。而HLA-DR在CA組織中表達(dá)強(qiáng)度雖有增強(qiáng)，尤其在初發(fā)期，一定程度上有利于LC抗原遞呈，對(duì)HPV感染起到一定保護(hù)作用，但隨著病程發(fā)展，其表達(dá)及所發(fā)揮的保護(hù)性作用下降。以上表明，HPV感染人表皮組織后，LC的抗原處理和傳遞功能受到了影響，尤其在復(fù)發(fā)患者中影響更為顯著，從而導(dǎo)致HPV感染的免疫逃避，造成CA的持續(xù)感染和易復(fù)發(fā)。

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Relationship between the surfacemolecules of Langerhans cells and recurrence of condyloma acum inatum

FAN Xianghua，MIAO Xu，LIN Hua，SHIJian.
Department of Dermatology，Nantong First People's Hospital，Nantong 226001，China Corresponding author:MIAO Xu，E-mail:mx730129@163.com

Objective:To determine the relationship between the surface molecules of langerhans cells (LC)and recurrence of condyloma acuminatum(CA).Methods:The expression of CD1a，S100 and HLADR of LC was measured by immunohistochemical technique，and their semi-quantities were analyzed by graphic software in skin samples of control group，primary CA group and recurrent CA group.Resu lts:In control group，primary CA group and recurrentCA group，the IOD of immunohistochemical staining of CD1a were 7644.84±2865.10，4075.62±2410.39 and 2308.08±1256.34；The IOD of S100 were 4400.34±2962.29，1815.78±1013.35 and 1414.46±1337.13.The staining intensity of CD1a and S100 in CA decreased significantly when compared with control group(P＜0.05)，with an even more decrease in the recurrent CA group. The IOD of HLA-DR were 583.91±592.85，2262.87±2983.09 and 1191.75±1698.36 in the three groups respectively.The staining intensity of HLA-DR was increased in primary and recurrent CA groups，when compared with control group，but the expression in recurrent group decreased when compared with primary group. Conclusion:After infection of HPV，immune escapewill occure and lead to the persistence and recurrence of CA.

Condyloma acuminatum；human papillomavirus；immunohistochemical staining；langerhans cells

南通市社會(huì)事業(yè)科技創(chuàng)新與示范計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào):HS2014048)

南通市第一人民醫(yī)院皮膚科，江蘇南通，226001

繆旭，E-mail:mx730129@163.com