錢 佶 王燏嬋 張學(xué)儉

江蘇大學(xué)附屬宜興醫(yī)院消化內(nèi)科1(214200) 南通大學(xué)免疫學(xué)與微生物學(xué)教研室2

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·論 著·

CDK14對(duì)人食管癌細(xì)胞增殖的影響及其可能機(jī)制研究

錢 佶1*王燏嬋2張學(xué)儉1#

江蘇大學(xué)附屬宜興醫(yī)院消化內(nèi)科1(214200) 南通大學(xué)免疫學(xué)與微生物學(xué)教研室2

背景：CDK14是一種新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶，在多種惡性腫瘤中表達(dá)增高，并與腫瘤惡性行為相關(guān)。目的：探討CDK14對(duì)人食管癌細(xì)胞增殖的影響及其可能機(jī)制。方法：采用蛋白質(zhì)印跡法和免疫組化法檢測(cè)8例新鮮食管鱗癌組織、96例食管鱗癌石蠟包埋組織和人食管癌細(xì)胞株Eca-109中的CDK14和細(xì)胞增殖標(biāo)記物PCNA、Ki-67表達(dá)，分析CDK14表達(dá)與食管癌臨床病理特征和患者預(yù)后的關(guān)系。以血清饑餓釋放試驗(yàn)分析CDK14表達(dá)與Eca-109細(xì)胞細(xì)胞周期的關(guān)系。以shRNA干擾Eca-109細(xì)胞中的CDK14表達(dá)，觀察抑癌蛋白R(shí)b磷酸化水平、細(xì)胞周期進(jìn)程和細(xì)胞增殖能力的變化。結(jié)果：CDK14在食管癌組織和細(xì)胞中呈高表達(dá)，與PCNA、Ki-67的表達(dá)趨勢(shì)相一致，其表達(dá)與食管癌的大小、組織學(xué)分級(jí)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(P<0.05)，高表達(dá)者總體生存率顯著低于低表達(dá)者(P<0.05)。血清饑餓釋放試驗(yàn)顯示CDK14的表達(dá)具有細(xì)胞周期依賴性。干擾CDK14可抑制Eca-109細(xì)胞Rb蛋白磷酸化，細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯，克隆形成數(shù)顯著減少(P均<0.05)。結(jié)論：CDK14在食管癌中呈高表達(dá)，其可能通過(guò)促進(jìn)下游Rb蛋白磷酸化推動(dòng)細(xì)胞周期進(jìn)程，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，參與食管癌的發(fā)生、發(fā)展。

細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶14； 食管腫瘤； 成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤蛋白； 細(xì)胞周期； 細(xì)胞增殖

Cell Proliferation

食管癌是全球范圍內(nèi)最常見(jiàn)的八大惡性腫瘤之一，我國(guó)為食管癌高發(fā)國(guó)，也是該病死亡率最高的國(guó)家[1-2]。食管癌惡性程度高，病程進(jìn)展迅速，易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，患者預(yù)后較差。因此，開(kāi)發(fā)和尋找新的治療食管癌的方法和分子靶點(diǎn)成為當(dāng)前重要課題。細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶14(cyclin-dependent kinase 14, CDK14)又名PFTK1(PFTAIRE protein kinase 1)，研究發(fā)現(xiàn)其在肝細(xì)胞癌、乳腺癌、食管癌、胃癌等多種惡性腫瘤中表達(dá)增高，并與腫瘤惡性行為相關(guān)[3-4]。對(duì)食管鱗癌患者的研究[5]顯示，癌組織中CDK14高表達(dá)與化療耐藥和預(yù)后不良有密切聯(lián)系。本研究在此基礎(chǔ)上探討CDK14對(duì)人食管癌細(xì)胞增殖的影響及其可能機(jī)制，以期進(jìn)一步闡明CDK14在食管癌發(fā)生、發(fā)展中的意義。

材料與方法

一、標(biāo)本來(lái)源

用于免疫組化染色的96例食管鱗癌石蠟包埋組織及其配對(duì)癌旁組織切片源自江蘇大學(xué)附屬宜興醫(yī)院2004—2008年病理診斷明確的手術(shù)切除食管鱗癌標(biāo)本。來(lái)源病例男性27例，女性69例，年齡39～78歲，平均62歲，術(shù)前均未接受放化療或其他抗腫瘤治療，臨床和病理資料完整，通過(guò)電話隨訪獲取患者預(yù)后信息。

另收集8例術(shù)前未接受放化療或其他抗腫瘤治療的食管鱗癌患者的新鮮手術(shù)切除標(biāo)本，取癌組織及其配對(duì)癌旁組織(距癌組織邊緣2 cm)，迅速液氮保存，用于蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)。

二、細(xì)胞株和主要試劑

人食管癌細(xì)胞株Eca-109、TE-1購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)上海保藏中心。鼠抗人CDK14單克隆抗體(PFTAIRE-1抗體C-3)、兔抗人cyclin E多克隆抗體(M-20)(Santa Cruz Biotechnology)，鼠抗人增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)單克隆抗體(Abcam plc.)，鼠抗人Ki-67單克隆抗體(BD Biosciences)，Rb相關(guān)抗體試劑盒(Cell Signaling Technology, Inc.)，PI(江蘇晶美生物科技有限公司)。靶向干擾CDK14的shRNA(sh-CDK14)由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)、合成，sh-CDK14#1序列：5’-GTT CAT TCT TTA CCA CAT T-3’，sh-CDK14#2序列：5’-AGG TTG CAT CTT TGT TGA A-3’，sh-CDK14#3序列：5’-AAA GAG TCA CCT AAA GTT A-3’，sh-CDK14#4序列：5’-ACC CAT ACA GGA AAT CCA A-3’；Super-Fect轉(zhuǎn)染試劑(QIAGEN)。

三、方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)：Eca-109細(xì)胞培養(yǎng)使用含10% FBS(56 ℃水浴30 min滅活補(bǔ)體)、2 mmol/L L-谷氨酰胺、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)傳代，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2. 蛋白質(zhì)印跡法：取食管癌組織及其配對(duì)癌旁組織各100 mg，加入1 mL RIPA裂解液，勻漿后離心15 min，取上清，BCA法測(cè)定蛋白濃度。取等量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電濕轉(zhuǎn)法將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉2 h，加入一抗(CDK14 1∶500, PCNA 1∶1 000，GAPDH 1∶3 000)，室溫孵育6～8 h或4 ℃過(guò)夜，加入HRP偶聯(lián)的二抗(1∶1 000)，室溫孵育2 h，ECL顯影。目的蛋白相對(duì)表達(dá)量以該蛋白條帶灰度值與內(nèi)參條帶灰度值的比值表示。

收集經(jīng)前期處理的不同人食管癌細(xì)胞株，加入適量細(xì)胞裂解液提取總蛋白，其余操作步驟與上述相同，一抗工作濃度分別為：CDK14 1∶500，β-actin 1∶1 000，GAPDH 1∶3 000, cyclin E 1∶500，Rb 1∶2 000,磷酸化Rb(p-Rb) 1∶1 000。

3.免疫組化染色：食管癌組織及其配對(duì)癌旁組織切片脫蠟、水化，0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)高溫高壓抗原修復(fù)，3%H2O2孵育10 min去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，加入CDK14抗體或Ki-67抗體，室溫孵育1～3 h或4 ℃過(guò)夜，加入二抗試劑A 37 ℃孵育20 min、二抗試劑B 37 ℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水、透明，封片。

結(jié)果判斷：根據(jù)染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分率綜合判斷免疫組化評(píng)分。染色強(qiáng)度：0分，無(wú)染色；1分，淺棕色；2分，棕色；3分，深棕色。陽(yáng)性細(xì)胞百分率：0分，<25%；1分，25%～50%；2分，50%～75%；3分，≥75%?？偡譃閮身?xiàng)評(píng)分的乘積(0～9分)：<5分為低表達(dá)，≥5分為高表達(dá)。

4. 血清饑餓釋放試驗(yàn)：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Eca-109細(xì)胞以完全培養(yǎng)基配制成5×104/mL，接種于培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)24 h后，以無(wú)血清培養(yǎng)基饑餓細(xì)胞72 h使細(xì)胞周期同步化，更換新鮮完全培養(yǎng)基，分別繼續(xù)培養(yǎng)0、3、6、9、12、24 h，收集細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。

5. 流式細(xì)胞分析：收集經(jīng)前期處理的Eca-109細(xì)胞，將單細(xì)胞懸液加入2 mL圓底離心管中，離心洗滌3次，加入2 mL預(yù)冷70%乙醇，4 ℃固定30 min，離心，PBS洗滌1次，加入RNA酶A，37 ℃孵育30 min，加入PI，室溫避光孵育30 min，過(guò)300目篩網(wǎng)，上流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期。

6. 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Eca-109細(xì)胞以不含青-鏈霉素的完全培養(yǎng)基配制成1×106/mL，在6 cm培養(yǎng)皿內(nèi)以4 mL培養(yǎng)基鋪板。24 h后以500 mL無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋分別攜帶sh-CDK14#1、#2、#3、#4的質(zhì) 粒和攜帶非特異性序列的對(duì)照質(zhì)粒各2 g；以500 mL 無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋4 mL SuperFect轉(zhuǎn)染試劑，室溫保溫5 min；將稀釋的質(zhì)粒與稀釋的轉(zhuǎn)染試劑混合，輕混勻，室溫孵育15 min以形成RNA-脂質(zhì)體復(fù)合物，將復(fù)合物加入細(xì)胞中，6 h后換液，36～48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。

7. 克隆形成實(shí)驗(yàn)：收集各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Eca-109細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化、吹打成單個(gè)細(xì)胞，懸浮于含10% FBS的培養(yǎng)基中備用。細(xì)胞懸液作梯度倍數(shù)稀釋，分別以50、100、200個(gè)/皿的梯度密度接種于含10 mL 37 ℃預(yù)溫培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)使細(xì)胞分散均勻，37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2～3周，定期觀察，培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)克隆時(shí)終止培養(yǎng)，棄上清，PBS小心浸洗2次，4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min，去固定液，加入適量Gimsa染液染色10～30 min，流水緩慢洗去染色液，空氣中干燥。將平皿倒置并疊加一張帶網(wǎng)格的透明膠片，肉眼直接計(jì)數(shù)克隆數(shù)。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、CDK14在食管癌組織和細(xì)胞中呈高表達(dá)

蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)顯示，CDK14在食管癌組織中的表達(dá)顯著高于配對(duì)癌旁組織(P<0.05)，與細(xì)胞增殖標(biāo)記物PCNA表達(dá)趨勢(shì)相一致(圖1A、1B)；CDK14在人食管癌細(xì)胞株Eca-109和TE-1中亦呈陽(yáng)性表達(dá)(圖1C、1D)。上述結(jié)果表明CDK14可能通過(guò)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖參與食管癌的發(fā)生、發(fā)展。

圖1 CDK14在食管癌組織和細(xì)胞中呈高表達(dá)

二、食管癌組織中CDK14表達(dá)與腫瘤臨床病理特征和患者預(yù)后的關(guān)系

免疫組化染色顯示，CDK14在食管癌組織中的表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核(圖2)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示其表達(dá)與細(xì)胞增殖標(biāo)記物Ki-67表達(dá)呈正相關(guān)，并與腫瘤大小、組織學(xué)分級(jí)、腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移(包括淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移)以及患者預(yù)后顯著相關(guān)(P<0.05)，與患者性別、年齡無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)(表1)。生存分析顯示，CDK14高表達(dá)者總體生存率顯著低于低表達(dá)者(P<0.05)(圖3)。上述結(jié)果表明CDK14高表達(dá)可能與食管癌惡性程度高和預(yù)后不良有關(guān)。

圖2 CDK14在食管癌組織及其配對(duì)癌旁組織中的表達(dá)(免疫組化染色，×20)

圖3 CDK14表達(dá)與食管癌患者預(yù)后的關(guān)系(Kaplan-Meier生存曲線)

三、血清饑餓釋放試驗(yàn)中Eca-109細(xì)胞CDK14表達(dá)情況

流式細(xì)胞分析顯示，Eca-109細(xì)胞經(jīng)無(wú)血清培養(yǎng)基饑餓72 h使細(xì)胞周期同步化后，73.98%的細(xì)胞停滯于G1期(0 h)，而血清釋放(即更換新鮮完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng))可推進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程，隨著時(shí)間的推移，細(xì)胞逐漸由G1期向S期(6～9 h)、G2期(12 h)轉(zhuǎn)換，提示細(xì)胞處于增殖狀態(tài)(圖4A)。蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)顯示，經(jīng)血清饑餓72 h的Eca-109細(xì)胞CDK14表達(dá)水平較低，血清釋放后其表達(dá)逐漸升高，于9 h時(shí)(G1/S期)達(dá)峰值，而后逐漸下降，與cyclin E的表達(dá)趨勢(shì)相一致(圖4B、4C)。上述發(fā)現(xiàn)表明，CDK14主要表達(dá)于G1/S期，其表達(dá)具有細(xì)胞周期依賴性，食管癌中CDK14高表達(dá)可能通過(guò)影響腫瘤細(xì)胞周期進(jìn)程發(fā)揮作用。

表1 96例食管癌組織中CDK14表達(dá)與腫瘤臨床病理特征 的關(guān)系n(%)

臨床病理特征例數(shù)CDK14評(píng)分<5≥5P值性別0.240 男277(25.9)20(74.1) 女6928(40.6)41(59.4)年齡1.000 <60歲3613(36.1)23(63.9) ≥60歲6022(36.7)38(63.3)腫瘤大小0.002 <5cm2817(60.7)11(39.3) ≥5cm6818(26.5)50(73.5)組織學(xué)分級(jí)0.015 Ⅰ158(53.3)7(46.7) Ⅱ4721(44.7)26(55.3) Ⅲ346(17.6)28(82.4)浸潤(rùn)深度0.020 T11410(71.4)4(28.6) T2208(40.0)12(60.0) T3246(25.0)18(75.0) T43811(28.9)27(71.1)轉(zhuǎn)移0.036 無(wú)2815(53.6)13(46.4) 有6820(29.4)48(70.6)Ki-670.016 低表達(dá)118(72.7)3(27.3) 高表達(dá)8527(31.8)58(68.2)生存情況0.044 16428(43.8)36(56.2) 0327(21.9)25(78.1)

四、干擾CDK14可抑制Eca-109細(xì)胞Rb蛋白磷酸化

蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)顯示，4個(gè)靶向干擾CDK14的shRNA中，shCDK14#3轉(zhuǎn)染后對(duì)Eca-109細(xì)胞CDK14表達(dá)的抑制作用最強(qiáng)(P<0.05)(圖5A、5B)，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)均使用shCDK14#3轉(zhuǎn)染。干擾CDK14表達(dá)后，抑癌基因Rb蛋白表達(dá)雖無(wú)明顯改變，但其磷酸化水平較對(duì)照組顯著降低(P<0.05)(圖5C、5D)，表明食管癌中CDK14高表達(dá)可能通過(guò)磷酸化下游分子Rb發(fā)揮作用。

圖4 CDK14在Eca-109細(xì)胞細(xì)胞周期進(jìn)程中的表達(dá)情況

五、干擾CDK14可使Eca-109細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞周期G1期阻滯

流式細(xì)胞分析顯示，在Eca-109細(xì)胞中干擾CDK14表達(dá)后，細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯，細(xì)胞周期分布與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖5E)，表明食管癌中CDK14高表達(dá)可能推動(dòng)細(xì)胞周期進(jìn)程。

六、干擾CDK14可促進(jìn)Eca-109細(xì)胞增殖

克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示，在Eca-109細(xì)胞中干擾CDK14表達(dá)后，形成的克隆數(shù)較對(duì)照組顯著減少(P<0.05)(圖5F)，表明食管癌中CDK14高表達(dá)可能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的增殖能力。

討 論

目前研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞周期調(diào)節(jié)紊亂在各種因素引起的食管鱗癌發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[6-7]。精確而嚴(yán)格的細(xì)胞周期調(diào)控取決于以下因素：cyclins、CDKs和CDK抑制因子(CKI)，其中CDK為核心調(diào)控成分，其調(diào)控異常與腫瘤發(fā)生過(guò)程中的非程序性增殖、基因組不穩(wěn)定性和染色體不穩(wěn)定性密切相關(guān)[8]。多種CDKs失調(diào)參與了食管癌的發(fā)生、發(fā)展和化療耐藥過(guò)程，如CDK2在食管癌組織中高表達(dá)，并與腫瘤進(jìn)展相關(guān)[9]，而CDK4/6可作為食管癌治療的靶點(diǎn)[10]。因此，研究食管癌中CDKs的調(diào)節(jié)機(jī)制及其與細(xì)胞周期的相關(guān)性對(duì)于明確食管癌發(fā)生、發(fā)展和化療耐藥的分子機(jī)制以及探索干預(yù)食管癌進(jìn)程的分子靶點(diǎn)具有重要意義。

CDKs家族以具有相同催化活性的蛋白序列為特點(diǎn)，目前已重新命名為CDK1至CDK20[11]。其中CDK14又名PFTK1，是一種新發(fā)現(xiàn)的CDK，為Cdc2(cell division cycle 2)相關(guān)蛋白激酶家族成員之一，已知該家族成員可參與調(diào)控細(xì)胞周期G1/S、G2/M期轉(zhuǎn)化[12]。既往研究發(fā)現(xiàn)CDK14在多種惡性腫瘤中表達(dá)增高，本研究對(duì)食管癌組織和細(xì)胞的檢測(cè)亦顯示CDK14呈高表達(dá)，與細(xì)胞增殖標(biāo)記物PCNA、Ki-67的表達(dá)趨勢(shì)相一致，且其高表達(dá)與食管癌的大小、組織學(xué)分級(jí)和浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，并預(yù)示預(yù)后不良。上述發(fā)現(xiàn)提示CDK14在食管癌中可能起癌基因作用，因此有必要深入研究CDK14在食管癌中的臨床意義。

本研究血清饑餓釋放試驗(yàn)結(jié)果提示CDK14在人食管癌細(xì)胞株Eca-109中的表達(dá)具有細(xì)胞周期依賴性，其主要在G1/S期高表達(dá)，而后逐漸下降， 與

圖5 干擾CDK14對(duì)Eca-109細(xì)胞Rb蛋白磷酸化、細(xì)胞周期進(jìn)程和細(xì)胞增殖能力的影響

cyclin E的表達(dá)趨勢(shì)相一致。既往研究發(fā)現(xiàn)cyclin E/CDK2在G1期和G1/S期轉(zhuǎn)化過(guò)程中發(fā)揮重要作用，能通過(guò)磷酸化抑癌蛋白R(shí)b促進(jìn)細(xì)胞由G1期向S期轉(zhuǎn)化[7，13]。為進(jìn)一步了解CDK14在食管癌細(xì)胞中的功能及其作用機(jī)制，本研究以RNA干擾技術(shù)靶向抑制Eca-109細(xì)胞中的CDK14表達(dá)(實(shí)驗(yàn)組)，并以轉(zhuǎn)染非特異性序列的Eca-109細(xì)胞作為對(duì)照組，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組Rb蛋白磷酸化水平較對(duì)照組顯著降低。Rb蛋白是一個(gè)經(jīng)典的抑癌蛋白，在細(xì)胞周期進(jìn)程中可與轉(zhuǎn)錄因子E2F結(jié)合而抑制其活性，通過(guò)減少癌基因轉(zhuǎn)錄、表達(dá)而發(fā)揮抑癌作用。諸多細(xì)胞周期相關(guān)分子可磷酸化Rb蛋白而使之失活，從而使游離的E2F進(jìn)入細(xì)胞核，與下游基因啟動(dòng)子區(qū)序列結(jié)合而促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄、表達(dá)，推動(dòng)細(xì)胞周期由G1期進(jìn)入S期，增強(qiáng)細(xì)胞增殖能力[14]。由此推測(cè)在食管癌細(xì)胞中，CDK14可能是通過(guò)磷酸化Rb蛋白，進(jìn)而影響細(xì)胞周期而發(fā)揮促增殖作用。有研究[15]報(bào)道，在人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株SH-SY5Y中干擾CDK14表達(dá)后，細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯，同時(shí)Rb蛋白磷酸化水平降低，佐證了本實(shí)驗(yàn)結(jié)果。本研究在食管癌細(xì)胞中干擾CDK14表達(dá)，同樣發(fā)現(xiàn)細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯，細(xì)胞克隆形成數(shù)顯著減少。除通過(guò)磷酸化Rb蛋白外，CDK14還可通過(guò)磷酸化激活鈣調(diào)結(jié)合蛋白(caldesmon)、影響細(xì)胞骨架而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移[16]。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)CDK14在食管癌中呈高表達(dá)，其可能通過(guò)促進(jìn)下游Rb蛋白磷酸化導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子E2F釋放及其下游靶基因轉(zhuǎn)錄、表達(dá)，從而推動(dòng)細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，參與食管癌的發(fā)生、發(fā)展。本研究結(jié)果有助于理解CDK14在食管癌發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后中的作用，并為抗癌藥物的設(shè)計(jì)提供了新的作用靶點(diǎn)。

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(2016-02-24收稿；2016-05-06修回)

Effect of CDK14 on Proliferation of Human Esophageal Carcinoma Cells and its Possible Mechanism

QIANJi1,WANGYuchan2,ZHANGXuejian1.

1DepartmentofGastroenterology,AffiliatedYixingHospitalofJiangsuUniversity,Yixing,JiangsuProvince(214200);2DepartmentofImmunologyandMicrobiology,NantongUniversity,Nantong,JiangsuProvince

ZHANG Xuejian, Email: staff1232@yxph.com

Cyclin-Dependent Kinase 14; Esophageal Neoplasms; Retinoblastoma Protein; Cell Cycle;

10.3969/j.issn.1008-7125.2016.10.002

*Email: jill_qj@163.com

#本文通信作者，Email: staff1232@yxph.com

Background: CDK14 is a novel cyclin-dependent kinase, which is overexpressed in a variety of cancer and related to their malignant behavior. Aims: To investigate the effect of CDK14 on proliferation of human esophageal carcinoma cells and its possible mechanism. Methods: Expressions of CDK14 and two cell proliferation markers, PCNA and Ki-67 were estimated in 8 fresh-frozen specimens of esophageal squamous cell carcinoma (ESCC), 96 paraffin-embedded specimens of ESCC, and human ESCC cell line Eca-109 by Western blotting and immunohistochemistry. Correlations of CDK14 expression with the clinicopathological characteristics and prognosis of ESCC were analyzed. Serum starvation and release assay was performed to evaluate the relationship between CDK14 expression and cell cycle progression in Eca-109 cells. Furthermore, Eca-109 cells were transiently transfected with shRNA-CDK14 to reduce CDK14 protein level, and then the phosphorylation of tumor suppressor protein Rb, cell cycle progression and proliferation capability of Eca-109 cells were determined. Results: CDK14 was highly expressed in both ESCC tissue and cell line, which was paralleled with the expressions of PCNA and Ki-67 and correlated significantly with the tumor size, histological grade, invasiveness and metastasis of ESCC (P<0.05). The overall survival was poor in patients with high CDK14 expression than those with low CDK14 expression (P<0.05). Serum starvation and release assay showed that the expression of CDK14 was cell cycle-dependent. Knockdown of CDK14 reduced the expression level of phosphorylated Rb, induced significant G1 phase arrest and resulted in less colony formation in Eca-109 cells (Pall <0.05). Conclusions: CDK14 is highly expressed in ESCC. It may promote cell cycle progression by phosphorylating downstream Rb protein, thus enhancing the proliferation of tumor cells, and ultimately participating in the occurrence and development of ESCC.