殷亞蘭，常瑋，張濤 ，林青，晁群芳，李春，霍向東

( 1. 新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，烏魯木齊 830046； 2. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所，烏魯木齊 830091；3. 北京理工大學(xué)生命學(xué)院，北京 100081)

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新疆吐魯番地區(qū)耐熱真菌多樣性及其功能酶的篩選

殷亞蘭1,2，常瑋2，張濤2，林青2，晁群芳1，李春3，霍向東2

( 1. 新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，烏魯木齊 830046； 2. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所，烏魯木齊 830091；3. 北京理工大學(xué)生命學(xué)院，北京 100081)

【目的】了解新疆吐魯番地區(qū)耐熱真菌多樣性，并對其產(chǎn)酶活性進行研究?！痉椒ā坷闷桨逋坎挤◤?2份土壤樣品中分離耐熱真菌，基于形態(tài)學(xué)和18S rDNA基因序列同源性研究耐熱真菌多樣性；利用6種篩選培養(yǎng)基對分離到的菌株進行產(chǎn)酶活性篩選?！窘Y(jié)果】分離得到129株耐熱真菌，形態(tài)學(xué)觀察和18S rDNA序列分析表明，這些真菌歸于11個屬，其中曲霉屬(Aspergillus)和裸胞殼屬(Emericella)為優(yōu)勢菌群。產(chǎn)酶活性研究表明，13株產(chǎn)糖苷酶，13株產(chǎn)淀粉酶，11 株產(chǎn)維素酶，16 株產(chǎn)木聚糖酶，8株產(chǎn)蛋白酶，10株產(chǎn)脂肪酶，16株產(chǎn)木聚糖酶?！窘Y(jié)論】新疆吐魯番地區(qū)耐熱真菌資源豐富，產(chǎn)酶種類多樣，為開發(fā)利用這一類群真菌資源奠定了基礎(chǔ)。

耐熱真菌；多樣性；功能酶

0 引 言

【研究意義】耐熱真菌(thermotolerantfungi)是一類最高生長溫度在50℃左右(通常為40℃或以上)，最低生長溫度在20℃以下的特殊真菌類群[1]，在高溫條件下表現(xiàn)出獨特的生存適應(yīng)能力。吐魯番地區(qū)地處歐亞大陸腹地，由于地勢低洼，增溫快、散熱慢、冷濕空氣不易進入，形成了極端干旱的溫帶內(nèi)陸荒漠氣候，其主要特點是：熱量豐富、極端干燥、高溫多風(fēng)、降雨稀少、蒸發(fā)強烈、無霜期長、風(fēng)大風(fēng)多。全年日照時數(shù)2 957.7～3 122.8 h，平均氣溫13.35℃，35℃ 以上氣溫可持續(xù)165 d，40℃以上高溫可達106 d。日溫差和年溫差均較大，高于10℃年積溫為4 525.5～5 733℃[2]。夏季中午地表溫度一般在70℃以上，最高曾達到82.3℃[3]。特殊的自然環(huán)境為耐熱微生物的生長繁殖創(chuàng)造了條件。耐熱微生物已成為國際研究的熱門領(lǐng)域，日本、美國和歐洲一些國家都啟動了耐熱微生物研究計劃。揭示高溫生命形式的奧秘和利用其特殊代謝機制與特殊產(chǎn)物方面的競爭已成為國際趨勢。人們對高溫生命形式奧秘的揭示，也有可能提供與全球氣候變暖進程相關(guān)的信息[4]?！厩叭搜芯窟M展】目前，世界上描述和報道的耐熱真菌有89種，它們分屬于真菌中的接合菌、子囊菌、擔(dān)子菌、半知菌[5-6]。而我國耐熱真菌研究比較薄弱?！吨袊婢倕R》中僅收集了此類真菌16種[7]，《中國菌種目錄》中記載了19種[8]，Chen & Zheng[9]報道中國耐熱真菌新種1個，張勇、梁茵等[10-12]報道中國耐熱真菌新記錄種10個。【本研究切入點】目前對耐熱真菌多樣性的研究較少。研究利用純培養(yǎng)方法對采自吐魯番地區(qū)的12個土樣進行耐熱真菌分離，18S rRNA基因序列同源性分析及產(chǎn)酶活性檢測?！緮M解決的關(guān)鍵問題】研究吐魯番地區(qū)耐熱真菌的資源及多樣性，為耐熱真菌資源的收集、保護、開發(fā)利用以及分類專著性研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 土壤樣品

從新疆吐魯番地區(qū)采集得到12份土壤樣品，采集后放入無菌50 mL 離心管內(nèi)，4℃冷藏備用。表1

表1 吐魯番土壤樣品采集基本情況

1.1.2 培養(yǎng)基

1.1.2.1 分離培養(yǎng)基

①PDA培養(yǎng)基(g/L)：馬鈴薯 200.0，葡萄糖 20.0，瓊脂 20.0，H2O 1 000 mL，pH 6.5。

②孟加拉紅培養(yǎng)基(Rose Bengal)(g/L)：蛋白胨5.0，葡萄糖10.0, KH2PO41.0，MgSO4·7H2O 0.5，孟加拉紅 0.033，氯霉素0.1，瓊脂20.0。

1.1.2.2 產(chǎn)酶篩選培養(yǎng)基

①淀粉酶篩選培養(yǎng)基(g/L)[13]：可溶性淀粉 20.0，KCl 0.5，NaNO32.0，K3PO41.0，MgSO4·7H2O 0.5，瓊脂 18.0，H2O 1 000 mL，pH 自然。

②纖維素酶篩選培養(yǎng)基(g/L)(參考文獻[14]并稍微改動)：CMC 0.8%，NaNO30.3%，KCl 0.05%，K2HPO40.1%，F(xiàn)eSO40.001%，MgSO4·7H2O 0.05%，瓊脂 2%，氯霉素 0.005%，H2O 1 000 mL，pH 6.0。

③蛋白酶篩選培養(yǎng)基(g/L)[15]：蛋白胨 10.0，葡萄糖 1.0，CaCl20.1，酪氨酸 0.1，酪素 5.0，瓊脂 22.0，H2O 1 000 mL，pH 7.0。

④木聚糖酶篩選培養(yǎng)基(g/L)[16]：木聚糖 1%，NaNO30.2%，KH2PO40.2%， K2HPO40.1%，NaCl 0.05%， MgSO4·7H2O 0.05%，瓊脂 2%，pH值自然。

⑤糖苷酶篩選培養(yǎng)基(g/L)[17]：乳糖10，NaNO33，K2HPO41， KCl 0.5， MgSO40.5，F(xiàn)eSO40.01，瓊脂 15，pH自然。

⑥脂肪酶篩選培養(yǎng)基(g/L)[18]：酵母膏 10，Na2HPO41g ，KH2PO41.5，Mg SO4·7H2O 0.5，(NH4)2SO45，NaCl20.5，三丁酸甘油酯乳化液，去氧膽酸鈉1，瓊脂 18。

1.1.3 主要儀器和設(shè)備

高速冷凍離心機，DYY-III型電泳儀、電泳槽(北京市六一儀器廠)，凝膠成像分析系統(tǒng)(Bio-Rad)，PCR擴增儀(Biometra TProfessional Trio)。

1.2 方 法

1.2.1 樣品處理

將采集的土樣、腐殖質(zhì)等各種樣品磨碎進行充分混合后，稱取10 g，加入盛有90 mL滅菌水的三角瓶中，將三角瓶置于搖床上150 r/m，振蕩2 h，使土壤顆粒均勻分散，備用。

1.2.2 菌株分離

采用平板涂布法對12份樣品進行分離，分別取200 μL土壤懸浮液涂布在分離培養(yǎng)基上，置于40℃培養(yǎng)3～8 d，將平板上生長的不同形態(tài)的菌落進行分離與純化。得到的純菌株切取小塊，轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基中，19℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d以上，生長菌株確定為耐熱真菌。4℃保藏備用。

1.2.3 菌株的分類鑒定

采用形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)相結(jié)合的方法進行初步鑒定。根據(jù)菌落特征、菌絲、孢子及產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)等進行形態(tài)學(xué)鑒定。挑取不同形態(tài)類群用真菌基因組提取試劑盒(OMEGA HP Fungal DNA Kit)提取基因組 DNA，PCR擴增 18S rDNA 基因片段，采用真菌通用引物：NS1(5'-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3')和 NS8(5'-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3')。PCR 反應(yīng)體積為30.0 μL 體系：2 × PCR Mix 試劑 15.0 μL(由TaKaRa公司提供)，引物NS1和NS8(由上海生工合成)各0.5 μL，模板 1.0 μL，用dd H2O使總體積達到30 μL。PCR擴增反應(yīng)條件: 94℃ 10 min；94℃ 30s、54℃ 30s、72℃ 2 min，37個循環(huán)；72℃ 10 min。凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，并送至上海生工生物工程有限公司測序。將所測序列提交Gen Bank數(shù)據(jù)庫并進行Blast檢索下載同源性較高的數(shù)據(jù)，用Clustal W對所得序列進行人工校正及比對分析，利用 Mega5.02生成Fasta格式的文件，按照鄰接法聚類(選擇bootstrap檢驗值≥50%，1 000次重復(fù))構(gòu)建 N-J系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 菌株產(chǎn)酶活性

將純化后的單菌落點接于上述的酶篩選培養(yǎng)基，40℃恒溫培養(yǎng)3～7 d。待菌株生長良好時，測量不同菌株的透明圈直徑和菌落直徑，以透明圈直徑與菌落直徑的差值(D) 表示酶活大小，D值越大，表明酶活越強。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐熱真菌的分離

利用2種分離培養(yǎng)基從吐魯番土壤樣品中得到129株耐熱真菌，共計20個形態(tài)類群。其中優(yōu)勢菌株是P5-3-5和P2-2-3，其分離頻率分別為24.81%和18.60% ，而分離頻率最低的菌株為M7-2-1、M6-2-7、MP13-3-1、M9-3-4、P9-2-6、P5-3-2，分離頻率均為0.78%。12個吐魯番土壤樣品分離得到真菌的比例依次是4.65%(6株)、14.73% (19株)、3.88% (5株)、10.85 % (14株)、21.71% ( 28株)、5.43% (7株)、8.53% (11株)、3.10% (4株)、20.16% (26株)、0.78 % (1株)、3.10 % (4株)、3.10% (4株)。其中，5號樣分離出的真菌數(shù)最多，10號樣分離出的真菌最少。圖1

A: 菌株P(guān)5-3-5; B: 菌株 M5-3-10; C: 菌株P(guān)3-2-2; D: 菌株M7-2-9; E: 菌株 P5-3-2

2.2 耐熱真菌的多樣性

將已純化的20株耐熱真菌各1株接種在PDA培養(yǎng)基上，觀察菌株的形態(tài)特征并進行18S rDNA序列分析，初步確定真菌的分類地位。結(jié)果表明，20株真菌分屬于3個綱。其中，糞殼菌綱(Sordariomycetes)包含6個形態(tài)類群，占30%，散囊菌綱(Eurotiomycetes) 12個，占60% ，座囊菌綱 (Dothideomycetes) 2個，占10%。這些菌株歸類于11個屬，其中，曲霉屬(Aspergillus)和裸胞殼屬(Emericella)為優(yōu)勢菌群，分別占總分離菌數(shù)的55.04%和30.23%；帚霉屬(Scopulariopsis)、樟絨枝霉(Malebranche) 均占2.33%；毛殼菌屬(Chaetomium)、嗜熱真菌屬(Thermomyces)、木霉屬(Trichoderma)、假霉樣真菌屬 (Pseudallescheria)、鏈格孢屬 (Alternaria)和小裸囊菌屬(Gymnascella)均占1.55%；青霉屬(Penicillium)占0.78%。表2

表2 20株耐熱真菌的形態(tài)特征及分類學(xué)地位

通過PCR擴增18S rDNA 基因片段，對所測序列用ClustalW 比對后構(gòu)建鄰接(N-J)樹。分離到的耐熱真菌明顯分為三大類，分別為散囊菌綱、座囊菌綱、糞殼菌綱。20個形態(tài)類群隸屬于5個目8個科11個屬。圖2

2.3 培養(yǎng)基分離效果比較

研究表明，孟加拉紅培養(yǎng)基共分離到88株耐熱真菌，分布在10個屬，共計18個形態(tài)類群；PDA培養(yǎng)基分離到41株菌，分布在4個屬，共計10個形態(tài)類群。由此可看出，孟加拉紅培養(yǎng)基分離得到的耐熱真菌菌株和形態(tài)類群最多，分離效果最好。表3

表3 2種培養(yǎng)基分離的耐熱真菌菌株數(shù)及種屬分布

圖2 基于18S rDNA序列采用N-J法構(gòu)建的耐熱真菌系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 菌株產(chǎn)酶活性研究

對129株菌進行產(chǎn)酶活性初篩。研究表明，產(chǎn)酶菌株共有24株。13株產(chǎn)糖苷酶，13株產(chǎn)淀粉酶，11株產(chǎn)維素酶，16株產(chǎn)木聚糖酶，9株產(chǎn)蛋白酶，11株產(chǎn)脂肪酶，16株產(chǎn)木聚糖酶。其中，菌株M9-2-5、P7-2-1可產(chǎn)5種酶。菌株M9-2-1產(chǎn)纖維素酶和木聚糖酶的活性相對較高；菌株M7-2-4具有較高的淀粉酶活性；菌株 M9-2-9具有較高的淀粉酶活性和蛋白酶活性；脂肪酶活性普遍較低，其水解圈直徑都在0～5 mm。表4

表4 新疆吐魯番地區(qū)耐熱真菌產(chǎn)酶特性

注：“ + + + + + ”表示透明圈D值為20～25 mm；“ + + + + ”表示D值為15～20 mm；“ + + + ”表示D值為10～15 mm；“ + +”表示D值為5～10 mm；“ +”表示D值為0～5 mm；“-”表示不產(chǎn)生透明圈。其中糖苷酶篩選中“+”表示結(jié)果為陽性，“-”為陰性

Note:“ + + + + + ”: 20-25 mm; “ + + + + ”: 15-20 mm; “ + + +”: 10-15 mm;“ + +”: 5-10 mm;“ + ”: 0-5 mm;“-”: No transparent circle．Glycosidase: “-” :negative; “ + ”:positive

3 討 論

高溫真菌是微生物中重要的一個類群，在有機物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化和物質(zhì)循環(huán)中的作用是難以估量的。近年來中國微生物學(xué)者開展了高溫真菌的分類研究。趙春青[19]利用PDA及其他4種分離培養(yǎng)基從400多份樣品中分離出嗜熱真菌17種，耐熱真菌4種。張勇[20]利用PDA培養(yǎng)基從800多份樣品中分離出耐熱真菌25屬51種。研究從新疆吐魯番地區(qū)采集的12份土壤樣品中分離得到129株耐熱真菌，共20個形態(tài)類群。其中孟加拉紅培養(yǎng)基分離出88株耐熱真菌(分布在10個屬)，表明孟加拉紅培養(yǎng)基也適合于高溫真菌的分離，且分離效果良好。經(jīng)形態(tài)學(xué)研究和18S rDNA序列分析分析表明，吐魯番地區(qū)土壤樣品中的耐熱真菌物種多樣性較為豐富，歸類于11個屬，曲霉屬(Aspergillus)和裸胞殼屬(Emericella)為優(yōu)勢菌群，分別占55.04%和30.23%，但有些種屬在中國耐熱真菌中未見報道，Malbranchea、Alternaria兩個屬的菌株在國內(nèi)首次報道為耐熱真菌，菌株M9-3-4、P9-2-6、M7-2-9可能為潛在的中國新記錄種。這些發(fā)現(xiàn)豐富了我國耐熱真菌多樣性的內(nèi)容，值得進行更深入的研究。

高溫真菌所產(chǎn)生的熱穩(wěn)定、高活性酶及其他代謝產(chǎn)物都很有實用價值。傅力等[21]選育出高產(chǎn)蛋白酶的米曲霉AspergillusOryzae突變菌株UF366, 在pH 7.2、40℃時其蛋白酶活力最高，是一株有應(yīng)用前景的醬油生產(chǎn)菌株。周亞飛等[22]分離到耐酸(最適pH為4.5)和耐高溫 (最高達60℃)的具有降解棉秸稈纖維素功能的真菌菌株Z2，該菌株在秸稈生物質(zhì)利用方面有很大的應(yīng)用潛力。Peixoto等[23]從分離自土壤的小孢根霉須狀變種Rhizopusmicrosporusvar.rhizopodiformis中分離到熱穩(wěn)定性的淀粉酶，該酶在45℃下表現(xiàn)出高活性。Kitpreechavanich等[24]分離到米根霉Rhizopusoryzae，其產(chǎn)生的葡糖糖化酶可將淀粉降解為L-乳酸，且在40℃具有高活性，適合工業(yè)上生產(chǎn)乳酸。研究中功能酶篩選結(jié)果表明，產(chǎn)酶菌株共有24株。13株產(chǎn)糖苷酶，13株產(chǎn)淀粉酶，11株產(chǎn)纖維素酶，16株產(chǎn)木聚糖酶，9株產(chǎn)蛋白酶，11株產(chǎn)脂肪酶，16株產(chǎn)木聚糖酶，部分菌株可產(chǎn)多種酶活。其中，菌株M9-2-5、P7-2-1可產(chǎn)5種酶。極個別菌株具有較強的酶活。這些菌株為進一步開發(fā)和利用功能酶提供了良好的研究材料，有待進一步的開發(fā)和挖掘。

4 結(jié) 論

從新疆吐魯番地區(qū)采集12份土壤樣品，分離鑒定耐熱真菌11屬20種。其中曲霉屬(Aspergillus)和裸胞殼屬(Emericella)為優(yōu)勢菌群，分別占總分離菌數(shù)的55.04%和30.23%，少數(shù)菌株具有產(chǎn)高溫條件下熱穩(wěn)定、高活性酶的潛力，新疆吐魯番地區(qū)耐熱真菌資源豐富，產(chǎn)酶種類多樣，為開發(fā)利用這一類群真菌資源奠定了基礎(chǔ)。

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Fund project:Supported by the Special Funds for key laboratory of the Xinjiang Uygur Autonomous Region "Biodiversity and enzyme screening of thermotolerant fungi from Xinjiang special environment" )(2014KL003) ； The National Natural Science Foundation of China "Study on Xinjiang metagenomic library construction of rumen microbes in Bactrian camel and cellulase system" (31160027)

Thermotolerant Fungi Diversity and Enzyme Activities in Turpan Prefecture, Xinjiang

YIN Ya-lan1,2, CHANG Wei2, ZHANG Tao2, LIN Qing2, CHAO Qun-fang1,LI Chun3, HUO Xiang-dong2

(1. College of Life Science and Technology, Xinjiang University, Urumqi 830046, China;2.ResearchInstituteofMicrobiology,XinjiangAcademyofAgriculturalSciences,Urumqi830091,China;3.SchoolofLifeScienceandTechnology,BeijingInstituteofTechnology,Beijing100081,China)

【Objective】 This research aims to study species diversity and enzyme activities of the thermotolerant fungi isolated from Turpan area of Xinjiang.【Method】Total 12 soil samples were collected from Turpan areaof Xinjiang. Thermotolerant fungi were isolated using dilution-plate method. The diversity was analyzed based on morphology and 18S rDNA sequences. Enzyme activities were detected using six special selective media.【Result】A totals of 129 strains of thermotolerant fungi were isolated. The analysis of morphology and 18S rDNA sequence showed that these strains were distributed within 11 described genera, of whichAspergillussp. andEmericellasp．were the dominant populations. Studies on enzyme activities of the isolated strains showed that 13 strains produced glycosidase, 13 strains produced amylase, 11 strains produced cellulose, 16 strains produced xylanase, 8 strains produced protease, 10 strains produced lipase, 16 strains produced xylanase.【Conclusion】The thermotolerant fungi were abundant in soils in Turpan area of Xinjiang and can produce various enzymes. This research has laid the foundation for the development and utilization of this fungus resource.

thermotolerant fungi; diversity; enzyme activities

10.6048/j.issn.1001-4330.2016.07.016

2016-02-04

新疆維吾爾自治區(qū)重點實驗室專項資金資助項目“新疆特殊環(huán)境耐熱真菌多樣性及其功能酶篩選”(2014KL003) ；國家自然科學(xué)基金項目“新疆雙峰駝瘤胃微生物宏基因組文庫構(gòu)建和纖維素酶系的研究”(31160027)

殷亞蘭(1989-)，女，河南人，碩士研究生，研究方向為環(huán)境與資源微生物，(E-mail) yinyalan6807@163.com

霍向東(1974-)，男，甘肅人，副研究員，研究方向為微生物資源，(E-mail)xiangdonghuo@163.com

S182

A

1001-4330(2016)07-1288-09