魏然，郭慶元，白劍宇， 張山河

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，烏魯木齊 830052)

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苜蓿根腐病多種病原菌的分子檢測

魏然，郭慶元，白劍宇， 張山河

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，烏魯木齊 830052)

【目的】研究苜蓿根腐病病原菌種類和各種病原菌在病株中的出現(xiàn)頻率，以及單一病株受到多種病原菌復(fù)合侵染的情況，并為該病復(fù)合侵染規(guī)律及防治奠定基礎(chǔ)?！痉椒ā坷靡褕蟮赖?種病原菌的7對特異性引物，分別對新疆北疆主要苜蓿種植區(qū)采集的根腐病混合病樣，及單一重病田分單株采集的根腐病病樣進行PCR檢測?！窘Y(jié)果】新疆北疆主要苜蓿種植區(qū)根腐病病樣中可檢出的根腐病病原種類主要有5種鐮刀菌和1種絲核菌；其中，立枯絲核菌、木賊鐮刀菌、銳頂鐮刀菌、茄腐鐮刀菌、尖孢鐮刀菌5種病原菌在病株樣品中普遍存在，是新疆北疆部分地區(qū)苜蓿根腐的主要病原菌；侵染根部的病原菌中以尖孢鐮刀菌、銳頂鐮刀菌和立枯絲核菌為優(yōu)勢種群，侵染莖基部病原菌中以茄腐鐮刀菌和木賊鐮刀菌為優(yōu)勢種群。檢測結(jié)果還表明苜蓿根腐病病樣中兩種及兩種以上病原菌復(fù)合侵染的的比率達到83%?！窘Y(jié)論】木賊鐮刀菌、銳頂鐮刀菌、茄腐鐮刀菌、尖孢鐮刀菌和立枯絲核菌是新疆北疆部分地區(qū)苜蓿根腐病的主要病原菌，擬知孢鐮刀菌是出現(xiàn)頻率較低的次要病原菌；根部病斑與莖基部病斑中優(yōu)勢病原菌種類有所不同；田間病株中多病原復(fù)合侵染的情況非常普遍。

苜蓿；根腐??；鐮刀菌；立枯絲核菌；PCR檢測

0 引 言

【研究意義】苜蓿是世界上種植面積最廣、最重要的一種多年生豆科牧草。隨著苜蓿種植面積的進一步擴大及管理和收割方式的改變，病害問題已經(jīng)極大的限制了苜蓿的生產(chǎn)[1]。我國苜蓿主要產(chǎn)區(qū)西北、東北和華北都存在較嚴(yán)重的苜蓿病害。據(jù)不完全統(tǒng)計，全國的苜蓿病害大約有90種，新疆苜蓿病害大約有25種[2]。其中，根腐病是一種常年發(fā)生，年年累積且很難防控的嚴(yán)重病害，尤其在5年生以上的苜蓿田中發(fā)生嚴(yán)重，甚至不得不毀田改種。根據(jù)已有的經(jīng)驗和研究觀察與調(diào)查，種植密度大、整地不平、積水及收割機的碾壓是根腐病發(fā)生的重要原因。苜蓿在大田生產(chǎn)中一次種植可多年利用，但由于其利用年限較長，根腐病己成為引起苜蓿產(chǎn)量下降和植株衰敗的一個極其重要的原因[3-4]。因此，苜蓿根腐病的研究對苜蓿產(chǎn)業(yè)的開發(fā)和生態(tài)環(huán)境的建設(shè)具有重大意義。【前人研究進展】南志標(biāo)等[3](1991)對新疆阿勒泰紫花苜蓿種植區(qū)的苜蓿根部病害進行了調(diào)査，結(jié)果表明了苜蓿的根莖和根腐綜合癥發(fā)生頻率很高，幾乎年年均有發(fā)生。據(jù)陳耀等[5]報道，苜蓿根腐病不僅降低了苜蓿的產(chǎn)量和品質(zhì),甚至使其喪失了加工利用的價值[5-6]。趙宗峰等[7]對新疆呼圖壁縣種用苜蓿根部病害進行了調(diào)查、對相關(guān)致病菌進行了分離和致病性鑒定，查明了種用苜蓿的真菌病害病原種類；并對種用苜蓿根腐病病原菌進行了形態(tài)鑒定和分子鑒定，初步明確了新疆部分地區(qū)苜蓿根腐病的病原菌種類?！颈狙芯壳腥朦c】目前針對蓿根腐病的病原、危害性及苜蓿的品種抗性評價和抗性利用的研究較多，而針對該病的多病原復(fù)合侵染規(guī)律的研究鮮有報道。研究利用已報道的新疆苜蓿根腐病7種病原菌的七對特異性引物[7]對所采集的多病田混合樣品和單一重病田分株采集的30份樣品(15份根部，15份莖基部)進行PCR檢測?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過分子檢測的方法進一步明確新疆部分地區(qū)苜蓿根腐病的主要病原種類、優(yōu)勢致病種群，并分析苜蓿根腐病多病原復(fù)合侵染情況，為該病復(fù)合侵染規(guī)律、防治研究及有效防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試菌株

供試單孢菌株由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理實驗室提供，包括立枯絲核菌(RhizoctoniasolaniKuhn)、燕麥鐮刀菌(Fusariumavenaceum(Corda&Fr.)Sacc)、木賊鐮刀菌(Fusariumequiseti(Corda)Sacc.)、銳頂鐮刀菌(FusariumacuminatumElls&Everhart.)、茄腐鐮刀菌(Fusariumsolani(Mart.)Sacc.)、尖孢鐮刀菌(FusariumoxysporumSchlecht.)和擬知孢鐮刀菌(FusariumsporotrichioidesSherb.) 的7種菌株；這些菌株均為趙宗峰等[7]經(jīng)病株分離、單孢純化、致病性回接以及形態(tài)鑒定和分子鑒定，確定為苜蓿根腐病病原菌的菌株；研究中，對這些保存菌株進行活化和進一步的純化后，從各種病原菌菌株中挑選出2個菌株作為檢測體系驗證過程中的供試菌及檢測過程中的陽性菌株。

1.1.2 供試樣品

2014年10月，于昌吉、呼圖壁及三坪農(nóng)場等10余塊紫花苜蓿根腐病普通發(fā)病田，隨機采集的根腐病病株樣品，因病斑較小，經(jīng)病斑刮取制成的根部混合病樣和莖基部混合病樣；以及2015年5月，在新疆呼圖壁縣紫花苜蓿單一重病田，分株采集的根部病樣和莖基部病樣品各15份。各樣品經(jīng)干燥、碾碎后裝入1.5 mL離心管中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 供試培養(yǎng)基

WA培養(yǎng)基用于立枯絲核菌的純化；PDA培養(yǎng)基用于鐮刀菌的純化及各菌株的擴繁。

1.1.4 主要試劑與設(shè)備

1.1.4.1 試劑

植物基因組DNA提取試劑盒由天根生物科技有限公司提供；特異性引物：選用趙宗峰等[7]的報道的新疆根腐病的7種主要病病菌的特異性引物(RSF/RSR、FAF/FAR、FEF/FER、FACF/FACR、FSF/FSR、FOF/FOR、FSPF/FSPR)，并由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成提供。表1

1.1.4.2 設(shè)備

PCR擴增儀(VERITI2.0)，高速冷凍離心機(AIIegra 25R)，電泳儀(HE99)，凝膠成像系統(tǒng)(G:BOXEF)，紫外透射儀(WD-9403C)。

表1 立枯絲核菌及各種鐮刀菌特異性檢測引物[7]

1.2 方 法

1.2.1 DNA提取

菌株DNA及病株樣品的DNA提取均參照植物總DNA提取試劑盒上的操作說明進行。

1.2.2 PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化及靈敏度檢測

參考趙宗峰等[7]報道的PCR反應(yīng)體系，利用梯度 PCR 優(yōu)化退火溫度。然后用特異性引物對0.5、1、2、5和10 ng/μL的苜蓿根腐病菌DNA進行PCR，以確定其檢測靈敏度。

1.2.3 苜蓿根腐病田間樣品檢測

利用表1中的7對特異引物及優(yōu)化后的檢測體系對多地隨機采集的苜蓿根腐病根部和莖基部混合病樣及單一重病田分株采集的30份苜蓿根腐病病樣進行檢測，記錄檢測結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化及檢測體系的建立

研究表明，在選用的供試引物及所用PCR反應(yīng)體系下，立枯絲核菌特異性擴增的最佳退火溫度為59℃，尖孢鐮刀菌特異性擴增的最佳退火溫度為54℃，茄腐鐮刀菌特異性擴增的最佳退火溫度為58℃，燕麥鐮刀菌特異性擴增的最佳退火溫度為58℃，擬知孢鐮刀菌特異性擴增的最佳退火溫度為51℃，木賊鐮刀菌特異性擴增的最佳退火溫度為54℃，銳頂鐮刀菌特異性擴增的最佳退火溫度為52℃。

當(dāng)DNA 模板為0.5 ng/μL以上時，均可以擴增出穩(wěn)定的特異性條帶，說明該反應(yīng)體系下檢測靈敏度等于或小于0.5 ng/μL。其靈敏度較高,且不受寄主 DNA 的干擾, 可用于根腐病菌的分子檢測。

由此確定特異性引物 PCR 擴增的最佳反應(yīng)體系為：總體積為25 μL，含MgCl2的10×PCR Buffer 2.5 μL,dNTPs1.0 μL，10 μM上游引物1.0 μL，10 μM下游引物1.0 μL，TaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.2 μL,ddH2O 18.0 μL。；反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性3 min，94℃變性40 s，退火溫度51～59℃(因特異性引物不同而不同),退火30 s，72℃延伸40 s，32個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存?zhèn)溆?。在這一反應(yīng)體系下，各菌株均能擴增出明顯的穩(wěn)定的清晰條帶。并以此體系作為病樣的檢測體系。圖1

M:100 bp ladder maker；1～2：立枯絲核菌；3～4：木賊鐮刀菌；5～6：燕麥鐮刀菌；7～8：尖孢鐮刀菌；9～10：茄腐鐮刀菌；11～12：銳頂鐮刀菌；13～14：擬知孢鐮刀菌

M:100bp ladder maker； 1-2:R.solani、3-4:F.equiseti、5-6:F.avenaceum、7-8:F.oxysporum、9-10:F.solani、11-12:F.acuminatum、13-14:F.sporotrichoides

圖1 7種病原菌在擴增條件優(yōu)化后的PCR擴增條帶

Fig.1 PCR amplification bands of seven species pathogenic fungus after amplification conditions optimized

2.2 混合樣品中的病原菌種類

采用經(jīng)優(yōu)化的PCR反應(yīng)體系作為對病樣的檢測體系，用7對特異性引物(RSF/RSR、FAF/FAR、FEF/FER、FACF/FACR、FSF/FSR、FOF/FOR、FSPF/FSPR)對采自北疆部分地區(qū)的苜蓿根腐病普通過發(fā)病田的根部和莖基部混合樣品進行的分子檢測結(jié)果顯示：苜蓿根部樣中有茄腐鐮刀菌F.solani、銳頂鐮刀菌F.acuminatum、尖孢鐮刀菌F.oxysporum的清晰條帶；苜蓿莖基部病樣中有立枯絲核菌R.solani、銳頂鐮刀菌F.acuminatum、尖孢鐮刀菌F.oxysporum、木賊鐮刀菌的清晰條帶。圖2

立枯絲核菌、茄腐鐮刀菌、銳頂鐮刀菌、尖孢鐮刀菌和木賊鐮刀菌這5種致病菌普遍存在于北疆部分地區(qū)的苜蓿根腐病根部或莖基部中，是北疆部分地區(qū)的苜蓿根腐病的主要病原菌，而燕麥鐮刀菌和擬枝孢鐮刀菌在混合樣中未檢測到其存在，可能與其致病性較弱有關(guān)，在自然條件下主要以次生感染參與到多病原復(fù)合侵染中，因而在普通發(fā)病田中的小病斑病樣中存在的幾率和菌量較小，不易檢測到。

A莖基部混合樣品中的特異性條帶; B根部混合樣品中的特異性條帶；1～7：分別為樣品中的立枯絲核菌、茄腐鐮刀菌、銳頂鐮刀菌、燕麥鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、木賊鐮刀菌和擬知孢鐮刀菌檢測結(jié)果

A：Specific bands in mixed samples from basal Stem ofAlfalfaroot rot B：Specific bands in mixed samples from roots ofalfalfaroot rot, M:100 bp ladder maker；M:100 bp ladder maker；lane1-7: Respectively, the detection results ofR.solani、F.solani、F.acuminatum、F.avenaceum、F.oxysporum、F.equiseti、F.sporotrichoides

圖2 苜蓿根腐病根部混合樣品和莖基部混合樣品中的致病菌特異性條帶

Fig.2 The specific bands of pathogenic fungus in the mixed samples from root and the mixed samples from stem base of Alfalfa root rot

2.3 重病田30份單株病樣中的致病菌種類、優(yōu)勢種群及復(fù)合侵染

分別利用7對特異性引物(RSF/RSR、FAF/FAR、FEF/FER、FACF/FACR、FSF/FSR、FOF/FOR、FSPF/FSPR)對采自重病田的30份苜蓿根腐病根部病樣莖基部病樣進行特異性引物PCR檢測。研究表明，在根部病樣和莖基部病樣中均檢測到除燕麥鐮刀菌F.avenaceum外的6種病原菌的特異性條帶，這些檢測到的病原菌分別為立枯絲核菌R.solani、木賊鐮刀菌F.equiseti、銳頂鐮刀菌F.acuminatum、茄腐鐮刀菌F.solani、尖孢鐮刀菌F.oxysporum和擬知孢鐮刀菌F.sporotrichoides；在30份病樣中各種病原菌的檢出株數(shù)及檢出株率分別為：立枯絲核菌16份(53%)、木賊鐮刀菌17份(57%)、銳頂鐮刀菌15份(50%)、茄腐鐮刀菌18份(60%)、尖孢鐮刀菌18份(60%)、擬知孢鐮刀菌8份(27%)；在15份根部病樣中各種病原菌的檢出株數(shù)及檢出株率分別為：立枯絲核菌8份(53%)、木賊鐮刀菌7份(47%)、銳頂鐮刀菌8份(53%)、茄腐鐮刀菌7份(47%)、尖孢鐮刀菌10份(67%)、擬知孢鐮刀菌5份(33%)；在15份莖基部病樣中各種病原菌的檢出株數(shù)及檢出株率分別為立枯絲核菌8份(53%)、木賊鐮刀菌10份(67%)、銳頂鐮刀菌7份(47%)茄腐鐮刀菌11份(73%)、尖孢鐮刀菌8份(53%)、擬知孢鐮刀菌3份(20%)；其中，立枯絲核菌R.solani、木賊鐮刀菌F.equiseti、銳頂鐮刀菌F.acuminatum、茄腐鐮刀菌F.solani、尖孢鐮刀菌F.oxysporum5種病原菌在根部病樣及莖基部病樣中均有較高的檢出率(47%～73%)，再次說明這5種病原菌普遍存在于苜蓿根腐病病株當(dāng)中，是苜蓿根腐病的主要病原菌，其中又以茄腐鐮刀菌F.solani、尖孢鐮刀菌F.oxysporum在30份病樣中檢出率最高(60%)，為苜蓿根腐病的優(yōu)勢病原菌種群；而擬知孢鐮刀菌F.sporotrichoides的檢出率較低(20%～33%)，燕麥鐮刀菌F.avenaceum的檢出率為0%，說明這兩種病原菌在田間病株只有少量感染或極少量感染，是7種病原菌中的弱勢種群。此外，比較根部病樣和莖基部病樣的檢出結(jié)果可以看出，根部病樣和莖基部病樣中優(yōu)勢病原菌種群有所不同，根部病樣中以尖孢鐮刀菌F.oxysporum、銳頂鐮刀菌F.acuminatum和立枯絲核菌R.solani為優(yōu)勢種群，莖基部病樣中以茄腐鐮刀菌F.solani和木賊鐮刀菌F.equiseti為優(yōu)勢種群。

再從單株病樣中檢出的病原菌種類可以看出，無論在根部病樣還是在莖基部病樣中兩種以上的病原菌復(fù)合侵染單一植株，并引起根部病斑或莖基部病斑的情況非常普遍；在30份病樣中，2種及2種以上的病原菌復(fù)合侵染的比率約為83%，3種及3種以上的病原菌復(fù)合侵染的比率約為67%，4種及4種以上的病原菌復(fù)合侵染的比率約為47%，5種病原菌復(fù)合感染的比率為23%。表2～3，圖3～4

表2 新疆呼圖壁縣苜蓿根腐病根部病樣檢測結(jié)果

注：“+”表示檢測出該菌；“-”表示未檢出該菌，下同

Note: “+”shows that the Pathogen is detected， “-”shows that the Pathogen is not detected, the same as below

表3 新疆呼圖壁縣苜蓿根腐病莖基部病樣檢測結(jié)果

A～F：分別為莖基部樣品中的立枯絲核菌、木賊鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、茄腐鐮刀菌、銳頂鐮刀菌和擬知孢鐮刀菌特異性條帶；M:100 bp ladder maker；1:陽性對照，2～16:莖基部樣品

A-F: Respectively,the specificity bands ofR.solani、F.equiseti、F.oxysporum、F.solani、F.acuminatum、F.sporotrichoidesinsamples from basal stem; M:100 bp ladder maker；lane1positive control lane 2-16:Stem base samples 2-16 specific bands

圖3 莖基部病樣中病原菌特異性條帶

Fig.3 The specificity bands of pathogenic fungus in samples from basal stem

A～F：分別為根部樣品中的立枯絲核菌，木賊鐮刀菌，尖孢鐮刀菌，茄腐鐮刀菌，銳頂鐮刀菌和擬知孢鐮刀菌特異性條帶)；M:100 bp ladder maker；1:陽性對照，2～16:莖基部樣品

A-F: Respectively, the specificity bands ofR.solani、F.equiseti、F.oxysporum、F.solani、F.acuminatum、F.sporotrichoidesin samples from root; M:100 bp ladder maker；lane1positive control lane 2-16:Stem base samples 2-16 specific bands

圖4 田間根部病樣中病原菌特異性條帶

Fig.4 The specificity bands of pathogenic fungus in samples from root

3 討 論

基于特異性引物PCR進行病原菌分子檢測技術(shù)已經(jīng)比較成熟，研究檢測結(jié)果表明，通過特異性引物的PCR擴增可以準(zhǔn)確地檢測出引起苜蓿根腐病的多種致病菌，并由此分析其病原菌種類及優(yōu)勢致病種群，從而為該病的有效防控提供依據(jù)。研究以分子檢測手段較好地證實了趙宗峰等[7]關(guān)于新疆苜蓿根腐病病原種類的研究結(jié)果，但研究局限于已報道的新疆苜蓿根腐病的7種病原菌，對更多和種病菌復(fù)合侵染的可能性還在進一步研究中，且在研究中，始終未檢測到趙宗峰[7]報道的7種病原菌之一的燕麥鐮刀菌，這一差異是否與采樣地點不同、前作不同，或與其真實的致病性有關(guān)值得進一步研究。

苜蓿根腐病確為多病原復(fù)合侵染引起的病害，在田間受多病原復(fù)合侵染的情況非常普遍，因而應(yīng)該加強苜蓿根腐病的田間監(jiān)測和引種檢驗工作。

利用特異性引物分子檢測手段來監(jiān)測復(fù)合侵染病害的病原種類及優(yōu)勢致病種群的可能性。如能對復(fù)合侵染病害的各病原菌進行動態(tài)的檢測，可更好地分析這些病害的復(fù)合侵染規(guī)律，分析其先導(dǎo)因素，主導(dǎo)因素，從而為該類病害的高效防控提供更好的防控方法及防控切入點。

4 結(jié) 論

利用特異性引物分子檢測方法從新疆北疆部分地區(qū)苜蓿根腐病病樣中，至少可檢測出5種鐮刀菌(木賊鐮刀菌F.equiseti、銳頂鐮刀菌F.acuminatum、茄腐鐮刀菌F.solani、尖孢鐮刀菌F.oxysporum、擬知孢鐮刀菌F.sporotrichoides)和1種絲核菌(立枯絲核菌R.solani)；其中，立枯絲核菌 R. solani、木賊鐮刀菌F.equiseti、銳頂鐮刀菌F.acuminatum、茄腐鐮刀菌F.solani、尖孢鐮刀菌F.oxysporum5種病原菌在病株樣品普遍存在，是新疆北疆部分地區(qū)苜蓿根腐的主要病原菌；侵染根部的病原菌中以尖孢鐮刀菌F.oxysporum、銳頂鐮刀菌F.acuminatum和立枯絲核菌R.solani為優(yōu)勢種群，侵染莖基部病原菌中以茄腐鐮刀菌F.solani和木賊鐮刀菌F.equiseti為優(yōu)勢種群。苜蓿根腐病中多病原菌復(fù)合侵染的情況非常普遍。

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Fund project:Doctoral Fund Project of Ministry of Education, P. R. China. "Research on the molecular detection of the main pathogens of alfalfa root rot in Xinjiang "

Molecular Detection of Various Pathogens of Alfalfa Root Rot

WEI Ran, GUO Qing-yuan, BAI Jian-yu, ZHANG Shan-he

(College of Agronomy，Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830052，China)

【Objective】 This paper attempts to identify the pathologic species of the alfalfa root rot, the occurrence frequency of various pathogens in the infected plants, status of the compound infection of pathogenic bacteria by multiple pathogens in the single infected plant in order to lay the foundation for research on the infection regularity and prevention of the alfalfa root rot.【Method】The 7 pairs of specific-primer of the 7 species of reported pathogens were made use of to carry out PCR detection of the mixed disease samples of the root rot collected from the main planting areas in Northern Xinjiang and so did root rot samples as individual plant collected from the single heavily infected field.【Result】The results showed that the pathogenic species could be detected from the disease sample from the main planting areas of Norther Xinjiang including 5 species ofFusariumand 1 species ofRhizoctonia; Among which,Rhizoctoniasolani,Fusariumequiseti,Fusariumacuminatum,FusariumsolaniandFusariumoxysporumwere prevalent in the infected plants; which were the main pathogens of the alfalfa root rot in Northern Xinjiang; For the pathogens in the infected root, the dominant species wereFusariumoxysporum,FusariumacuminatumandRhizoctoniasolani; For the pathogens in the infected basal stem, the dominant species wereFusariumsolaniandFusariumequiseti. The detected results also showed that the mixed infected ratio of 2 species and above pathogens is up to 83%, among the disease samples of alfalfa root rot.【Conclusion】Thus it can be seen that theFusariumequiseti,Fusariumacuminatum,Fusariumsolani,FusariumoxysporumandRhizoctoniasolaniare the main pathogens of alfalfa root rot in the Norther Xinjiang region, from which we can infer thatFusariumoxyspariumis a secondary pathogen which has a low occurrence frequency; dominant pathogenic population differs in the disease spot of the root and the basal stem; the status of the mixed infection of various pathogens is very common for the diseased plant in the field.

alfalfa; root rot;Fusarium;Rhizoctoniasolani; PCR

10.6048/j.issn.1001-4330.2016.07.013

2016-02-20

教育部博士點基金項目“新疆苜蓿根腐病主要病原菌的分子檢測技術(shù)研究”

魏然(1992-)，女，河南商丘人，碩士研究生，研究方向為植物病害檢測

郭慶元(1962-)，男，四川雅洪人，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向為植物病理學(xué)， (E-mail)guoqingyuan3009@sina.com

S435.4

A

1001-4330(2016)07-1268-08