張建友，費驍文，劉建華，丁玉庭

(浙江工業(yè)大學海洋學院，浙江 杭州，310014)

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魚油精制過程中鄰苯二甲酸酯類化合物分析及變化規(guī)律

張建友，費驍文，劉建華，丁玉庭*

(浙江工業(yè)大學海洋學院，浙江 杭州，310014)

建立了氣相色譜-質(zhì)譜法檢測魚油樣品中的鄰苯二甲酸酯類化合物(phthalate acid esters，PAEs)的方法，并研究PAEs在魚油精煉過程中的變化規(guī)律。研究表明，16種PAEs標準物質(zhì)在20min內(nèi)實現(xiàn)有效分離，在0.05～1.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)出良好的線性關系 (R2>0.998 3)，加標實驗回收率為82.1%～107.4%，相對標準偏差(RSD)為0.8%～12.9%，檢出限為0.08～0.30 mg/kg。同時，毛油中3種塑化劑( DIBP，DBP和DEHP )含量分別為0.06、0.05和0.04 mg/kg，且隨著精煉工藝的進行呈上升趨勢，成品油中的含量分別為0.19、0.24和0.06 mg/kg。精煉工藝中所使用的化學助劑是造成魚油中3種塑化劑含量增加的主要因素。

魚油；鄰苯二甲酸酯；氣相色譜-質(zhì)譜法

鄰苯二甲酸酯類化合物[1](phthalate acid esters，PAEs)，俗名塑化劑，廣泛應用于工業(yè)生產(chǎn)中用來改善塑料制品的柔韌性，耐久性和延展性。這類物質(zhì)揮發(fā)性低，難溶于水，易溶于有機溶劑并且不易降解，會造成內(nèi)分泌失調(diào)，阻礙生物體生殖機能，還會引發(fā)惡性腫瘤。

PAEs進入人體的途徑[2]多種多樣，比如環(huán)境污染，食品包裝材料，食物等，其中食物是PAEs危害人體的主要途徑，特別是水產(chǎn)品，如魚類、貝類。世界各國都極其重視塑化劑的污染問題，并立法限制其使用。歐洲食品安全局已明確制定了幾種PAEs的每天可攝入量，分別為DBP(0.01 μg/kg，以體重計，下同)、BBP(0.5 μg/kg)、DEHP(0.01 μg/kg)、DIDP(0.15 μg/kg)、DOP(0.15 μg/kg)[3]。此外，我國也制定了一系列的政策、法規(guī)以限制鄰苯二甲酸酯的使用[4]。

由于實際樣品中PAEs含量較低，加之檢測樣品基質(zhì)的復雜性，因此在檢測前往往需要進行前處理工作以富集目標物質(zhì)和排除不必要的干擾。前處理的方法有很多，如固相萃取[5](SPE)，固相微萃取[6](SPME),液相萃取[7](LPE)等。而PAEs分析檢測技術[8]從早期的滴定法，比色法和分光光度法發(fā)展到后來的氣相色譜、高效液相色譜(HPLC)[9]、氣相-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)[10]和液相-質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS)法，GC-MS是目前測定PAEs廣泛使用的一種方法。

魚油是魚類脂肪酸的總稱，不同魚種的脂肪酸種類和含量不盡相同，其中最具代表性的是二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，EPA)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)。

隨著PAEs的大量使用，人類活動排入環(huán)境的PAEs的量遠超過環(huán)境的承載能力，使得在各種環(huán)境介質(zhì)中都存在該類物質(zhì)，包括水體。魚油作為一種重要的海洋資源，其安全問題不容忽視。本實驗利用氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)測定魚油中的PAEs，研究其在精煉過程中的變化規(guī)律，借此為提升魚油精煉工藝的安全性提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(7890A-5975C)，美國Agilent公司；BS-223S型精密電子天平,北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海亞榮生化儀器廠；CR21GII高速冷凍離心機,Hitachi Kokico，日本；LNG-NF-101實驗室膜分離設備,上海朗極膜分離設備工程有限公司；納濾膜(LNGTM NS036 截留分子量360)。

二氯甲烷(色譜純)，Aladdin；正己烷(色譜純)，Sigma；弗羅里硅土(100～200目)，使用前在馬弗爐600 ℃加熱4 h；無水Na2SO4，優(yōu)級純，依次用正己烷和二氯甲烷淋洗2次，每次使用的溶劑體積約為無水Na2SO4體積的2倍。淋洗后轉(zhuǎn)移至燒瓶，在50 ℃烘干，然后在225 ℃烘烤4 h，冷卻后干燥器中保存。

鄰苯二甲酸酯標準品：鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)，99.0%；鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)，99.0%；鄰苯二甲酸二異丁酯 (DIBP)， 99.0%；鄰苯二甲酸二丁酯 (DBP)， 99.0%；鄰苯二甲酸二( 2-甲氧基) 乙酯 (DMEP)， 98.0%；鄰苯二甲酸二(4-甲基-2戊基)酯(BMPP)，99.3%；鄰苯二甲酸二( 2-乙氧基)乙酯(DEEP)，99.5%；鄰苯二甲酸二戊酯(DPP)， 99.0%；鄰苯二甲酸二己酯(DHXP)， 99.5%；鄰苯二甲酸丁基芐基酯(BBP)， 99.5%；鄰苯二甲酸二( 2-丁氧基)乙酯(DBEP)， 96.0%；鄰苯二甲酸二環(huán)己酯(DCHP)， 99.5%；鄰苯二甲酸二( 2-乙基)己酯(DEHP)， 98.5%；鄰苯二甲酸二正辛酯(DNOP)， 99.5%；鄰苯二甲酸二壬酯(DNP)， 99.0%；鄰苯二甲酸二苯酯(DPhP)， 99.5%，均購自Dr. Ehrenstorfer GmbH，德國。

1.2 魚油制備

毛油(金槍魚魚油，-4 ℃下保存)由舟山興業(yè)有限公司提供，成品油由實驗室自制，在精煉過程中，分別對各個階段的油脂進行取樣(在-4 ℃下保存)，供分析測試。

脫膠：在毛油中加入0.1%油重的磷酸(85%)，50 ℃作用20 min，離心去膠質(zhì)，得到脫膠油。

脫酸：在脫膠油中加入7%油重的NaOH(3.11 mol/L)，60 ℃作用30 min，離心去皂腳，然后水洗，再離心去水得到脫酸油。

脫色：在脫酸油中加入5%油重的活性白土，60 ℃作用30 min，離心后得到脫色油。

脫臭：將脫酸油溶解于正己烷(V(油)∶V(正己烷)=1∶4)，然后于膜分離設備中進行1 h左右(進膜壓力20 bar，40 ℃)脫臭處理，隨后60 ℃真空旋蒸除正己烷，得到脫臭油[11]。

1.3 標準溶液的配制

16種混合標準儲備液的濃度為100 mg/L，用正己烷將其逐級稀釋至濃度為0.05，0.10，0.25，0.50，1.0 μg/mL的混合標準工作液，-4 ℃保存，備用。

1.4 樣品前處理

樣品凈化裝置如圖1所示，臨用前用10 mL正己烷進行淋洗處理。配制60 mL正己烷-二氯甲烷溶液(V(正己烷)∶V(二氯甲烷)=95∶5)，其中20 mL用于溶解0.2 g魚油樣品，緩慢加入層析柱中，之后用剩余的正己烷-二氯甲烷混合溶液分3次沖洗瓶中殘留物質(zhì)和層析柱。底部用圓底燒瓶收集洗脫液，收集完畢后，于50 ℃下旋蒸至近干，正己烷定容，待測，同時做好空白對照。

圖1 玻璃層析柱結構圖Fig.1 The structure of the glass chromatographic column

1.5 色譜條件

1.5.1 氣相條件

色譜柱：HP-5MS毛細管柱 (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm，Agilent，美國)；載氣為氦氣(純度>99.99%)，流速1.0 mL/min，恒流模式；進樣量1 μL，進樣口溫度250 ℃，柱升溫程序：初始60 ℃，保持0.5 min，以20 ℃/min升至280 ℃，保持8 min，不分流進樣。

1.5.2 質(zhì)譜條件

傳輸線溫度280 ℃，EI離子源，電離能量70 eV,離子源溫度230 ℃，質(zhì)量掃描范圍40～600 m/z，四級桿溫度150 ℃，選擇離子檢測模式：SIM，定性定量離子見表1。

表1 16種PAEs的保留時間和特征離子

2 結果與分析

2.1 定性測定

根據(jù)1.5的色譜條件對16種PAEs標準溶液進行測定，分析結果的色譜圖見圖2。從圖2可以看出，16種目標化合物在20 min內(nèi)有效分開，峰形對稱，表明本實驗的色譜條件能滿足實驗要求。

1-DMP; 2-DEP; 3-DIBP; 4-DBP; 5-DMEP; 6-BMPP; 7-DEEP; 8-DPP; 9-DHXP; 10-BBP; 11-DBEP; 12-DEHP; 13-DCHP; 14-DPHP; 15-DNOP; 16-DNP圖2 16種PAEs標準品的選擇離子色譜圖Fig.2 Selected ion monitoring chromatograph of 16 PAEs

2.2 方法的線性范圍及檢出限

根據(jù)1.5的色譜條件對16種PAEs五個濃度梯度的混合標準工作液進行測定，測定的結果以峰面積Y對濃度X作線性回歸，其線性范圍、回歸方程、相關系數(shù)(R2)、方法檢出限如表2所示。結果表明，16種PAEs線性回歸方程的相關系數(shù)R2均>0.998 3，表明16種PAEs在0.05～1.0 μg/mL有良好的線性關系。以信噪比(S/N)=3來確定方法的檢出限(LOD)，LOD值為0.08～0.30 mg/kg，表明方法具有較高的靈敏度，可以滿足實驗檢測的要求。

2.3 方法的精密度和準確度測定

選取本底值較小的毛油樣品按1.4的步驟進行加標回收實驗，對方法的精密度和準確度進行驗證。加標水平分別為0.1、0.25和0.5 μg/mL，每個加標水平重復3次，扣除本底值后計算加標回收率，如表3所示。結果顯示，加標樣品的3個水平樣品的平均加標回收率為82.1%～107.4%，相對標準偏差(RSD)為0.8%～12.9%，其精密度和準確度能夠滿足分析需求。

2.4 魚油精制過程中PAEs的變化規(guī)律

通過對5個階段油樣取樣進行GC-MS分析，與標準品的保留時間，特征碎片離子和碎片離子的相對強度作比較發(fā)現(xiàn)，在5個階段的魚油樣品均檢測到了3種塑化劑，結果如圖3所示。

表2 16種PAEs的線性方程、相關系數(shù)及檢出限

表3 不同加標濃度的加標回收率和相對標準偏差

圖3 毛油的選擇離子色譜圖Fig.3 Selected ion monitoring chromatograph of crude oil

3種塑化劑分別是工業(yè)上應用最為廣泛的的DIBP，DBP和DEHP，毛油中的含量分別為0.06、0.05和0.04 mg/kg，表明其已受到了塑化劑的污染，且隨著工藝的進行，3種塑化劑含量呈上升趨勢，脫膠油中3種塑化劑的含量分別為0.07、0.08和0.04 mg/kg，脫酸油中含量分別為0.08、0.09和0.04 mg/kg，脫色油中含量分別為0.10、0.11和0.05 mg/kg，脫臭油中的含量分別為0.19、0.24和0.06 mg/kg，脫臭階段上升幅度較大，可能原因是魚油長時間、在較高溫度下與正己烷(作為浸出油溶劑提取劑)接觸，正己烷中部分塑化劑向魚油發(fā)生了遷移有關。同時，DBP,DIBP和DEHP的分子質(zhì)量在280～300，與膜截留分子質(zhì)量接近，因此不容易透過，從而有利于塑化劑在魚油中累積。

由上述數(shù)據(jù)可以看到，DBP在整個精煉過程中遷移量略高于DIBP，但兩者均比DEHP高的多，主要是因為在相同條件下，PAEs分子質(zhì)量愈小，愈容易發(fā)生遷移[12]，DBP和DIBP分子質(zhì)量相同，但小于DEHP，分子阻力小，因此DBP和DIBP遷移量大。同時，檢測精制所使用正己烷中的PAEs含量，結果表明正己烷中同樣含有DIBP，DBP和DEHP，且含量較高，分別為1.15、1.66和0.08 mg/kg。有研究表明[13]，外源污染物PAEs含量越高，溶出塑化劑的含量越大，這就是DBP和DIBP分子質(zhì)量相同，但是在脫臭階段，魚油中DBP增長量要高于DIBP的原因，也表明魚油在脫臭階段，受到了正己烷的污染。精煉過程中魚油中塑化劑含量的變化規(guī)律如圖4所示。

圖4 3種塑化劑在魚油精煉過程中的變化規(guī)律Fig.4 The variation of 3 PAEs during fish oil refining process

FARHOODI[14]等進行了DEHP從PET瓶遷移至酸奶的研究，結果表明，DEHP的遷移量與多種因素有關，包括化合物的分子質(zhì)量，在溶液中的溶解度，溫度等，其中溫度對遷移的影響較大。曹九超[15]等發(fā)表的關于塑化劑的污染途徑的綜述也提到食用油在加工過程中不可避免地會接觸到一些塑料設備，接觸過程中塑料中的塑化劑會溶入食用油中，使食用油被塑化劑污染。在食用油制取和精煉過程中用到的化學助劑也有可能使食用油被塑化劑污染，如油脂浸出時所用溶劑正己烷，生產(chǎn)正己烷時接觸塑料，然后再用其來提取油脂，從而將塑化劑引入食用油中。因此，要確保精煉過程中魚油品質(zhì)的安全性，必不可少的前提就是必須確保所使用的化學助劑的安全性。

3 結論

本文建立了氣相色譜-質(zhì)譜法測定魚油中的鄰苯二甲酸酯類化合物的方法，研究了其在魚油精煉過程中的變化規(guī)律。結果表明，采用氣相色譜-質(zhì)譜法來測定魚油中的PAEs，方法簡便、快速、有效。與此同時，3種塑化劑在魚油精煉過程中被檢測到，且隨著精煉工藝的進行，3種塑化劑的含量呈上升趨勢，表明魚油在精煉過程中受到了塑化劑的污染，而工藝中所使用的化學助劑是造成塑化劑污染的主要因素。因此，在實際的工業(yè)生產(chǎn)中，為保證魚油產(chǎn)品的安全性，就必須保證所使用的化學助劑的安全性，這樣才能生產(chǎn)滿足人們需求的魚油。

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Studies on the analysis and variation of phthalic acid esters in fish oil refining process

ZHANG Jian-you, FEI Xiao-wen, LIU Jian-hua, DING Yu-ting*

(College of Ocean, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)

A gas chromatography - mass spectrometric method was developed for simultaneous determination of sixteen phthalic acid esters (phthalate acid esters, PAEs) in fish oil. The variation of PAEs in fish oil refining process was stuided. The results indicated that 16 PAEs were separated completely within 20 mins, the calibration curves of 16 PAEs were linear within the range from 0.05 to 1.0 μg/mL (R2>0.998 3). The recovery experiments indicated that recovery rate was from 82.1% to 107.4%, the relative standard deviation was between 0.8% to 12.9%. The limits of detection in GC-MS were between 0.08 to 0.30 mg/kg. At the same time, 3 PAEs (DIBP, DBP and DEHP) were detected in crude oil with content of 0.06 mg/kg, 0.05 mg/kg and 0.04 mg/kg, and increased with the refining process. The content in refined oil were 0.19 mg/kg, 0.24 mg/kg and 0.06 mg/kg. Industrial additives used in the refining process were the main pollution sources of PAEs.

fish oil; phthalate acid esters; PAEs; GC-MS

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201610028

博士，副教授(丁玉庭教授為通訊作者)。

2016-03-02，改回日期：2016-03-29