李明華，陸正清，孟秀梅，陳軍

(江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 淮安，223003)

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金針菇多糖閃式提取工藝及其抗氧化活性研究

李明華，陸正清*，孟秀梅，陳軍

(江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 淮安，223003)

以金針菇為原料，應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化了金針菇多糖的閃式提取工藝，并對(duì)多糖的抗氧化活性進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果表明：最佳閃式提取條件為液料比26∶1(mL∶g)、提取電壓190 V、提取時(shí)間103 s，在該條件下，提取兩次，多糖最終提取率為6.85%，較高溫浸提法提高了40.08%?？寡趸瘜?shí)驗(yàn)表明，金針菇多糖具有明顯的還原能力和清除羥自由基和DPPH自由基的能力。

金針菇；多糖；閃式提取；抗氧化

金針菇，學(xué)名毛柄金錢菌(Flammulinavelutipes)，是我國(guó)廣泛種植的食藥用真菌。金針菇富含多糖、蛋白質(zhì)、粗纖維以及多種氨基酸、維生素和微量元素[1]，具有很高的營(yíng)養(yǎng)及醫(yī)療保健價(jià)值。金針菇多糖是金針菇中最主要的生物活性成分之一，具有抗腫瘤、抗氧化和提高免疫力等生理功能[2-4]，已受到保健和醫(yī)藥界的廣泛關(guān)注。

目前，金針菇多糖的提取方法除了傳統(tǒng)的水提醇沉之外，還開發(fā)了多種新式提取方法，如微波法[3, 5]、超聲波法[6-7]、酶解法[8-9]及其復(fù)合方法[10]。這些新式提取方法較傳統(tǒng)法提取時(shí)間短、提取效率高，已顯示出明顯優(yōu)勢(shì)。閃式提取是一種新興的天然產(chǎn)物提取技術(shù)，該技術(shù)利用高速的機(jī)械剪切力和攪拌力，迅速破壞植物細(xì)胞組織，并利用局部負(fù)壓滲透作用使有效成分迅速擴(kuò)散到溶劑中[11]，從而實(shí)現(xiàn)有效成分的高效提取。該方法具有無(wú)需加熱、快速和高效等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于植物活性成分的提取之中。

本研究以金針菇為原料， 應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化了金針菇多糖的閃式提取工藝條件，并對(duì)多糖的自由基清除能力和還原能力進(jìn)行了初步的測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及試劑

金針菇，購(gòu)于農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，清雜后備用；1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH)、VC購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；石油醚、無(wú)水乙醇、苯酚、濃H2SO4、葡萄糖、三氯甲烷、正丁醇、水楊酸、K3Fe(CN)6、FeCl3、H2O2水等,均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

JHBE-50S閃式提取器，北京金鼎科技發(fā)展有限公司；UV-4802紫外-可見光分光光度計(jì)，美國(guó)尤尼柯儀器有限公司；AL104電子分析天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；5810R高速冷凍離心機(jī)，艾本德中國(guó)有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；FW-80小型粉碎機(jī)，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；DHG-9248A電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；HH-S6水浴鍋，常州國(guó)宇儀器制造有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 金針菇多糖的閃式提取

1.3.1.1 原料預(yù)處理

將新鮮金針菇除雜洗凈，瀝干水分后于鼓風(fēng)干燥箱中60 ℃烘干，粉碎過(guò)80目篩后，用石油醚( 30～60 ℃) 脫脂，烘干后置于干燥器中備用。

1.3.1.2 金針菇多糖閃式提取工藝

準(zhǔn)確稱取金針菇粉40 g于不銹鋼提取罐中，按一定比例加入純凈水，在適當(dāng)電壓條件下閃式提取一定時(shí)間，離心機(jī)中6 000 r/min離心10 min，沉淀用同樣方法重提1次，將2次提取上清液合并后80 ℃減壓濃縮至一定體積，冷卻至室溫，加入4倍的無(wú)水乙醇，置于4 ℃冰箱中12 h，然后4 000 r/min離心10 min，沉淀于60 ℃烘干稱重，最后用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖的含量[12]，按下式計(jì)算提取率。

(1)

1.3.1.3 金針菇多糖閃式提取的單因素實(shí)驗(yàn)

在室溫下，分別以不同的料液比、提取電壓、提取時(shí)間和提取次數(shù)為單因素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，考察各因素對(duì)金針菇多糖提取率的影響。

1.3.1.4 金針菇多糖閃式提取的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，依據(jù)Box-Benhnken 的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，應(yīng)用Design Expert 8.0 軟件設(shè)計(jì)3因素3水平響應(yīng)面分析試驗(yàn)，對(duì)金針菇多糖閃式提取工藝進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，確定最佳工藝參數(shù)。

1.3.2 金針菇多糖浸提法提取

將預(yù)處理后的金針菇粉按1∶30(g∶mL)比例加入純凈水，浸泡30 min后，置于水浴鍋中95 ℃浸提120 min，每隔15 min攪拌1次，然后冷卻、離心，沉淀重復(fù)浸提1次[13]，將2次上清液混合后減壓濃縮，然后加入4倍的無(wú)水乙醇， 4 ℃冰箱中過(guò)夜后4 000 r/min離心10 min，沉淀于60 ℃烘箱烘干稱重，測(cè)定多糖含量，計(jì)算提取率。

1.3.3 金針菇多糖精制

將粗多糖按一定比例重溶于純凈水，然后用Sevage 法[14]反復(fù)處理2～3次直至完全去除蛋白質(zhì)。將除蛋白的多糖溶液加入4倍體積的無(wú)水乙醇，4 ℃靜置12 h后，離心機(jī)中4 000 r/min離心10 min，所得沉淀用乙醇和丙酮交替浸洗兩次，然后60 ℃烘干即得多糖精制樣品，用于抗氧化活性測(cè)定。

1.3.4 金針菇多糖抗氧化活性測(cè)定

配制一定濃度的多糖水溶液，分別應(yīng)用水楊酸法[15]和比色法[16]檢測(cè)多糖對(duì)羥自由基和DPPH自由基的清除能力，采用普魯士蘭法[17]檢測(cè)多糖的還原活性。同時(shí)，應(yīng)用同濃度的Vc溶液做陽(yáng)性對(duì)照，比較兩種物質(zhì)的相應(yīng)活性。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2007和響應(yīng)面分析軟件Design-Expert 8. 0對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析，并繪制相關(guān)圖表，所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，以平均值為最終結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同因素對(duì)金針菇多糖提取率的影響

2.1.1 液料比對(duì)多糖提取率的影響

液料比對(duì)金針菇多糖閃式提取率的影響見圖1 。由圖1可知，隨著液料比的增大，多糖提取率不斷升高，在液料比為25∶1時(shí)，提取率達(dá)到最高，為6.72%；進(jìn)一步提高液料比，提取率不僅沒(méi)有繼續(xù)升高，而是呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)。這是因?yàn)椋谝欢ǚ秶鷥?nèi)，提高料液比，可提高物料與溶劑的接觸面積，有利于多糖的擴(kuò)散，使多糖易溶于水中，從而提高提取率；但液料比過(guò)大，降低了物料的濃度，減少了提取器刀頭與物料的作用幾率，從而降低了多糖的溶出速度，降低了多糖提取率。

圖1 液料比對(duì)多糖提取率的影響Fig.1 Effect of liquid-solid ratio on the extraction rate of polysaccharides

2.1.2 提取電壓對(duì)多糖提取率的影響

閃式提取器的設(shè)定電壓對(duì)金針菇多糖提取率的影響特別顯著，如圖2所示。電壓越高，提取器刀頭轉(zhuǎn)速越快，內(nèi)外刀之間產(chǎn)生的剪切力越強(qiáng)，外刀腔內(nèi)負(fù)壓越大，越有利于物料的破碎和細(xì)胞的崩解[11]，使多糖分子更容易從物料中解離并向溶劑中擴(kuò)散。因此，在液料比和提取時(shí)間一定的條件下，電壓越高，多糖的提取率就越高，在電壓為180 V時(shí)，提取率達(dá)到最大為6.56%；進(jìn)一步提高電壓，提取率基本保持穩(wěn)定。

圖2 提取電壓對(duì)多糖提取率的影響Fig.2 Effect of extraction voltage on the extraction rate of polysaccharides

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響

在閃式提取過(guò)程中，刀頭轉(zhuǎn)速一定時(shí)，提取時(shí)間越長(zhǎng)對(duì)物料的破碎程度越高，多糖的溶出量越大，提取率就越高。當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到一定長(zhǎng)度后，多糖向溶劑的擴(kuò)散速度逐漸降低并趨于平衡，即使繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間，提取率也不會(huì)再有明顯的提高。在本實(shí)驗(yàn)中，提取時(shí)間為100 s時(shí)，多糖提取率基本達(dá)到最高，為6.63%(圖3)。

圖3 提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on the extraction rate of polysaccharides

2.1.4 提取次數(shù)對(duì)多糖提取率的影響

在多糖第一次提取完成后，將離心后的沉淀在同樣條件下再進(jìn)行提取，將多次提取液合并處理，計(jì)算提取率，不同提取次數(shù)的提取率見圖4。物料經(jīng)過(guò)1次閃式提取后，多糖提取并不完全，提取率為5.85%，重復(fù)提取1次后，可將殘存的多糖提取出來(lái)，使多糖提取率提高到6.68%。由圖4還可看出，提取超過(guò)3次，提取率并沒(méi)有明顯提高，因此，在提取工藝優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中均提取兩次，且不作為響應(yīng)面優(yōu)化的因素。

圖4 提取次數(shù)對(duì)多糖提取率的影響Fig.4 Effect of extraction times on the extraction rate of polysaccharides

2.2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)結(jié)果與分析

2.2.1 數(shù)學(xué)模型的建立與顯著性分析

在金針菇多糖閃式提取的響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中，液料比、提取電壓和提取時(shí)間三變量的三水平值見表1，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案和結(jié)果見表2。將表 2 中試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，即得到金針菇多糖提取率對(duì)液料比、提取電壓和提取時(shí)間的二次多項(xiàng)回歸方程：提取率/%=6.83+0.21A+0.46B+0.37C-0.05AB+0.13AC-0.24BC-0.71A2-0.41B2-0.85C2。

表1 響應(yīng)面因素與水平表

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

表3 回歸模型顯著性檢驗(yàn)

注：*.P<0.05 ，差異顯著；**.P<0 .01，差異極顯著。

2.2.2 響應(yīng)面及等高線分析

圖5～圖7顯示了液料比、提取電壓和提取時(shí)間對(duì)金針菇多糖提取率的影響及三因素之間的交互作用的大小。在響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)中，響應(yīng)面曲面越陡、等高線越密集，則各因素交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響越顯著[18]。由圖5、圖6可看出，液料比與提取電壓、液料比與提取時(shí)間的交互作用對(duì)提取率影響不顯著；而提取電壓和提取時(shí)間的交互作用影響極顯著，且響應(yīng)值隨著兩因素水平的提高先升高后降低(圖7)。

圖5 液料比和提取電壓交互作用的響應(yīng)面及等高線圖Fig.5 Response surface and contour plotsfor the interactive effects of liquid-solid ratio and extraction voltage

圖6 液料比和提取時(shí)間交互作用的響應(yīng)面及等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots for the interactive effects of liquid-solid ratio and extraction tim

圖7 提取電壓和提取時(shí)間交互作用的響應(yīng)面及等高線圖Fig.7 Response surface and contour plotsfor the interactive effects of extraction voltage and time

2.2.3 最佳提取工藝條件驗(yàn)證及與浸提法比較

響應(yīng)面軟件分析結(jié)果表明，金針菇多糖最佳閃式提取條件為液料比25.68∶1，提取電壓190 V，提取時(shí)間103.01 s，在該條件下，多糖提取率理論值為6.99%?？紤]到實(shí)際操作的便利，分別選取液料比26∶1、提取電壓190 V和提取時(shí)間103 s進(jìn)行提取試驗(yàn)，以驗(yàn)證模型預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。結(jié)果表明，3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)中多糖提取率分別為6.86%、6.78%和6.92%，平均為6.85%，與理論值差別不大。由此可見，應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化金針菇多糖閃式提取工藝參數(shù)是準(zhǔn)確可行的。

對(duì)于金針菇多糖，不同的科研工作者得到的提取率差別很大，多在1.38～11.09%間[3, 8-10]，少數(shù)超過(guò)20%[10, 19]，這除了提取方法引起的差異外，原料多糖含量和多糖的最終純度都會(huì)對(duì)結(jié)果帶來(lái)很大的差別。因此，為了比較閃式提取的優(yōu)越性，本實(shí)驗(yàn)特地用傳統(tǒng)的浸提法對(duì)同種金針菇進(jìn)行了多糖的提取，得到的提取率為4.89%，而閃式提取法提取率為6.85%，較浸提法高40.08%，且提取時(shí)間大大減少，耗能顯著降低，顯示出了明顯的優(yōu)勢(shì)。

2.3 金針菇多糖的抗氧化活性

2.3.1 羥自由基清除能力

由圖8可以看出，金針菇多糖對(duì)羥自由基具有一定的清除能力，且隨著濃度的增加，清除能力逐漸增強(qiáng)。與Vc相比，在同等濃度下，金針菇多糖清除羥自由基的能力相對(duì)較低，在1 mg/mL時(shí)，Vc對(duì)羥自由基的清除率為78.4%，而金針菇多糖清除率為52.7%，僅為Vc的67.22%。

圖8 金針菇多糖清除羥自由基的能力Fig.8 Hydroxyl radical-scavenging activity of polysaccharides from F.velutipes

2.3.2 DPPH自由基清除能力

圖9比較了金針菇多糖和Vc對(duì)DPPH自由基的清除能力。在測(cè)定濃度范圍中，多糖對(duì)DPPH自由基的清除能力隨著樣品濃度的增加而升高，但在同等濃度時(shí)，清除率顯著低于Vc。在濃度為1 mg/mL時(shí)，金針菇多糖對(duì)DPPH自由基清除率僅為57.9%，而Vc在0.2 mg/mL時(shí)，其清除率基本達(dá)到最大，為93.6%。

圖9 金針菇多糖清除DPPH自由基的能力Fig.9 DPPH radical-scavenging activity of polysaccharides from F.velutipes

2.3.3 Fe3+還原能力

金針菇多糖對(duì)Fe3+具有良好的還原能力，且隨著多糖濃度的增大而逐漸增強(qiáng)，如圖10所示。但可能由于多糖的還原末端較少，其還原能力明顯低于小分子Vc，在濃度為1 mg/mL時(shí)，多糖反應(yīng)液吸光度為1.11，而Vc反應(yīng)體系的吸光度已達(dá)到1.75。

圖10 金針菇多糖對(duì)Fe3+的還原能力Fig.10 Fe3+ reducing activity of polysaccharides from F. velutipes

3 結(jié)論

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，獲得了金針菇多糖的最佳閃式提取工藝條件：液料比26∶1(mL∶g)、提取電壓190 V、提取時(shí)間103 s，在該條件下，經(jīng)過(guò)兩次提取，金針菇多糖的最終提取率達(dá)6.85%，較高溫浸提法提高了40.08%?？寡趸钚詼y(cè)定表明，金針菇多糖具有一定的羥自由基和DPPH自由基清除能力，同時(shí)具有一定的還原能力，但其活性均比同濃度的Vc低。

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Study on flash extraction process and antioxidant activities of polysaccharides fromFlammulinavelutipes

LI Ming-hua, LU Zheng-qing*, MENG Xiu-mei, CHEN Jun

(Jiangsu Food & Pharmaceutical Science College, Huai’an 223003, China)

In this study, the flash extraction conditions for polysaccharides fromFlammulinavelutipeswere optimized with response surface method, and the antioxidant activities of extracted polysaccharides were also determined. The results indicated that the optimum conditions for flash extraction were 25∶1 (mL∶g) of liquid-solid ratio, 190 V of extraction voltage and 103s of extraction time. Under these conditions, the total polysaccharides extraction rate was 6.85% after extracting twice, and it was 40.08% higher than hot water extraction. Antioxidant assays showed that the polysaccharides extracted fromF.velutipeshad good abilities of scavenging hydroxyl and DPPH radicals and reducing Fe3+.

Flammulinavelutipes; polysaccharide; flash extraction; antioxidant activity

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201610035

博士，講師(陸正清教授為通信作者，E-mail: spxxlzq@163.com)。

食用藥用真菌產(chǎn)業(yè)科技公共服務(wù)平臺(tái)(HAP201414)

2016-01-14，改回日期：2016-03-31