王 瓊，唐俊妮，湯 承，陳 娟

（西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041）

6 種食品防腐劑對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌效果及腸毒素基因表達(dá)的影響

王 瓊，唐俊妮*，湯 承，陳 娟

（西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041）

目的：探索6 種食品防腐劑——亞硝酸鹽、苯甲酸鈉、ε-聚賴(lài)氨酸、殼聚糖、茶多酚、Nisin對(duì)1 株引起食物中毒的金黃色葡萄球菌SA003的抑菌作用，以及對(duì)該菌株所含不同腸毒素基因在mRNA水平表達(dá)的影響。方法：按照GB 2760—2014《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》限量標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)量濃度，分別添加6 種不同的防腐劑在金黃色葡萄球菌SA003初始接菌量約為105CFU/mL的TSB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)；同時(shí)收集菌體用于RNA提取，將提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后，采用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法檢測(cè)各腸毒素基因在mRNA水平上的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果：在國(guó)標(biāo)最大限量條件下，不同添加劑對(duì)金黃色葡萄球菌SA003的抑菌作用強(qiáng)弱順序分別為：Nisin＞茶多酚＞殼聚糖＞ε-聚賴(lài)氨酸＞苯甲酸鈉＞亞硝酸鹽。6 種防腐劑均能抑制腸毒素sea、sed、seg、sei、selj、selm、selr和selu基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)，但作用效果存在差異。結(jié)論：在TSB液體培養(yǎng)基中添加一定劑量的防腐劑不僅能抑制金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)，還能夠顯著降低腸毒素基因的表達(dá)量。

食品防腐劑；金黃色葡萄球菌；腸毒素基因；表達(dá)?

葡萄球菌腸毒素是由金黃色葡萄球菌分泌的一類(lèi)具有超抗原活性、耐高溫、對(duì)胃蛋白酶以及胰蛋白酶均具有很好耐消化能力的胞外蛋白，誤食由金黃色葡萄球菌污染的食物可能會(huì)引起食物中毒[1]。歐盟發(fā)布的2013年食源性疾病的報(bào)告中，由金黃色葡萄球菌腸毒素引起的食物中毒占所有食源性疾病爆發(fā)的7.4%[1]。目前，已經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)的葡萄球菌腸毒素基因有24 種，由它們編碼的蛋白分別命名為傳統(tǒng)腸毒素SEA～SEE，以及新型腸毒素SEG～SElY[2-4]。

我國(guó)現(xiàn)行的GB 2760—2014《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定的常見(jiàn)食品防腐劑主要有硝酸鹽、苯甲酸鈉、山梨酸鉀、多酚類(lèi)、殼聚糖、細(xì)菌素、抗菌肽等[5]。針對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌方面現(xiàn)有的研究認(rèn)為，在液體培養(yǎng)基環(huán)境中添加一定劑量的山梨酸鉀、茶多酚、ε-聚賴(lài)氨酸、肉桂醛等能夠有效抑制金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)[6-9]；學(xué)者還發(fā)現(xiàn)防腐劑能影響葡萄球菌腸毒素的表達(dá)，如Braga等[10]采用0.05%的石榴提取液處理金黃色葡萄球菌，發(fā)現(xiàn)石榴提取液的活性成分能夠抑制腸毒素SEA的產(chǎn)生；Souza等[11]發(fā)現(xiàn)亞致死劑量濃度的香芹酚和百里酚能夠破壞金黃色葡萄球菌的細(xì)胞質(zhì)膜，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分泌受阻，從而抑制腸毒素產(chǎn)生；Azizkhani等[12]發(fā)現(xiàn)野薔薇精油能夠降低腸毒素sea、sec、see和agrA等基因的轉(zhuǎn)錄，從而降低腸毒素產(chǎn)生；Handayani等[13]從木瓜葉中提取的生物堿對(duì)腸毒素sea的表達(dá)具有抑制作用。上述這些研究一方面證實(shí)了部分防腐劑能夠抑制金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)，另一方面還可抑制部分傳統(tǒng)腸毒素的產(chǎn)生和基因表達(dá)。由于菌株的特異性和所含基因的種類(lèi)差異，為了進(jìn)一步了解常用防腐劑對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果以及對(duì)更多的新型腸毒素基因表達(dá)的影響，本實(shí)驗(yàn)擬采用一株引起食物中毒的金黃色葡萄球菌分離菌株SA003作為待測(cè)菌株，探究6 種常用防腐劑對(duì)SA003的抑菌效果，以及對(duì)SA003攜帶的傳統(tǒng)腸毒素和新型腸毒素基因轉(zhuǎn)錄水平的影響，為防控由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒提供更加豐富的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

金黃色葡萄球菌，分離自重慶市第三人民醫(yī)院食物中毒患者的嘔吐物。在實(shí)驗(yàn)室里進(jìn)一步采用Baird-Parker平板、染色鏡檢、耐熱核酸酶以及血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)，針對(duì)16S rDNA和nuc基因采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增進(jìn)行驗(yàn)證，菌株符合金黃色葡萄球菌所有典型特征，將其命名為SA003，采用常規(guī)PCR將該菌株的腸毒素基因進(jìn)行檢測(cè)，該菌株包含2 種傳統(tǒng)腸毒素基因sea和sed以及6種新型腸毒素基因seg、sei、selj、selm、selr、selu。

1.1.2 試劑與培養(yǎng)基

亞硝酸鹽 四川金山制藥有限公司；苯甲酸鈉、乳酸鏈球菌素（nisin） 河南千志商貿(mào)有限公司；ε-聚賴(lài)氨酸 鄭州天峰食品科技有限公司；水溶性殼聚糖 鄭州天和生物科技有限公司；茶多酚 河南綠邦生物技術(shù)有限公司；所有防腐劑均為食品級(jí)添加劑。

胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（tryptic soy broth，TSB）及其固體培養(yǎng)基（tryptic soy agar，TSA）、Baird-Parker（BP）瓊脂培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司；焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC） 美國(guó)Amresco公司；細(xì)菌總RNA提取試劑盒、溶菌酶 天根生化科技有限公司；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 美國(guó)Thermo Scientific公司；SsoAdvanced SYBR Green Supermix 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備

5804R型冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；HZQ-F160全溫振蕩培養(yǎng)箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；Tsnenen031445 PCR儀、CFX96熒光定量PCR儀美國(guó)Bio-Rad公司；BioSpec-nano230V核酸測(cè)定儀 日本島津公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株純化及菌懸液配制

將-70 ℃保存的金黃色葡萄球菌SA003菌株解凍后在BP培養(yǎng)基上劃線(xiàn)，37 ℃條件下恒溫培養(yǎng)24 h，挑選單菌落于TSB培養(yǎng)基中，在37 ℃、150 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，平板計(jì)數(shù)測(cè)定菌體濃度，將培養(yǎng)液稀釋成菌體濃度約為105CFU/mL的菌懸液，4 ℃冰箱暫存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 抑菌活性測(cè)定

根據(jù)GB 2760—2014規(guī)定的亞硝酸鈉、ε-聚賴(lài)氨酸、殼聚糖、苯甲酸鈉、茶多酚以及Nisin 6種防腐劑最大使用量0.15、0.25、6.00、2.00、0.80 g/L以及0.50 g/L的要求，采用無(wú)菌水配制10倍上述最大使用量的添加劑溶液，無(wú)菌過(guò)濾，4 ℃冰箱暫存?zhèn)溆?。在含?.9 mL滅菌TSB的試管中，分別加入1.0 mL各配制質(zhì)量濃度的防腐劑溶液以及0.1 mL SA003菌懸液；不加防腐劑的空白對(duì)照組用無(wú)菌水代替防腐劑，不含菌液的陰性對(duì)照組用無(wú)菌TSB代替菌液，共計(jì)8 組，每組設(shè)3 次平行。將上述體系充分混勻后，于37 ℃條件下，150 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)24 h。取出培養(yǎng)后的試管，充分振蕩混勻，平板計(jì)數(shù)確定金黃色葡萄球菌在6 種防腐劑最大使用量下的生長(zhǎng)情況。若在最大使用量下培養(yǎng)液未見(jiàn)渾濁，則采用二倍稀釋法對(duì)配制的添加劑進(jìn)行稀釋?zhuān)侔凑丈鲜龇椒ㄅ囵B(yǎng)和計(jì)數(shù)。

1.2.3 菌體收集及RNA提取

通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定24 h收集菌體。收集金黃色葡萄球菌SA003在添加6種防腐劑以及不添加任何防腐劑作用下的7 組實(shí)驗(yàn)樣本的所有24 h培養(yǎng)液，4 ℃、12 000 r/min離心2 min，棄上清液，菌體于-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。在進(jìn)行RNA提取時(shí)，先將試劑和耗材均用DEPC水處理，樣本在冰上解凍后用500 μL的1×TE緩沖液重懸菌體，加入溶菌酶37 ℃作用過(guò)夜，然后根據(jù)細(xì)菌總RNA提取及純化試劑盒操作要求提取細(xì)菌總RNA。

1.2.4 反轉(zhuǎn)錄以及熒光定量PCR

以上述提取的7 組樣本的金黃色葡萄球菌SA003總RNA分別為模板，采用RevertAid First Strand cDNA合成試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。具體操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，反應(yīng)體系20 μL，反應(yīng)條件為42℃、60 min，然后70℃、5 min。得到的cDNA產(chǎn)物采用BioSpec-nano230V核酸測(cè)定儀進(jìn)行核酸濃度定量測(cè)定。

熒光定量PCR反應(yīng)采用SYBR熒光定量試劑盒在CFX96 PCR儀上進(jìn)行，每個(gè)樣品各做3 次平行。熒光定量PCR的反應(yīng)體系為10 μL，包括SYBR Green Supermix 5 μL，各腸毒素正、反向引物（10 μmol/L）各0.5 μL，cDNA模板1 μL，RNase free water 3 μL。用于熒光定量的各腸毒素引物詳見(jiàn)表1，由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 用于熒光定量PCR的各腸毒素引物序列Table 1 Primer sequences of SE genes for real-time PCR analysis

熒光定量PCR退火溫度探索：將上述反應(yīng)體系按照95℃ 2 min、95 ℃ 30 s、55～65℃（共設(shè)置8個(gè)溫度梯度）30 s，39個(gè)循環(huán)進(jìn)行熒光定量PCR。反應(yīng)結(jié)束后，選擇熔解曲線(xiàn)尖銳且Ct值較小的體系所對(duì)應(yīng)的溫度為各腸毒素的最佳退火溫度（T*），然后將各腸毒素在T*對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物作為模板（采用BioSpec-nano230V核酸測(cè)定儀測(cè)定核酸濃度），10倍稀釋成8個(gè)梯度，反應(yīng)條件為95℃ 2 min、95 ℃ 10 s、T* 30 s，39個(gè)循環(huán)，獲得各不同腸毒素基因熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。針對(duì)金黃色葡萄球菌SA003所有反轉(zhuǎn)錄cDNA的擴(kuò)增同樣按照上述條件進(jìn)行，從而得到各腸毒素在24 h取樣點(diǎn)對(duì)應(yīng)的Ct值。

1.2.5 熒光定量數(shù)據(jù)處理

以ftsZ作為內(nèi)標(biāo)基因[14]，各腸毒素基因作為目標(biāo)基因，SA003添加6種防腐劑樣本作為測(cè)試樣本（sample），不添加防腐劑的對(duì)照樣本作為校準(zhǔn)樣本（control），每個(gè)目標(biāo)基因分別做3個(gè)重復(fù)。采用改良的2-Δ ΔCt法[16]，按下式計(jì)算8種腸毒素基因在6種不同防腐劑作用下的相對(duì)表達(dá)量（Rcontrol/sample）。

式中：ESEs、Eftsz分別為各引物的擴(kuò)增效率E值+1，E值是各目標(biāo)基因熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的斜率（slope），由公式E=10－1/slope-1計(jì)算得出[16]。將各目標(biāo)基因在防腐劑作用下的表達(dá)數(shù)值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，從而計(jì)算出SA003菌株8種腸毒素基因在6種不同防腐劑作用下的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 6 種不同防腐劑對(duì)金黃色葡萄球菌SA003的抑菌活性比較

表2 添加6 種不同防腐劑對(duì)金黃色葡萄球菌SA003生長(zhǎng)的影響Table 2 Inhibitory effect of six food antiseptics on the growth of S. aureusSA003

當(dāng)亞硝酸鈉、ε-聚賴(lài)氨酸、殼聚糖、苯甲酸鈉、茶多酚以及Nisin 6種食品添加劑采用國(guó)標(biāo)最大限量作用于金黃色葡萄球菌SA003時(shí)，培養(yǎng)24 h進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，金黃色葡萄球菌SA003的生長(zhǎng)情況詳見(jiàn)表2。最大限量的亞硝酸鈉、ε-聚賴(lài)氨酸、殼聚糖以及苯甲酸鈉對(duì)金黃色葡萄球菌SA003的生長(zhǎng)均有抑制作用，且相對(duì)于不添加任何防腐劑的對(duì)照組抑制效果顯著（P＜0.05）。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)在金黃色葡萄球菌SA003培養(yǎng)基中添加茶多酚和Nisin分別為0.8 g/L與0.5 g/L時(shí)，培養(yǎng)24 h試管中的培養(yǎng)液澄清未見(jiàn)渾濁，說(shuō)明茶多酚和Nisin在國(guó)標(biāo)最大限量時(shí)完全能夠抑制金黃色葡萄球菌SA003的生長(zhǎng)。進(jìn)一步對(duì)茶多酚和Nisin進(jìn)行2倍稀釋?zhuān)l(fā)現(xiàn)當(dāng)Nisin質(zhì)量濃度為0.25 g/L時(shí)，金黃色葡萄球菌SA003的生長(zhǎng)依舊被完全抑制。茶多酚質(zhì)量濃度為0.4 g/L時(shí)，對(duì)金黃色葡萄球菌SA003存在微弱抑菌效果，但抑菌作用不明顯（P＞0.05）；進(jìn)一步2倍稀釋Nisin，使其質(zhì)量濃度為0.125 g/L，發(fā)現(xiàn)Nisin對(duì)金黃色葡萄球菌SA003也存在微弱抑菌作用，但抑菌效果不明顯（P＞0.05）。比較6種防腐劑在國(guó)標(biāo)最大限量作用下，對(duì)金黃色葡萄球菌SA003的抑菌作用強(qiáng)弱順序?yàn)椋篘isin（0.50 g/L）＞茶多酚（0.80 g/L）＞殼聚糖（6.00 g/L）＞ε-聚賴(lài)氨酸（0.25 g/L）＞苯甲酸鈉（2.00 g/L）＞亞硝酸鹽（0.15 g/L）?？梢钥闯?，實(shí)驗(yàn)中生物防腐劑（Nisin、茶多酚、殼聚糖、ε-聚賴(lài)氨酸）較化學(xué)防腐劑（苯甲酸鈉、亞硝酸鹽）對(duì)金黃色葡萄球菌SA003生長(zhǎng)抑制效果要好一些。

2.2 6種防腐劑對(duì)金黃色葡萄球菌SA003不同腸毒素在mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響

通過(guò)熒光定量PCR分析，得到金黃色葡萄球菌SA003攜帶8 種腸毒素基因以及內(nèi)標(biāo)基因的退火溫度及標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)相關(guān)參數(shù)見(jiàn)表3。除了sei基因的最佳退火溫度為63.3 ℃，其余各腸毒素基因以及內(nèi)標(biāo)基因的最佳退火溫度均為61.4 ℃。

表3 各金黃色葡萄球菌SA003腸毒素基因熒光定量PCR的相關(guān)參數(shù)Table 3 Reference values for real time-PCR of SE genes

圖16 種防腐劑對(duì)金黃色葡萄球菌SA003腸毒素基因轉(zhuǎn)錄水平的影響Fig. 1 Effect of six food antiseptics on the expression levels of eight SE genes in S. aureus SA003

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)斜率，得出金黃色葡萄球菌SA003攜帶的8 種腸毒素分別在不同防腐劑作用下以及對(duì)照組的相對(duì)表達(dá)量。由圖1可以看出，在6種不同防腐劑劑量（亞硝酸鈉0.150 g/L、ε-聚賴(lài)氨酸0.250 g/L、殼聚糖6.000 g/L、苯甲酸鈉2.000 g/L、茶多酚0.400 g/L、Nisin 0.125 g/L）作用24 h后，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)6 種防腐劑對(duì)腸毒素sea、sed、seg、sei、selj、selm、selr和selu的轉(zhuǎn)錄起抑制作用，但不同防腐劑的作用效果存在差異。Duncan’s分析發(fā)現(xiàn)，盡管亞硝酸鈉對(duì)腸毒素基因轉(zhuǎn)錄的抑制相對(duì)其他幾種防腐劑來(lái)說(shuō)作用效果最小，但對(duì)sea、sed、seg、sei、selj和selm仍存在較顯著的抑制作用（P＜0.05）；其次是ε-聚賴(lài)氨酸和殼聚糖，二者對(duì)8種不同腸毒素轉(zhuǎn)錄表達(dá)的抑制作用效果相當(dāng)（P＞0.05）；茶多酚、苯甲酸鈉和Nisin對(duì)腸毒素基因的轉(zhuǎn)錄水平抑制效果較強(qiáng)（P＞0.05）。此外，在相同培養(yǎng)條件下，無(wú)論添加防腐劑與否，由質(zhì)粒編碼的腸毒素sed與selr基因轉(zhuǎn)錄水平均顯著高于其他腸毒素基因。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)探索了6 種常見(jiàn)食品防腐劑對(duì)金黃色葡萄球菌SA003生長(zhǎng)以及該菌株攜帶毒素基因表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)在國(guó)標(biāo)限量最大范圍時(shí)，生物防腐劑Nisin、茶多酚、殼聚糖、ε-聚賴(lài)氨酸的抑菌效果較化學(xué)防腐劑苯甲酸鈉和亞硝酸鹽好，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)6 種防腐劑可以使8 種腸毒素基因表達(dá)量呈明顯下降趨勢(shì)。

廖春麗等[6]研究了茶多酚對(duì)金黃色葡萄球菌及其他細(xì)菌的抑制效果，表明茶多酚對(duì)供試菌有較強(qiáng)的抑菌活性，而常用的防腐劑山梨酸鉀對(duì)金黃色葡萄球菌抑制效果不顯著，茶多酚的質(zhì)量濃度越高，抑菌活性越強(qiáng)。胡春紅等[7]研究了苯甲酸鈉和山梨酸鉀兩種防腐劑對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果，他們認(rèn)為苯甲酸鈉和山梨酸鉀對(duì)兩種菌的生長(zhǎng)都呈顯著抑制作用，相同濃度下苯甲酸鈉的抑菌效果要好于山梨酸鉀。莫樹(shù)平等[8]以ε-聚賴(lài)氨酸為主要防腐劑，與Nisin和納他霉素進(jìn)行復(fù)配，認(rèn)為復(fù)合生物防腐劑對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌和真菌均表現(xiàn)出抑制作用。這些研究結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，6 種防腐劑對(duì)金黃色葡萄球菌都具有很好的抑菌效果。

目前，食品防腐劑的抑菌機(jī)理可以歸納為3 種：作用于細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜系統(tǒng)、作用于細(xì)胞內(nèi)的酶系統(tǒng)或功能蛋白質(zhì)、作用于遺傳物質(zhì)[17]。本研究所選的6 種防腐劑的抑菌機(jī)制不盡相同。如亞硝酸鹽的抑菌機(jī)制是在細(xì)菌代謝作用下生成NO發(fā)揮活性，NO能夠與鐵硫化合物反應(yīng)形成鐵-亞硝?；?，導(dǎo)致鐵氧化還原蛋白等的破壞[18]；另外，NO還可與RNA還原酶相關(guān)位點(diǎn)結(jié)合，攻擊鋅指類(lèi)型的DNA連接蛋白，從而影響基因的調(diào)節(jié)作用[19]。但從本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果來(lái)看，亞硝酸鈉對(duì)金黃色葡萄球菌SA003的作用效果相對(duì)其他幾種防腐劑稍微表現(xiàn)弱一些，可能是金黃色葡萄球菌對(duì)亞硝酸鈉具有一定抵抗能力。苯甲酸鈉是通過(guò)未離解的苯甲酸分子發(fā)生作用，未離解的苯甲酸親脂性強(qiáng)，易通過(guò)細(xì)胞膜，抑制細(xì)胞內(nèi)呼吸酶的活力，阻止乙酰輔酶A的縮合反應(yīng)，從而起到抑菌作用[20]。Karabay等[21]發(fā)現(xiàn)苯甲酸鈉對(duì)臨床分離的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌菌株具均有很好的體外抑菌活性，本研究也證實(shí)了這一結(jié)論。茶多酚是從茶葉中提取的酚類(lèi)物質(zhì)及衍生物的總稱(chēng)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明茶多酚的抑菌活性很強(qiáng)，在最大限量時(shí)可完全抑制SA003的生長(zhǎng)。殼聚糖能與細(xì)菌生存所必需的蛋白質(zhì)等結(jié)合，或選擇性地螯合對(duì)微生物生長(zhǎng)起關(guān)鍵作用的金屬離子，尤其是酶的輔助因子，從而抑制微生物的生長(zhǎng)和繁殖；同時(shí)還可與DNA相互作用，擾亂DNA的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄[22]。本研究發(fā)現(xiàn)殼聚糖抑菌效果較強(qiáng)，在相同的條件下培養(yǎng)24 h，殼聚糖實(shí)驗(yàn)組金黃色葡萄球菌SA003菌落總數(shù)與對(duì)照組相比降低了3 個(gè)數(shù)量級(jí)，且抑菌活性高于ε-聚賴(lài)氨酸、苯甲酸鈉和亞硝酸鈉。ε-聚賴(lài)氨酸是一種從放線(xiàn)菌培養(yǎng)過(guò)濾液中提取出來(lái)的天然微生物代謝產(chǎn)物[23]，ε-聚賴(lài)氨酸能夠與細(xì)胞膜上帶負(fù)電荷的基團(tuán)結(jié)合，取代膜上的二價(jià)陽(yáng)離子，逐漸破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡，從而起到抑菌作用[24]。在最大限量下，ε-聚賴(lài)氨酸的抑菌效果強(qiáng)于苯甲酸鈉。Nisin可以使金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液中蛋白質(zhì)含量明顯增加，帶電荷細(xì)胞內(nèi)容物大量外泄，造成菌體不可恢復(fù)性損傷，從而失去代謝和增殖活性[25]。本研究認(rèn)為Nisin對(duì)SA003的抑菌活性最強(qiáng)，通過(guò)兩次2倍稀釋之后金黃色葡萄球菌SA003才能生長(zhǎng)。基于以上探討，上述6種不同防腐劑的作用效果存在差異可能與各自的抑菌機(jī)制有關(guān)。另外，0.4 g/L茶多酚和0.125 g/L Nisin對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)只存在微弱抑菌效果，但在相同的質(zhì)量濃度條件下，二者對(duì)于腸毒素基因轉(zhuǎn)錄卻有著顯著的抑制效果，并且在另一株食物中毒的菌株中也獲得同樣結(jié)果。Mori等[26]的研究也表明兒茶素沒(méi)食子酸酯能抑制金黃色葡萄球菌RNA的合成，這可以部分解釋茶多酚對(duì)腸毒素基因表達(dá)的抑制效果。至于Nisin抑制腸毒素基因轉(zhuǎn)錄的具體原因，還有待于進(jìn)一步探索。值得一提的是，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)腸毒素基因的表達(dá)高峰時(shí)期是在細(xì)菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期和穩(wěn)定期階段，因此，本研究只探索了6 種防腐劑與金黃色葡萄球菌共同作用24 h的情形，如果能針對(duì)整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程進(jìn)行監(jiān)測(cè)，獲得的數(shù)據(jù)將更有幫助。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種精確、靈敏的檢測(cè)方法，常用于金黃色葡萄球菌腸毒素基因檢測(cè)以及基因轉(zhuǎn)錄水平研究[14,27-31]。本研究通過(guò)熒光定量方法探索6種常見(jiàn)防腐劑對(duì)金黃色葡萄球菌SA003攜帶腸毒素基因轉(zhuǎn)錄的影響，發(fā)現(xiàn)6 種防腐劑對(duì)8 種腸毒素基因轉(zhuǎn)錄的影響存在差異。探其原因，一方面可能與上述6 種防腐劑的抑菌機(jī)制有關(guān)；另一方面，也可能與SA003攜帶的8 種腸毒素基因由不同基因元件編碼有關(guān)。腸毒素基因sea是由溫和型噬菌體編碼[32]；seg、sei、selm、selu基因由毒力基因簇（enterotoxin gene cluster，egc）編碼[33-34]；腸毒素sed、selj和selr基因由質(zhì)粒編碼[35-36]，研究發(fā)現(xiàn)由質(zhì)粒編碼的sed、selj和selr基因的表達(dá)較其他幾種腸毒素要高，這一點(diǎn)可以部分解釋金黃色葡萄球菌腸毒素SED引起食物中毒的發(fā)生率比較高的原因[32]。由于6 種防腐劑的作用機(jī)制不同，苯甲酸鈉和Nisin以及茶多酚對(duì)腸毒素基因轉(zhuǎn)錄水平抑制效果強(qiáng)；其次是ε-聚賴(lài)氨酸與殼聚糖；亞硝酸鈉對(duì)基因轉(zhuǎn)錄抑制效果最小。從本研究可以看出，在食品加工過(guò)程中選擇合適的防腐劑不僅能改良食品的品質(zhì)、延長(zhǎng)食品的保質(zhì)期，還可以抑制腸毒素的產(chǎn)生、降低食品安全風(fēng)險(xiǎn)。在未來(lái)的研究中，進(jìn)一步探索不同防腐劑復(fù)配使用，以及結(jié)合不同環(huán)境條件共同作用，也許能夠更好地對(duì)金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)和腸毒素表達(dá)進(jìn)行控制。

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Inhibitory Effect of Six Food Antiseptics on the Growth and Staphylococcal Enterotoxin (SE) Gene Expression of Staphylococcus aureus

WANG Qiong, TANG Junni*, TANG Cheng, CHEN Juan
(College of Life Science and Technology, Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041, China)

Objective: To explore the inhibitory effect of six food antiseptics (nitrite, sodium benzoate, ε-polylysine, chitosan, polyphenols, and nisin) on the growth of Staphylococcus aureus SA003, a strain capable of causing food poisoning, as well as on the expression of enterotoxin genes by this strain at the mRNA level. Methods: According to the national standard (GB 2760—2014) concentration limits, aqueous solutions of six different preservatives were prepared and added into TSB medium inoculated with about 105CFU/mL of S. aureus SA003. All cultures were shaken at 150 r/min at 37 ℃. After 24 h, the colonies of the cultures treated by different preservatives were counted, respectively. At the same time, the cells were collected for RNA extraction and reverse transcription. The fluorescence quantitative PCR was used to detect the relative expression level of each enterotoxin gene at the mRNA level. Results: At the GB maximum concentration limits, the inhibitory effects of different additives on the growth of S. aureus SA003 were nisin ＞ polyphenols ＞ chitosan ＞ ε-polylysine ＞ sodium benzoate ＞ nitrite. All six preservatives could inhibit the expression of sea, sed, seg, sei, selj, selm, selr and selu genes at the transcriptional level and their effects were significantly different. Conclusion: Adding preservatives in liquid medium not only inhibited the growth of S. aureus, but also significantly reduced the expression of staphylococcal enterotoxin genes.

food antiseptics; Staphylococcus aureus; enterotoxin genes; expression

10.7506/spkx1002-6630-201621026

TS207.4

A

1002-6630（2016）21-0151-06

王瓊, 唐俊妮, 湯承, 等. 6 種食品防腐劑對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌效果及腸毒素基因表達(dá)的影響[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(21): 151-156. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201621026. http://www.spkx.net.cn

WANG Qiong, TANG Junni, TANG Cheng, et al. Inhibitory effect of six food antiseptics on the growth and staphylococcal enterotoxin (SE) gene expression of Staphylococcus aureus[J]. Food Science, 2016, 37(21): 151-156. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201621026. http://www.spkx.net.cn

2016-01-04

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31371781）；四川省應(yīng)用基礎(chǔ)項(xiàng)目（2014JY0253）；教育部“新世紀(jì)人才支持計(jì)劃”項(xiàng)目（NCET-11-0847）

王瓊（1990—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)樾螽a(chǎn)品加工與安全。E-mail：wangqiong528@163.com

*通信作者：唐俊妮（1971—），女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称钒踩c食品微生物。E-mail：junneytang@aliyun.com