魏奇，白偉娟，鐘鑫榮，王曉贇，張承康，張維瑞，3，陳美霞*，劉盛榮，3*

（1.寧德師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，福建 寧德 352100；2.福建農(nóng)林大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350000；3.閩東特色生物資源福建省高校工程研究中心，福建 寧德 352100；4.廈門市燕之屋絲濃食品有限公司，福建 廈門 361100）

近年來，隨著消費習(xí)慣的變化，消費者對食品的需求也隨之發(fā)生變化。防腐劑在食物當(dāng)中所起到的關(guān)鍵作用是抑制食品中微生物的生長，防止食品出現(xiàn)因微生物產(chǎn)生的腐敗變質(zhì)現(xiàn)象，從而延長食品的貯藏期[1]。天然食品防腐劑，具有較好的抑菌和保鮮的作用，能夠避免化學(xué)防腐劑殘留物對人體產(chǎn)生較大的毒副作用。因此，天然防腐劑也越來越受到消費者的青睞[2-4]。

ε-聚賴氨酸是一種從微生物中篩選出的天然防腐抑菌劑，具有良好防腐性能和熱穩(wěn)定性等特點，存在巨大的商業(yè)潛力[5]。ε-聚賴氨酸是由鏈霉菌好氧發(fā)酵產(chǎn)生，研究表明其在人體中能夠直接降解成賴氨酸，對人體無毒無害，是一種天然的生物防腐劑[6-7]。ε-聚賴氨酸已被證實不會對生物體的生長、生育繁殖、神經(jīng)和免疫方面產(chǎn)生毒副作用，因此可作為一種天然、安全的食品防腐劑[8]。ε-聚賴氨酸主要的抑菌機制是通過破壞微生物的細(xì)胞形態(tài)，損傷細(xì)胞膜，引起細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的泄漏，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的酶及蛋白質(zhì)的代謝紊亂，從而引起機體的氧化應(yīng)激反應(yīng)，最終破壞細(xì)胞的功能，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[9]。殼聚糖是一種天然的氨基酸多糖，具有廣譜抑菌作用，能夠有效抑制金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和大腸桿菌等食源性致病菌，并且有自發(fā)成膜的物理特性，能夠在食品的表面形成透明無色的薄膜。因其無毒無害且無副作用，所以廣泛應(yīng)用于食品的生產(chǎn)和加工[10-11]。殼聚糖的抑菌作用主要是通過抑制微生物的生長，降低三羧酸循環(huán)中的關(guān)鍵酶活性，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致菌體死亡[12]。目前，殼聚糖可以廣泛應(yīng)用于果蔬保鮮，達(dá)到延緩果實衰老、抑菌防腐、保證果蔬品質(zhì)、延長果蔬貯藏期的效果。因此，殼聚糖可以延長食品的貯藏期。

殼聚糖和ε-聚賴氨酸是一種天然食品防腐抑菌劑，具有較好的抑菌和保鮮作用。殼聚糖和ε-聚賴氨酸復(fù)配使用時，殼聚糖形成薄膜吸附在細(xì)胞膜上，影響了營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入，從而達(dá)到抑菌的作用[13-15]。有研究報道，殼聚糖和ε-聚賴氨酸復(fù)合涂膜能夠延長中國對蝦的保質(zhì)期，減少中國對蝦的汁液流失，減少微生物數(shù)量[16]。殼聚糖和ε-聚賴氨酸具有協(xié)同作用，能夠改善貯藏期間櫻桃的硬度和色澤，可以提高櫻桃的貯藏品質(zhì)[17]。因此，開發(fā)殼聚糖和ε-聚賴氨酸復(fù)合保鮮劑對提高食品品質(zhì)和延長食品貯藏期具有十分重要的意義。

天然食品防腐劑的復(fù)配應(yīng)用，有助于提高防腐劑的保鮮效果，增加抑菌譜，減少用量而降低成本。本文對殼聚糖與ε-聚賴氨酸復(fù)配的抑菌效果進(jìn)行研究，以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為指示菌，采用微量稀釋法來測定殼聚糖、ε-聚賴氨酸及其復(fù)配溶液的最低抑菌濃度，采用Checkerboard法探究殼聚糖和ε-聚賴氨酸抑菌活性，并分析兩者復(fù)配溶液對細(xì)菌的影響，該研究可為ε-聚賴氨酸和殼聚糖在食品中的科學(xué)復(fù)配應(yīng)用提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）：寧德師范學(xué)院微生物室提供。

1.1.2 試劑

ε-聚賴氨酸（食品級）：浙江新銀象生物工程有限公司；殼聚糖（食品級）：北京索萊寶科技有限公司；營養(yǎng)瓊脂、營養(yǎng)肉湯：廣州環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DHP-9272A電熱恒溫培養(yǎng)箱、DHG-9070A鼓風(fēng)干燥箱：上海飛越實驗儀器有限公司；SW-CJ-2D凈化工作臺、YXQ-SG46-280S全自動高壓滅菌鍋：上海博迅實業(yè)有限公司；THZ-100恒溫培養(yǎng)搖床：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；YP802N電子天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；YC-300L數(shù)控低溫保存箱：中科美菱低溫科技股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 溶劑配制

ε-聚賴氨酸溶液制備：用去離子水配制ε-聚賴氨酸溶液（2%）。殼聚糖溶液制備：用0.5%冰醋酸制備殼聚糖溶液（0.1%）。

1.3.2 培養(yǎng)基配制

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的配制：稱取營養(yǎng)瓊脂干粉（33 g）加入1 L蒸餾水，高溫高壓滅菌（121℃，15 min）。營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的配制：稱取營養(yǎng)肉湯干粉（18 g）加入1 L蒸餾水，高溫高壓滅菌（121℃，15 min）。

1.3.3 菌種活化

在超凈工作臺中，將兩種供試菌接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.3.4 菌液制備

在超凈工作臺中，分別取上述少量活化后的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌，接種至30 mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中于恒溫?fù)u床中培養(yǎng)24 h（150 r/min，35℃）。

1.3.5 最小抑菌濃度測定

96孔板中加入100 μL ε-聚賴氨酸溶液（或殼聚糖溶液）和100 μL菌液濃度為106CFU/mL的大腸桿菌（或金黃色葡萄球菌）。分別在24、48 h和72 h后觀察，測定最小抑菌濃度。表1為ε-聚賴氨酸和殼聚糖溶液的濃度。

表1 殼聚糖和ε-聚賴氨酸的濃度Table 1 The concentration of ε-polylysine and chitosan

1.3.6 Checkerboard法測試

殼聚糖和ε-聚賴氨酸復(fù)配溶液的濃度如表2所示。按照Checkboard法測定殼聚糖和ε-聚賴氨酸復(fù)配溶液的聯(lián)合抑菌作用。

表2 殼聚糖、ε-聚賴氨酸復(fù)配濃度Table 2 The combined concentration of ε-polylysine and chitosan

1.3.7 Checkerboard法計算聯(lián)合抑菌指數(shù)（fractional inhibitory concentration index，F(xiàn)ICI）值

采用Checkerboard法計算FICI值，從而評估殼聚糖和ε-聚賴氨酸相互抑菌作用[18-19]。FICI計算公式如下。FICI=殼聚糖和ε-聚賴氨酸復(fù)配溶液MIC/殼聚糖MIC+殼聚糖和ε-聚賴氨酸復(fù)配溶液MIC/ε-聚賴氨酸MIC

當(dāng) FICI≤0.5 時，為協(xié)同效應(yīng)；0.5＜FICI≤1，為相加效應(yīng)；1＜FICI≤2，為無關(guān)效應(yīng)；FICI>2，為拮抗效應(yīng)。

1.3.8 蛋白質(zhì)泄漏量的測定

參考文獻(xiàn)[20]的方法，測定蛋白質(zhì)泄漏量。取5 mL的金黃色葡萄球菌菌液，離心5 min（8 000 r/min，4℃）后棄上清液，用0.85%的生理鹽水將菌液重懸至40 mL。吸取 2 mL ε-聚賴氨酸溶液（35 μg/mL）、殼聚糖溶液（180 μg/mL）和復(fù)配溶液（16 μg/mL ε-聚賴氨酸、100 μg/mL殼聚糖）分別與2 mL金黃色葡萄球菌菌液混勻，處理時間為72 h。樣品用0.85%的生理鹽水稀釋5倍，離心5 min（8 000 r/min，4℃）后測定蛋白質(zhì)濃度，無菌生理鹽水作為空白對照，計算蛋白質(zhì)泄漏量。

取5 mL的大腸桿菌菌液，離心5 min（8 000 r/min，4℃）后棄上清液，用0.85%的生理鹽水將菌液重懸至40 mL。吸取 2 mL ε-聚賴氨酸溶液（20 μg/mL）、殼聚糖溶液（240 μg/mL）和復(fù)配溶液（6 μg/mL ε-聚賴氨酸、100 μg/mL殼聚糖）分別與2 mL大腸桿菌菌液混勻，處理時間為72 h。樣品用生理鹽水稀釋5倍，離心5 min（8 000 r/min，4℃）后測定蛋白質(zhì)濃度，無菌生理鹽水作為空白對照，計算蛋白質(zhì)泄漏量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個試驗重復(fù)測定3次，取其平均值，應(yīng)用SPSS 16.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，并用Graphpad Prism 9作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 殼聚糖對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的影響

殼聚糖對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的最小抑菌濃度見表3。

表3 殼聚糖對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的最小抑菌濃度Table 3 Minimum inhibitory concentration of chitosan against Staphylococcus aureus and Escherichia coli

由表3可知，殼聚糖的抑菌活性隨著殼聚糖濃度增加而增強。不同處理時間下，殼聚糖對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度均為180 μg/mL。當(dāng)抑制時間24 h時，殼聚糖對大腸桿菌的最小抑菌濃度為200 μg/mL。當(dāng)抑制時間48、72 h時，殼聚糖對大腸桿菌的最小抑菌濃度為240 μg/mL。由此可知，當(dāng)抑制時間為72 h時，殼聚糖對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度（180 μg/mL）小于對大腸桿菌的最小抑菌濃度（240 μg/mL）。

2.2 ε-聚賴氨酸對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的影響

ε-聚賴氨酸對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的最小抑菌濃度見表4。

表4 ε-聚賴氨酸對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的最小抑菌濃度Table 4 Minimum inhibitory concentration of ε-polylysine against Staphylococcus aureus and Escherichia coli

由表4可知，當(dāng)抑制時間為24 h時，ε-聚賴氨酸對金黃色葡萄球菌最小抑菌濃度為25 μg/mL；ε-聚賴氨酸對大腸桿菌的最小抑菌濃度為15 μg/mL。當(dāng)抑制時間為48 h時，ε-聚賴氨酸對金黃色葡萄球菌最小抑菌濃度為35 μg/mL，ε-聚賴氨酸對大腸桿菌的最小抑菌濃度為20 μg/mL。當(dāng)抑制時間為72 h時，ε-聚賴氨酸對金黃色葡萄球菌最小抑菌濃度為35 μg/mL；ε-聚賴氨酸對大腸桿菌的最小抑菌濃度為20 μg/mL。由此可知，ε-聚賴氨酸對大腸桿菌的最小抑菌濃度小于金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度。

2.3 Checkerboard法測試抑菌效果

2.3.1 殼聚糖和ε-聚賴氨酸復(fù)配溶液對金黃色葡萄球菌的影響

采用Checkerboard法評價殼聚糖和ε-聚賴氨酸的復(fù)配溶液對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌效果，并根據(jù)FICI指數(shù)預(yù)測殼聚糖和ε-聚賴氨酸之間的相互抑菌作用的類型。殼聚糖和ε-聚賴氨酸復(fù)配溶液對金黃色葡萄球菌的抑菌效果見表5。

表5 殼聚糖和ε-聚賴氨酸復(fù)配溶液對金黃色葡萄球菌的抑菌效果Table 5 The antibacterial activity of the combination of chitosan and ε-polylysine against Staphylococcus aureus

由表5可知，當(dāng)抑制時間為24、48 h時，殼聚糖和ε-聚賴氨酸的 FICI值為 1.01～1.29（1＜FICI≤2），由此提示殼聚糖對金黃色葡萄球菌的相互作用的類型為無關(guān)效應(yīng)。當(dāng)抑制時間為72 h時，殼聚糖和ε-聚賴氨酸復(fù)配溶液對金黃色葡萄球菌具有疊加抑菌的作用（0.5＜FICI≤1）。由此可知：當(dāng)抑制時間為72 h時，16 μg/mL ε-聚賴氨酸和 100 μg/mL 殼聚糖的復(fù)配溶液對金黃色葡萄球菌的抑制作用最佳。

2.3.2 殼聚糖和ε-聚賴氨酸對大腸桿菌的影響

殼聚糖和ε-聚賴氨酸復(fù)配溶液對大腸桿菌的抑菌效果見表6。

由表6可知，當(dāng)抑制時間為48、72 h時，殼聚糖和ε-聚賴氨酸復(fù)配溶液對大腸桿菌均具有疊加抑菌的作用（0.5＜FICI≤1）。與抑制時間24 h相比，在抑制時間為48、72 h條件下，殼聚糖和ε-聚賴氨酸復(fù)配溶液對大腸桿菌疊加抑菌作用更加穩(wěn)定。由此可知，抑制時間為 72 h 時，6 μg/mL ε-聚賴氨酸和 100 μg/mL 殼聚糖的復(fù)配溶液對大腸桿菌的抑制作用最佳。

表6 殼聚糖和ε-聚賴氨酸復(fù)配溶液對大腸桿菌的抑菌效果Table 6 The antibacterial activity of the combination of chitosan and ε-polylysine against Escherichia coli

2.3.3 不同抑菌劑對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌蛋白質(zhì)泄漏量的影響

不同抑菌劑對金黃色葡萄球菌的蛋白質(zhì)泄漏量的影響見圖1。

通過測定蛋白質(zhì)的泄漏可以用于評價抑菌劑的抑菌效果。由圖1可知，殼聚糖、ε-聚賴氨酸及殼聚糖和ε-聚賴氨酸復(fù)配溶液對金黃色葡萄球菌的蛋白質(zhì)泄漏量顯著高于空白對照組（P<0.05）。由此可知，殼聚糖、ε-聚賴氨酸及其復(fù)配溶液能夠?qū)е陆瘘S色葡萄球菌的蛋白質(zhì)發(fā)生泄漏，由此導(dǎo)致金黃色葡萄球菌的失活。殼聚糖和ε-聚賴氨酸復(fù)配溶液導(dǎo)致的金黃色葡萄球菌蛋白質(zhì)泄漏作用顯著高于單獨使用殼聚糖和ε-聚賴氨酸（P<0.05）。由此可知，殼聚糖和ε-聚賴氨酸復(fù)配溶液對金黃色葡萄球菌的抑菌活性強于殼聚糖和ε-聚賴氨酸單獨使用的抑菌效果。

圖1 不同抑菌劑對金黃色葡萄球菌的蛋白質(zhì)泄露量的影響Fig.1 Effect of different preservative on the protein released from Staphylococcus aureus

不同抑菌劑對大腸桿菌的蛋白質(zhì)泄漏量的影響見圖2。

圖2 不同抑菌劑對大腸桿菌的蛋白質(zhì)泄漏量的影響Fig.2 Effect of different preservative on the protein released from Escherichia coli

由圖2可知，殼聚糖、ε-聚賴氨酸及殼聚糖和ε-聚賴氨酸復(fù)配溶液對大腸桿菌的蛋白質(zhì)泄漏量顯著高于空白對照組（P<0.05）。由此可知，殼聚糖、ε-聚賴氨酸及其復(fù)配溶液能夠?qū)е麓竽c桿菌的蛋白質(zhì)發(fā)生泄漏，導(dǎo)致大腸桿菌失活。殼聚糖和ε-聚賴氨酸復(fù)配溶液導(dǎo)致的大腸桿菌的蛋白質(zhì)泄漏量顯著高于單獨使用殼聚糖和ε-聚賴氨酸（P<0.05）。

3 討論與結(jié)論

殼聚糖和ε-聚賴氨酸復(fù)配溶液會產(chǎn)生聚合物，增加微生物蛋白質(zhì)的泄漏量，使微生物失活，兩者對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有疊加抑菌作用。6 μg/mL ε-聚賴氨酸和100 μg/mL殼聚糖的復(fù)配溶液對大腸桿菌的抑制作用最佳。16 μg/mL ε-聚賴氨酸和 100 μg/mL殼聚糖的復(fù)配溶液對金黃色葡萄球菌的抑制作用最佳。葉青青等[21]研究發(fā)現(xiàn)殼聚糖/聚賴氨酸復(fù)合膜對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有抑菌作用，試驗結(jié)果與本研究結(jié)果一致。通過研究殼聚糖及ε-聚賴氨酸的復(fù)配溶液的抑菌效果，改變過去單一的保鮮方式，提高殼聚糖成膜的均勻性，增加ε-聚賴氨酸保鮮抑菌效果，為兩者在天然食品防腐劑中的配合應(yīng)用提供了理論參考。