魏晴，梁珊珊，3，孫慶文

（1.貴州中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州中醫(yī)藥大學(xué) 大果木姜子研究中心，貴州 貴陽(yáng) 550025；3.貴州中醫(yī)藥大學(xué) 植物多糖研究中心，貴州 貴陽(yáng) 550025）

大果木姜子是樟科樟屬米槁（Cinnamomum migao H.W.Li）的干燥成熟果實(shí)，主要分布在我國(guó)西南地區(qū)，如貴州、云南和廣西等地[1-2]，具有溫中散寒、理氣止痛的治療作用。可用于治療胃痛、腹痛、胸痛等疾病[3]。大果木姜子在貴州是一種藥食兩用的植物，大果木姜子油常用于調(diào)味、去腥。而近年來(lái)研究表明大果木姜子具有抗心肌缺血、抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用，以大果木姜子作為原料制成的中成藥在臨床中有很好的治療作用[3-4]。此外，大果木姜子常用于治療胃潰瘍，已經(jīng)有數(shù)百年歷史，且效果顯著。

近年來(lái)研究主要集中在大果木姜子的藥理作用上，而對(duì)大果木姜子成分及提取工藝的研究未見(jiàn)報(bào)道[5-8]。傳統(tǒng)的提取方法存在耗時(shí)長(zhǎng)、溶劑使用量大、工藝復(fù)雜等弊端，不利于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)；而超聲輔助提取法具有操作簡(jiǎn)單、超聲時(shí)間短、節(jié)省溶劑、提取效率高等優(yōu)點(diǎn)，有利于大果木姜子的提取規(guī)?；彤a(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。多糖被認(rèn)為是生命科學(xué)中生物基材料（例如食品、化妝品、醫(yī)療設(shè)備和藥物）生產(chǎn)的關(guān)鍵成分[9]。在過(guò)去的幾十年中，多糖的生物活性已在生物化學(xué)和醫(yī)學(xué)中引起越來(lái)越多的關(guān)注。在各種天然抗氧化劑中，多糖通常具有強(qiáng)抗氧化活性?？寡趸饔檬嵌嗵堑闹饕纳锘钚灾?，多糖可以作為新型潛在的抗氧化劑而被探索[10-11]。大果木姜子抗氧化活性的研究目前尚未報(bào)道[12]，因此本文采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化大果木姜子多糖的提取工藝，并對(duì)多糖的抗氧化活性進(jìn)行了研究，為大果木姜子深度開(kāi)發(fā)提供了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

DR3900臺(tái)式可見(jiàn)分光光度計(jì)：美國(guó)哈希公司；ES-A分析天平：天津市德安特傳感技術(shù)有限公司；BKE-1006HT小型超聲波清洗儀：山東博可超聲設(shè)備有限公司。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、DPPH：美國(guó)默克公司。其它化學(xué)試劑均為分析純?cè)噭?/p>

1.2 材料

大果木姜子：采摘自貴州省黔南州羅甸縣壩碰村，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院孫慶文教授鑒定為樟科樟屬植物米槁（Cinnamomum migao H.W.Li）的干燥成熟果實(shí)。

1.3 方法

1.3.1 樣品的前處理

將新鮮的大果木姜子置于陰涼處快速晾干，防止發(fā)霉，除去雜質(zhì)，粉碎，過(guò)篩，即得大果木姜子粉末。

1.3.2 超聲輔助提取的單因素試驗(yàn)

分別稱(chēng)取大果木姜子粉末5 g，以液料比、提取功率和超聲時(shí)間為考察因素，考察不同單因素對(duì)多糖得率的影響。按照固定2個(gè)條件，考察另一個(gè)因素對(duì)多糖得率的影響程度，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，測(cè)定多糖得率。固定液料比20∶1（mL/g），提取功率80 W，考察超聲時(shí)間在 25、30、35、40、45、50 min 時(shí)對(duì)多糖得率的影響；固定液料比 20∶1（mL/g），超聲時(shí)間 30 min，考察提取功率在 20、40、60、80、100、120 W 時(shí)對(duì)多糖得率的影響；固定提取功率80 W，超聲時(shí)間30 min，考察液料比在 10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1（mL/g）時(shí)對(duì)多糖得率的影響。

1.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)3個(gè)影響因素進(jìn)行三因素三水平試驗(yàn)，試驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)中方法進(jìn)行設(shè)計(jì)[13]，表1為響應(yīng)面因子水平及編碼。

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素水平及編碼Table 1 Response surface design test factor level and coding

1.3.4 多糖得率的測(cè)定

通過(guò)參考文獻(xiàn)中的方法得到葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為Y=7.999 8x+0.069 9，R2=0.999 6，樣品多糖得率的測(cè)定參考文獻(xiàn)[14]的方法。

1.3.5 大果木姜子多糖抗氧化活性研究

樣品前處理參考文獻(xiàn)[15]的方法，將溶液稀釋分別得到 40、80、160、320、640、1 280 μg/mL 的待測(cè)樣品溶液。大果木姜子對(duì)DPPH自由基清除能力[15-16]、對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用[17-18]和對(duì)羥基自由基的清除作用[19]分別參考文獻(xiàn)中的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

將測(cè)得的數(shù)據(jù)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)算，運(yùn)用Design-Expert 8.0.7軟件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

超聲時(shí)間對(duì)大果木姜子多糖得率的影響見(jiàn)圖1。

圖1 超聲時(shí)間對(duì)大果木姜子多糖得率的影響Fig.1 The effect of ultrasonic time on the yield of polysaccharides

由圖1可知，固定液料比和提取功率，改變超聲時(shí)間，大果木姜子多糖得率在35 min達(dá)到最高值，多糖得率為5.54%，35 min后多糖得率顯著下降，可能是隨著超聲時(shí)間增加，大果木姜子中其他易溶于水的成分也被提取出來(lái)，使多糖在溶液中的占比下降，在45 min后水提液達(dá)到飽和，無(wú)更多成分被提取出來(lái)。

提取功率對(duì)大果木姜子多糖得率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 提取功率對(duì)大果木姜子多糖得率的影響Fig.2 The effect of extraction power on the yield of polysaccharides

由圖2可知，固定液料比和超聲時(shí)間，改變提取功率，大果木姜子多糖得率在80 W達(dá)到峰值，多糖得率為5.13%，當(dāng)提取功率超過(guò)80 W后，多糖得率顯著下降，可能是隨著提取功率增大，超聲波對(duì)多糖連接的鍵起到破壞作用，使得多糖結(jié)構(gòu)破碎，得率下降。

液料比對(duì)大果木姜子多糖得率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 液料比對(duì)大果木姜子多糖得率的影響Fig.3 The effect of material-liquid ratio on the yield of polysaccharides

由圖3可知，固定超聲時(shí)間和提取功率，改變液料比，大果木姜子多糖得率在40∶1（mL/g）時(shí)達(dá)到最高值5.79%，當(dāng)液料比超過(guò)40∶1（mL/g）后多糖得率顯著下降，可能原因是溶劑量過(guò)大，雜質(zhì)分子被溶出，與多糖分子競(jìng)爭(zhēng)溶出空間導(dǎo)致得率下降。

2.2 響應(yīng)面方案與試驗(yàn)結(jié)果

利用響應(yīng)面軟件Design Expert 8.0.7設(shè)計(jì)三因素三水平的試驗(yàn)，設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見(jiàn)表2，測(cè)定多糖得率，得到回歸模型方差分析見(jiàn)表3。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Response surface design and results

表3 響應(yīng)面二次模型多糖得率的方差和回歸系數(shù)分析Table 3 Analysis of variance and regression coefficient of polysaccharide yield in response surface quadratic model

將自變量超聲時(shí)間（A）、提取功率（B）、液料比（C）與大果木姜子多糖得率（Y）的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到二次多元回歸方程如下。

由表3可知，矯正系數(shù)R2Adj=0.956 3，預(yù)測(cè)復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.963 7，預(yù)測(cè)相關(guān)系數(shù)R2（Pred）=0.956 3與預(yù)測(cè)復(fù)相關(guān)系數(shù)接近，說(shuō)明擬合度比較好。失擬項(xiàng)P=0.5125>0.05，表明差異不顯著，變異系數(shù)C.V.%為3.94%，說(shuō)明選擇的模型對(duì)該試驗(yàn)的擬合度較好。由表3可知，3個(gè)因素對(duì)大果木姜子多糖得率的影響程度的大小順序?yàn)樘崛」β?超聲時(shí)間＞液料比。

2.3 響應(yīng)面分析

當(dāng)液料比固定時(shí)，提取功率與超聲時(shí)間相互作用見(jiàn)圖4。

圖4 超聲時(shí)間和提取功率對(duì)多糖得率響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface graph of ultrasonic time and extraction power versus polysaccharide yield

由圖4可知，在提取功率一定時(shí)，隨著超聲時(shí)間的變化，多糖得率先增大后趨于平緩，但響應(yīng)面坡度不明顯；在超聲時(shí)間一定時(shí)，隨著提取功率的變化，多糖得率先增加再降低，響應(yīng)面坡度較大。

當(dāng)提取功率固定時(shí)，超聲時(shí)間和液料比相互作用見(jiàn)圖5。

圖5 超聲時(shí)間和液料比對(duì)多糖得率響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface graph of ultrasonic time and materialliquid ratio versus polysaccharide yield

由圖5可知，在液料比一定時(shí)，隨著超聲時(shí)間的變化，多糖得率變化不大，響應(yīng)面坡度較平緩，先增加后趨于平緩；在超聲時(shí)間一定時(shí)，隨著液料比的變化，多糖得率先顯著增加后顯著降低，響應(yīng)面坡度較陡峭。

當(dāng)超聲時(shí)間固定時(shí)，提取功率和液料比相互作用見(jiàn)圖6。

圖6 液料比和提取功率對(duì)多糖得率的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface diagram of the ratio of material to liquid and extraction power to the yield of polysaccharide

由圖6可知，在提取功率一定時(shí)，隨著液料比的變化，多糖得率先增大后顯著降低，響應(yīng)面坡度較大；在液料比一定時(shí)，隨著提取功率的改變，多糖得率先顯著增加后降低，但降低的不明顯，響應(yīng)面坡度較大，液料比和提取功率的交互作用顯著。

2.4 優(yōu)化與驗(yàn)證試驗(yàn)

經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化后最優(yōu)條件為超聲時(shí)間35.12min、提取功率 80.64 W、液料比 40.16∶1（mL/g），多糖得率為5.99%。依據(jù)實(shí)際操作條件，將工藝修正為超聲時(shí)間35 min、提取功率80 W、液料比 40∶1（mL/g），得到實(shí)測(cè)多糖得率為5.92%。實(shí)際值與預(yù)測(cè)值之間相差較小，驗(yàn)證了該響應(yīng)面模型的有效性。因此，響應(yīng)面法對(duì)大果木姜子多糖最佳優(yōu)化工藝為超聲時(shí)間35 min、提取功率 80 W、液料比 40∶1（mL/g）。

2.5 大果木姜子多糖抗氧化活性結(jié)果

大果木姜子多糖抗氧化作用結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 大果木姜子多糖抗氧化作用Table 4 Antioxidant effect of Cinnamomum migao H.W.Li polysaccharide

由表4可知，大果木姜子多糖對(duì)DPPH自由基的最大清除率為92.88%，經(jīng)計(jì)算IC50為219.60 μg/mL。對(duì)超氧陰離子自由基最大清除率為91.89%，IC50為244.37 μg/mL。對(duì)羥基自由基的最大清除率為90.23%，IC50為258.26 μg/mL。因此，大果木姜子多糖有一定的抗氧化活性。研究表明，抗氧化療法可以在治療疾病中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在潛在的藥物資源中，植物多糖是天然抗氧化成分，其應(yīng)用歷史悠久，廣泛的可獲得性以及食用的副作用小，被認(rèn)為對(duì)人體健康至關(guān)重要[20]。在實(shí)驗(yàn)室研究和臨床研究中，多種疾病模型均顯示出植物多糖具有抗氧化性、抗炎癥、促進(jìn)細(xì)胞活力、免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤的功能[21-22]。

多糖發(fā)揮抗氧化作用機(jī)制之一是由于多糖中含有大量的氫離子，氫可以與自由基結(jié)合形成穩(wěn)定的自由基以終止自由基鏈反應(yīng)。多糖還可以通過(guò)降低脂質(zhì)過(guò)氧化（lipid peroxidation，LPO）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）的水平發(fā)揮抗氧化作用[23]。此外，多糖還可以在體外與自由基發(fā)生反應(yīng)，從而終止自由基鏈反應(yīng)。通過(guò)增強(qiáng)過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）活性來(lái)增強(qiáng)抗氧化活性，催化H2O2的分解[24]。多糖可以防止谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）消耗，并增加超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性。最后，多糖還可以刺激產(chǎn)生自由基酶的合成，建立氧化還原循環(huán)來(lái)保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的影響[25]。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)利用超聲輔助提取法獲得大果木姜子多糖，通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化了多糖的提取工藝。研究表明最佳超聲輔助提取工藝條件為超聲時(shí)間35 min、提取功率 80 W、液料比 40∶1（mL/g），多糖得率為5.92%。此外，大果木姜子多糖還具有較強(qiáng)的抗氧化能力。

綜上所述，大果木姜子多糖可通過(guò)超聲方法優(yōu)化提取，大果木姜子多糖還表現(xiàn)出較強(qiáng)的體外抗氧化能力，本研究為大果木姜子新產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供了理論依據(jù)。