張永濤，趙丹，安全，張佳嬋，王昌濤，3，李萌*

（1.北京工商大學(xué) 化學(xué)與材料工程學(xué)院 北京市植物資源研究開發(fā)重點實驗室，北京 100048；2.云南白藥集團股份有限公司，云南 昆明 650504；3.北京工商大學(xué) 北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京 100048）

青刺果（Prinsepia utilis Royle）又名青刺尖、打油果等，是薔薇科扁核木屬植物總花扁核的果實，主要生長在四川、貴州、云南和西藏等地區(qū)。青刺果常用于治療皮膚燒傷、跌打損傷、攻毒、活血、祛瘀等[1]。現(xiàn)代研究表明，青刺果內(nèi)富含黃酮和多酚類化合物[2]，具有較好的抗氧化、降血糖血脂、抗炎等功效[3-6]，因此青刺果的提取成分多被用于藥品、食品和化妝品中[7-8]。

紫外線（ultraviolet，UV）是導(dǎo)致皮膚衰老、損傷重要的原因之一，尤其是在長期的長波紫外線（ultraviolet A，UVA）（320 nm～400 nm）輻照下會對皮膚真皮層造成細胞損傷，導(dǎo)致皮膚發(fā)生光損傷、光老化甚至光致癌[9-10]。研究發(fā)現(xiàn)，UVA照射培養(yǎng)人成纖維細胞后，會使細胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平提高而產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，伴隨著抗氧化酶適應(yīng)性上調(diào)。這些抗氧化酶，尤其是過氧化氫酶（catalase，CAT）的表達，能進一步增強人成纖維細胞對UVA的光保護[11]。

已有研究表明，黃酮類化合物和多酚類化合物具有很好的抗氧化作用，對UVA損傷的人皮膚成纖維細胞（human skin fibroblasts，HSF）有很好的修復(fù)作用[12-14]。研究表明微生物發(fā)酵作為一種天然產(chǎn)物提取的方法存在降低提取物毒性、分解物質(zhì)為易吸收的小分子活性物質(zhì)或修飾物質(zhì)結(jié)構(gòu)以增強功效活性等優(yōu)點[15-17]，本研究對比了青刺果發(fā)酵液（fermentation extract of P.utilisRoyle，F(xiàn)EP）和青刺果水提液（waterextractofP.utilis Royle，WEP）中總黃酮和總多酚的含量，并分析兩者對UVA誘導(dǎo)損傷后的人皮膚成纖維細胞的修復(fù)作用，旨在分析FEP與WEP存在的差異性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青刺果：云南白藥集團股份有限公司；德氏乳桿菌保加利亞亞種（CICC 20247）：中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司；人皮膚成纖維細胞（human skin fibroblast，HSF）：中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細胞資源中心；焦性沒食子酸：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、鏈霉素、青霉素、胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）：美國 GIBCO 生命技術(shù)公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）：北京索萊寶科技有限公司；TransScriptOne-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TransStartTop Green qPCR SuperMix試劑盒：北京全式金生物技術(shù)有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、1，1-二苯基-2-苦苯肼（DPPH）：上海麥克材生化科技有限公司；Cell Counting Kit-8（CCK8）試劑盒、總抗氧化能力檢測試劑盒：百瑞極生物科技有限公司；總RNA抽提試劑盒、過氧化氫酶檢測試劑盒、活性氧檢測試劑盒：碧云天生物技術(shù)有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

恒溫水浴鍋（SY21-Ni4型）：北京市精科華瑞儀器有限公司；恒溫培養(yǎng)箱（HWS智能型）：寧波江南儀器廠；超凈工作臺（YJ－2450型）：蘇州凈化設(shè)備廠；高速臺式冷凍離心機（Sigma 3-18KS）：德國Sigma公司；電子天平（ME104E型）：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；酶標(biāo)儀（Tecan Sunrice）：帝肯（上海）貿(mào)易有限公司；超聲波細胞破碎儀（BILON-1500Y型）：上海比朗儀器制造有限公司；CO2培養(yǎng)箱（HeracellTMVIOS 250i）、實時熒光定量PCR儀（Quantudio3-Real Time）：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；TLD18WBLB無臭氧UVA燈：飛利浦中國有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 WEP的制備

稱取粒徑為50目的青刺果粉20 g，以料液比1∶15（mg/mL）加去離子水，在70℃水浴搖床中提取3 h，4 900 r/min離心15 min，取上清液過膜備用。

1.3.2 FEP的制備

稱取粒徑為50目的青刺果粉20 g，以料液比1∶15（mg/mL）加入去離子水，120℃高溫滅菌 20 min，冷卻后接入5%的德氏乳桿菌擴培菌液，在28℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)2 d后高溫滅菌20 min，4 000 r/min離心15 min，取上清液過膜備用。

1.3.3 總黃酮含量測定

參照文獻[18]的方法測定WEP和FEP中總黃酮的含量，設(shè)置 6個梯度（0.2 mg/mL～0.7 mg/mL）的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，用酶標(biāo)儀測定A510，分別以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度和吸光度為橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算回歸方程。得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.855 4x+0.000 6（R2=0.9965）。分別吸取1mL的WEP和FEP，按同樣方法進行試驗，測定A510，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計算總黃酮含量。

1.3.4 總多酚含量測定

參照文獻[19]的方法測定WEP和FEP中總多酚含量，設(shè)置焦性沒食子酸的濃度梯度，用酶標(biāo)儀測定A765，分別以沒食子酸的濃度和吸光度為橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程。得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.8591x+0.0793（R2=0.9982）。準(zhǔn)確稱取 0.5mL 的WEP和FEP，按照同樣方法進行試驗，測定A765，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計算總多酚含量。

1.3.5 DPPH自由基清除試驗

DPPH自由基清除試驗的操作方法參考文獻[20]，測定不同稀釋倍數(shù)的WEP和FEP的DPPH自由基的清除率，測定在517 nm處的吸光度，根據(jù)以下公式計算WEP和FEP的DPPH自由基清除率。

式中：A1為空白對照組吸光度；A2為待測樣品組吸光度；A3為無水乙醇和樣品溶劑對照組吸光度；A4為無水乙醇溶劑對照組吸光度。

1.3.6 細胞培養(yǎng)

將HSF細胞在含有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)。細胞保存在含5%CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d。所有細胞試驗在第3代和第6代之間的細胞基礎(chǔ)上進行。

1.3.7 UVA誘導(dǎo)損傷

將人皮膚成纖維細胞以3×105個細胞/孔的密度接種于6孔板中，在37℃的DMEM完全培養(yǎng)液中孵育24 h，倒掉培養(yǎng)液，用PBS洗滌2次，并覆蓋一層薄薄的PBS。使用配備15 W無臭氧UVA燈的UV光療儀器將HSF細胞以18 J/cm2的劑量暴露于UVA照射2.5 h。暴露于UVA后將細胞分別在含有WEP和FEP的完全培養(yǎng)基中再培養(yǎng)24 h。

1.3.8 細胞活性測定

取對數(shù)生長期的HSF細胞用0.05%的胰酶消化細胞2 min～5 min，用DMEM完全培養(yǎng)液停止胰酶消化，經(jīng)離心稀釋成細胞濃度大約為8×104個細胞/mL～1×105個細胞/mL 細胞懸液，以 100 μL/孔接種于 96 孔板中（每孔8×103個～1×104個細胞），空白孔每孔 100μL PBS，培養(yǎng)12 h，倒掉培養(yǎng)液，用PBS洗滌2次，設(shè)置6組平行，每孔加入100 μL配制好的6個濃度梯度的樣品溶液 （0.125%、0.25%、0.50%、1.00%、2.00%、5.00%），對照組加100 μL無血清的DMEM，空白孔加100 μL PBS，培養(yǎng)24 h；倒掉培養(yǎng)液，用 PBS洗滌 2次，所有孔加入100 μL無血清DMEM和10 μLCCK8試液，孵育2 h～3 h，用酶標(biāo)儀測定A450。UVA誘導(dǎo)損傷模型組按以上同樣的方法，測定A450。按照以下公式計算細胞存活率。

式中：A1為樣品組吸光度；A2為對照組吸光度；A3為空白組吸光度。

1.3.9 HSF細胞內(nèi)ROS水平測定

按檢測試劑盒中方法測定細胞內(nèi)ROS含量。暴露于UVA后的HSF用體積分?jǐn)?shù)分別為0.50%、1.00%、2.00%的WEP和FEP的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，倒掉樣品溶液并用PBS清洗2次，后續(xù)步驟按照試劑盒給定的方法進行操作，并使用熒光酶標(biāo)儀在488 nm激發(fā)波長和525 nm發(fā)射波長處檢測WEP和FEP處理后細胞內(nèi)ROS的熒光強度。

1.3.10 HSF細胞抗氧化能力測定

按照總抗氧化能力檢測試劑盒測定FEP和WEP對UVA誘導(dǎo)損傷后HSF細胞的總抗氧化能力。根據(jù)樣品對細胞存活率的影響結(jié)果，最終選擇體積分?jǐn)?shù)為5.00%、2.00%、1.00%的青刺果發(fā)酵液，作用于UVA誘導(dǎo)損傷的HSF細胞24 h，收集約1×106個細胞，在200 μL PBS中，用超聲充分破碎細胞，釋放HSF中的抗氧化物，4℃下12 000×g離心5 min，取上清液用于后續(xù)測定。按照總抗氧化能力檢測試劑盒給定的方法進行試驗操作，最后用酶標(biāo)儀測定A734，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品的總抗氧化能力。

1.3.11 HSF細胞內(nèi)CAT活力測定

按照過氧化氫酶檢測試劑盒給定的方法，分別配制濃度分別為 0、0.625、1.25、2.5、3.75 mmol/L 的過氧化氫溶液，各取4 μL和200 μL顯色工作液加入96孔板中，在25℃下至少孵育15 min后用酶標(biāo)儀測定A520，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別取4 μL經(jīng)青刺果水提液和發(fā)酵液處理24 h的細胞裂解液于1.5 mL離心管中，加入37 μL過氧化氫酶檢測緩沖液和10 μL 250 mmol/L過氧化氫，充分混勻后反應(yīng)5 min，加入450 μL過氧化氫酶反應(yīng)終止液，充分混勻以終止反應(yīng)。在離心管中加入40 μL過氧化氫酶檢測緩沖液和10 μL已終止并混勻的反應(yīng)體系，混勻，在25℃條件下孵育15 min后，利用酶標(biāo)儀測定A520，并用試劑盒方式計算過氧化氫酶活力。

1.3.12 總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄

按照總RNA抽提試劑和反轉(zhuǎn)錄試劑盒中的要求進行RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄試驗。

1.3.13 引物及探針的設(shè)計和合成

根據(jù)美國國家生物信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI） 發(fā)布的序列基因，用Primer Express軟件設(shè)計出目的基因的特異性引物（包含管家基因β-actin），如表1所示。

表1 實時熒光定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences for real-time PCR

1.3.14 實時熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）

1.4 數(shù)據(jù)處理

本研究中的試驗數(shù)據(jù)均利用Prism9軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析處理，組間比較采用單因素ANOVA分析，兩兩比較采用t檢驗，以p＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，所得結(jié)果以（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 WEP和FEP中總黃酮和總多酚含量

WEP和FEP中總黃酮、總多酚含量測定結(jié)果見圖1。

圖1 WEP和FEP中總黃酮及總多酚含量Fig.1 The content of total flavonoids and total polyphenols in WEP and FEP

由圖1所示，WEP總黃酮含量為（3.73±0.25）μg/mL，總多酚含量為（4.54±0.22）μg/mL；FEP中，總黃酮含量為 （7.24±0.19）μg/mL，總多酚的含量為（8.89±0.21）μg/mL。FEP中總黃酮和總多酚的含量均高于WEP，且存在高度顯著的差異性（p<0.001）。

2.2 WEP和FEP體外抗氧化能力

WEP和FEP對DPPH自由基清除率如圖2所示。

圖2 WEP和FEP體外抗氧化能力Fig.2 In vitro antioxidant capacity of WEP and FEP

由圖2A可知，WEP和FEP在稀釋0到15倍之間，均具有很高的DPPH自由基清除率，未有明顯的差別，隨著稀釋倍數(shù)的加大，二者對DPPH自由基清除能力的差異也越來越顯著，由圖2B可知，當(dāng)DPPH自由基清除率在50%時，WEP和FEP的稀釋倍數(shù)分別為54.797倍和86.446倍，F(xiàn)EP是WEP的1.58倍。由此可見，F(xiàn)EP的DPPH自由基清除能力明顯強于WEP。

2.3 WEP和FEP對UVA誘導(dǎo)損傷的HSF模型的修復(fù)作用

2.3.1 WEP和FEP對HSF細胞活性的影響

WEP和FEP對HSF細胞活性的影響如圖3所示。

圖3 WEP和FEP對HSF細胞活性的影響Fig.3 Effects of WEP and FEP on HSF cell activity

由圖3 A可知，當(dāng)樣品濃度在0%～2%時，細胞存活率在85%以上，濃度為0.25%和0.5%時，WEP和FEP之間存在極顯著（p<0.01）和高度顯著的差異（p<0.001）。由圖3B可知，F(xiàn)EP的80%最大效應(yīng)濃度比WEP高，可見FEP對細胞的毒性更低；由圖3C可知，不同濃度的WEP和FEP對UVA損傷后的HSF細胞都有不同程度的修復(fù)作用?？傮w來看，F(xiàn)EP對HSF細胞的毒性和修復(fù)能力更強。并按照結(jié)果綜合分析選擇了3個濃度進行后續(xù)試驗，分別為0.5%、1.0%和2.0%。

2.3.2 WEP和FEP對HSF內(nèi)ROS水平的影響

在探究WEP和FEP對UVA誘導(dǎo)的損傷后HSF的抗氧化作用中，分別使用0.50%、1.00%、2.00%的WEP和FEP處理UVA誘導(dǎo)的損傷后的HSF細胞，使用活性氧檢測試劑盒檢測HSF細胞中的ROS含量，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，空白對照組ROS水平高度顯著低于UVA誘導(dǎo)損傷后的ROS水平（p<0.001）；而樣品組相比于UVA模型組，WEP和FEP均顯著降低了UVA誘導(dǎo)損傷后HSF內(nèi)ROS水平；并且在濃度為0.50%和1.00%時，F(xiàn)EP與WEP分別存在高度顯著差異（p<0.001）和極顯著差異（p<0.01）。結(jié)果表明，F(xiàn)EP 在降低UVA誘導(dǎo)損傷的HSF內(nèi)ROS水平的能力強于WEP。

圖4 WEP和FEP對UVA誘導(dǎo)損傷的HSF內(nèi)ROS水平的影響Fig.4 The effect of WEP and FEP on the level of ROS in HSF induced by UVA

2.3.3 WEP和FEP對細胞總抗氧化能力的影響

考察3個濃度的WEP和FEP對UVA誘導(dǎo)損傷的HSF的總抗氧化能力，結(jié)果如圖5所示。

圖5 WEP和FEP對UVA誘導(dǎo)損傷的HSF總抗氧化能力的影響Fig.5 The effect of WEP and FEP on the total antioxidant capacity of UVA-induced damage to HSF

由圖5可知，與UVA損傷模型相比，WEP只有在1.0%時有統(tǒng)計學(xué)差異（p<0.05），而不同濃度的FEP都存在顯著性差異（p<0.01，p<0.001），由此表明，F(xiàn)EP 的總抗氧化能力明顯強于WEP。

2.3.4 WEP和FEP對HSF內(nèi)CAT酶活性的影響

考察3個濃度的WEP和FEP對UVA損傷后的HSF的過氧化氫酶活力的影響，結(jié)果如圖6所示。

圖6 WEP和FEP對UVA誘導(dǎo)損傷的HSF內(nèi)過氧化氫酶活性的影響Fig.6 The effect of WEP and FEP on catalase activity in HSF induced by UVA

由圖6可知，相比于UVA模型組，WEP和FEP能高度顯著促進過氧化氫酶活力（p<0.001）；并且在0.5%和1.0%時WEP和FEP相比對過氧化氫酶活力的促進作用分別有極顯著差異（p<0.01）和高度顯著差異（p<0.001），即FEP對損傷后HSF的過氧化氫酶活力有更強的促進作用。

2.3.5 WEP和FEP對HSF內(nèi)CAT mRNA表達水平的影響

通過實時熒光定量PCR對過氧化氫酶mRNA的表達水平的分析，結(jié)果如圖7所示，

圖7 WEP和FEP對UVA誘導(dǎo)損傷的HSF內(nèi)過氧化氫酶表達水平的影響Fig.7 The effect of WEP and FEP on the expression level of catalase in HSF with UVA-induced damage

由圖7可知，空白對照組細胞內(nèi)過氧化氫酶mRNA的表達水平高度顯著于UVA誘導(dǎo)損傷的細胞。而樣品組相比于UVA模型組，WEP和FEP對過氧化氫酶mRNA的表達水平的提升都有高度顯著作用（p<0.001）。WEP和FEP對提升過氧化氫酶表達作用在濃度為1.0%時有顯著差異（p<0.05），在濃度為2.0%時存在極顯著差異（p<0.01），在濃度為0.5%時存在高度顯著差異（p<0.001）。由此可知，F(xiàn)EP對提升過氧化氫酶表達的作用更強。

3 結(jié)論

本試驗分別通過微生物發(fā)酵法和水提取法制得青刺果提取物FEP和WEP，F(xiàn)EP中總黃酮和總多酚的含量分別達到了（7.24±0.19）、（8.89±0.21）μg/mL，約為水提液含量的兩倍左右。通過體外抗氧化和細胞試驗表明WEP和FEP均具有較高的自由基清除能力，能提高氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細胞存活率。通過細胞試驗發(fā)現(xiàn)青刺果提取物也可以降低HSF內(nèi)ROS水平和提高過氧化氫酶活性和mRNA的表達水平以增強損傷細胞的總抗氧化能力，修復(fù)UVA誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷。但與WEP相比，F(xiàn)EP的抗氧化能力以及對UVA誘導(dǎo)損傷的HSF的修復(fù)能力更為顯著。