趙 妮 謝新榮 趙巧玲 鐘慕賢 黃普好

(廣西醫(yī)科大學(xué)附屬民族醫(yī)院，廣西 南寧 530021)

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胰高血糖素樣肽-1對(duì)糖尿病大鼠胰島素敏感性及心肌微血管的保護(hù)作用

趙 妮 謝新榮 趙巧玲 鐘慕賢 黃普好

(廣西醫(yī)科大學(xué)附屬民族醫(yī)院，廣西 南寧 530021)

目的 探討胰高血糖素樣肽-1對(duì)糖尿病大鼠胰島素敏感性及心肌微血管的保護(hù)作用。方法 24只成年雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照(NC)組(n=8)、2型糖尿病(T2DM)組(n=8)、T2DM加胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)干預(yù)組(n=8)，對(duì)比GLP-1對(duì)各組大鼠葡萄糖輸注率、胰島素濃度的影響以及三組大鼠心肌微血管完整性和通透性。結(jié)果 各組大鼠的葡萄糖輸注率均于60.0 min時(shí)趨向于基本穩(wěn)定狀態(tài)，此前T2DM+GLP-1組和T2DM組的輸注率增長(zhǎng)趨勢(shì)低于NC組；在120.0 min后T2DM組葡萄糖輸注率與NC組相比下降幅度約為53.0%(P<0.05)；與NC組相比，T2DM+GLP-1組葡萄糖輸注率有所降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與T2DM組相比，T2DM+GLP-1組葡萄糖輸注率上升約為50.8%(P<0.05)，T2DM+GLP-1組葡萄糖輸注率有所增高，但未上升至正常水平；實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)各組大鼠胰島素水平均呈現(xiàn)持續(xù)上升趨勢(shì)，三組大鼠間胰島素濃度增加趨勢(shì)及同一時(shí)間點(diǎn)胰島素濃度均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；NC組心肌微血管鑄型較為平滑，且未出現(xiàn)明顯的凹凸不平，表明無(wú)破壞發(fā)生，T2DM組心肌微血管鑄型出現(xiàn)顯著凹凸不平現(xiàn)象，且內(nèi)皮連接完整性較差，T2DM+GLP-1組心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞連接完整度明顯優(yōu)于T2DM組；NC組心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞連接完整，未出現(xiàn)鑭顆粒進(jìn)入基底膜現(xiàn)象，T2DM組鑭顆粒可輕易透過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)入基底膜及其周邊組織，T2DM+GLP-1組僅有少量鑭顆粒進(jìn)入基底膜。結(jié)論 GLP-1可改善糖尿病患者胰島素敏感性，并對(duì)心肌微血管產(chǎn)生保護(hù)作用。

胰高血糖素樣肽-1；糖尿病；胰島素敏感性；心肌微血管

有學(xué)者認(rèn)為分泌缺陷及胰島素抵抗的病理機(jī)制是誘發(fā)2型糖尿病(T2DM)的重要原因〔1，2〕。因此，治療及預(yù)防T2DM的關(guān)鍵在于改善胰島素抵抗癥狀。人體內(nèi)脂肪、肝臟等是存儲(chǔ)與利用葡萄糖的重要臟器，這些部位胰島素敏感性降低，會(huì)減少對(duì)葡萄糖攝取作用，發(fā)生胰島素抵抗。心肌缺血再灌注損傷、糖尿病性心肌病的發(fā)生與心肌微血管損傷密切相關(guān)〔3〕。胰高血糖素樣肽(GLP)-1不僅可改善糖尿病患者胰島素敏感性，還可對(duì)心肌微血管發(fā)揮一定保護(hù)作用〔4〕。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑 三通管、縫合線、氣管插管、止血鉗、手術(shù)剪、Milli-Q超純水系統(tǒng)、手術(shù)加熱燈、低溫離心機(jī)、MDF-382E超低溫冰箱、多功能凝膠成像化學(xué)發(fā)光儀、電熱恒溫水浴箱、酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀、血糖儀；二甲砷酸鈉、硝酸鑭、檸檬酸、檸檬酸三鈉、胰島素檢測(cè)試劑盒、戊巴比妥鈉、血糖試紙、50.0%葡萄糖注射液、抗AKt及其磷酸化抗體。

1.2 實(shí)驗(yàn)對(duì)象 選取24只成年雄性SD大鼠，體重180.0～200.0 g，平均(190.0±10.0)g。將24只SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(NC組)、T2DM組、T2DM加GLP-1干預(yù)組(T2DM+GLP-1組)每組8只。將所有大鼠放入飼養(yǎng)室進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，室溫調(diào)至(20.0±2.0)℃，濕度控制為50.0%～60.0%。7 d后NC組繼續(xù)采用普通飼料喂養(yǎng)，T2DM+GLP-1組及T2DM組采用高脂飼料飼養(yǎng)，三組大鼠均飼養(yǎng)1個(gè)月。

1.3 手術(shù) 大鼠腹腔注射1.2 mg/kg 5.0%戊巴比妥鈉，隨后將大鼠放回飼養(yǎng)室，待其靜臥不動(dòng)、掐尾無(wú)反應(yīng)且四肢松弛牽拉無(wú)張力時(shí)，表明麻醉藥物已生效。使其仰臥于操作臺(tái)，并完全固定；在大鼠頸部正中線處行長(zhǎng)度為1.0 cm的橫向切口，分離皮下組織后充分顯露氣管；通過(guò)血管鉗將氣管一端分離出來(lái)，并將環(huán)狀軟骨剪開(kāi)1/3左右，插入氣管插管并縫合固定。通過(guò)血管鉗將氣管旁肌群的軟組織及筋膜機(jī)進(jìn)行鈍性分離，直至頸動(dòng)脈；將頸內(nèi)動(dòng)脈分離1.5 cm左右，并利用縫合線對(duì)頭側(cè)進(jìn)行結(jié)扎處理；利用顯微彎頭鑷夾起頸內(nèi)動(dòng)脈，型深度為1/3左右的斜形切口，將顯微彎頭鑷插入切口并逐漸撐開(kāi)；沿開(kāi)口插入連接有針管的PE-50置入管，取出顯微彎頭鑷并縫合固定；將動(dòng)脈置管連接于裝有戊巴比妥鈉的微量注射泵。通過(guò)血管鉗對(duì)頸旁肌群、頸動(dòng)脈外側(cè)皮下組織進(jìn)行鈍性分離處理，用鑷子分離頸外靜脈，對(duì)近心端通過(guò)縫合線進(jìn)行結(jié)扎；用顯微外科剪在血管壁行深度為1/3左右的斜形切口，向近心端插入顯微外科鑷，沿鑷子走向?qū)⑦B接于注射器的PE-50置入管向內(nèi)插入3.0 cm左右，隨后結(jié)扎固定。另一側(cè)置管方法與本側(cè)相同。

1.4 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案 各組大鼠均實(shí)施高胰島素-正葡萄糖鉗夾試驗(yàn)。(1)T2DM組與NC組：向靜脈插管中泵入胰島素，輸注速度調(diào)至3.0 mU·kg-1·min-1；2.0 min后輸注葡萄糖，輸注速度為3.0 μl/min，共輸注120.0 min，每間隔10.0 min檢測(cè)一次動(dòng)脈血糖，并根據(jù)血糖水平對(duì)葡萄糖輸注速度進(jìn)行調(diào)整，將血糖水平維持在10.0%左右。分別于0.0、30.0、60.0、90.0、120.0 min時(shí)抽取動(dòng)脈血，進(jìn)行離心處理后取上清液，放入-20.0℃環(huán)境中儲(chǔ)存?zhèn)溆?，用以檢測(cè)胰島素水平。(2)T2DM+GLP-1組：于高胰島素-正葡萄糖鉗夾試驗(yàn)開(kāi)始前30.0 min時(shí)開(kāi)始輸注GLP-1，輸注速度穩(wěn)定在30.0 pmol·kg-1·min-1左右，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束終止輸注。其余實(shí)驗(yàn)過(guò)程與T2DM組及NC組相同。

1.5 血清胰島素水平檢測(cè) 采用雙抗體夾心法。

1.6 心肌微血管完整性檢測(cè) 選取各組大鼠，腹腔注射0.3%戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉處理，皮下注射700.0 U/kg肝素；30.0 min后剖開(kāi)腹腔，主動(dòng)脈內(nèi)插管，并通過(guò)K-H溶液進(jìn)行沖洗，注入樹(shù)脂；對(duì)樹(shù)脂填充組織進(jìn)行熱水浸泡處理，使其逐漸固化；利用蒸餾水與強(qiáng)堿對(duì)其進(jìn)行交互漂洗，徹底清除組織，獲取血管鑄型；以?xún)龈煞ㄊ蛊涓稍?，隨后通過(guò)掃描電鏡對(duì)其進(jìn)行觀察。

1.7 心肌微血管通透性檢測(cè) 利用Langendorff裝置，通過(guò)K-H溶液對(duì)心臟進(jìn)行恒壓灌流，待其趨于穩(wěn)定后，以硝酸鑭灌流液進(jìn)行20.0 min灌流處理；完成灌流后取大鼠左室前壁心肌組織，常規(guī)脫水、固定、包埋及切片處理后，于透射電鏡下對(duì)樣本進(jìn)行觀察。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件行t、χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 GLP-1對(duì)各組大鼠葡萄糖輸注率的影響 各組大鼠的葡萄糖輸注率均于60.0 min時(shí)趨向于基本穩(wěn)定狀態(tài)，此前T2DM+GLP-1組和T2DM組的輸注率增長(zhǎng)趨勢(shì)低于NC組，表明這兩組大鼠的葡萄糖攝取利用率低于正常大鼠(圖1A)。在120.0 min后(鉗夾試驗(yàn)結(jié)束)，T2DM組葡萄糖輸注率與NC組相比下降幅度約為53.0%左右〔(3.02±1.38)mg·kg-1·min-1、(6.51±1.72)mg·kg-1·min-1，P<0.05〕；與NC組相比，T2DM+GLP-1組葡萄糖輸注率有所降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與T2DM組相比，T2DM+GLP-1組葡萄糖輸注率上升約為50.8%〔(6.08±1.74)mg·kg-1·min-1，P<0.05〕，T2DM+GLP-1組葡萄糖輸注率有所增高，但未上升至正常水平。見(jiàn)圖1。

圖1 GLP-1對(duì)各組大鼠葡萄糖輸注率的影響

2.2 GLP-1對(duì)各組大鼠胰島素濃度的影響 實(shí)驗(yàn)0.0 min及30.0 min時(shí)T2DM+GLP-1組胰島素濃度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)各組大鼠胰島素水平均呈現(xiàn)持續(xù)上升趨勢(shì)，三組大鼠間胰島素濃度增加趨勢(shì)及同一時(shí)間點(diǎn)胰島素濃度差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 三組大鼠胰島素濃度變化

2.3 微血管鑄型檢測(cè)三組大鼠心肌微血管完整性 NC組心肌微血管鑄型較為平滑，且未出現(xiàn)明顯的凹凸不平，表明無(wú)破壞發(fā)生。T2DM組心肌微血管鑄型出現(xiàn)顯著凹凸不平現(xiàn)象，且內(nèi)皮連接完整性較差。T2DM+GLP-1組心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞連接完整度明顯優(yōu)于T2DM組。見(jiàn)圖3。

圖3 血管鑄型三組大鼠心肌微電管完整性(×400)

2.4 電鏡下觀察三組大鼠心肌微血管完整性 NC組心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞連接完整，未出現(xiàn)鑭顆粒進(jìn)入基底膜現(xiàn)象；T2DM組鑭顆?？奢p易透過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)入基底膜及其周邊組織，表明其心肌微血管屏障功能?chē)?yán)重下降；T2DM+GLP-1組僅有少量鑭顆粒進(jìn)入基底膜。見(jiàn)圖4。

圖4 電鏡下觀察心肌微血管(×400)

3 討 論

糖尿病主要發(fā)病機(jī)制為胰島素抵抗，胰島素抵抗指外周組織對(duì)胰島素敏感性降低，對(duì)葡萄糖的攝取利用率下降，因此改善胰島素抵抗對(duì)提高糖尿病治療效果具有重要意義〔5〕。與傳統(tǒng)降糖藥物相比，GLP-1生物學(xué)作用顯著，且低血糖發(fā)生率低。此外，GLP-1半衰期僅為1.5 min左右，但其受體在外周神經(jīng)系統(tǒng)、胃腸道、血管、腎、心、腦等均有分布，因此GLP-1作用范圍極為廣泛〔6〕。

有研究指出〔7〕，GLP-1主要通過(guò)抑制胰高血糖素分泌量及刺激胰島素分泌發(fā)揮降糖功效。GLP-1與β細(xì)胞膜上的受體相結(jié)合，進(jìn)而發(fā)揮促胰島素分泌活性效果，且密切依賴(lài)于葡萄糖濃度。GLP-1與其受體結(jié)合后，可對(duì)G蛋白產(chǎn)生刺激作用，活化腺苷酸環(huán)化酶后生成cAMP，而cAMP與蛋白激酶A(PKA)對(duì)鳥(niǎo)嘌呤核苷酸交換因子Ⅱ的活化進(jìn)行調(diào)節(jié)而引發(fā)一系列活動(dòng)，如含胰島素顆粒的胞吐作用、細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增高、離子通道活性改變等〔8，9〕。另有研究表明〔10〕，GLP-1可對(duì)cAMP幅度及β細(xì)胞中的鈣進(jìn)行直接刺激調(diào)節(jié)作用，這些作用均是經(jīng)葡萄糖濃度增強(qiáng)。GLP-1受體在葡萄糖的脂肪、肝臟和肌肉等重要攝取部位中也有一定表達(dá)，葡萄糖存儲(chǔ)及利用的最大器官為骨骼肌，骨骼肌中分布大量微血管，確保肌纖維可獲取充足能力。有研究發(fā)現(xiàn)〔11〕，對(duì)正常SD大鼠注射胰島素后，骨骼肌葡萄糖攝取率得到抑制。鉗夾試驗(yàn)時(shí)，通過(guò)對(duì)葡萄糖輸注率不斷調(diào)節(jié)以及不斷泵入高濃度胰島素可將血糖水平維持與基本水平，而GLP-1對(duì)β細(xì)胞產(chǎn)生的促胰島素釋放功效主要依賴(lài)葡萄糖濃度的升高，因此未升高的血糖水平不會(huì)導(dǎo)致GLP-1對(duì)β細(xì)胞分泌胰島素產(chǎn)生刺激作用。此外，T2DM組心肌微血管完整性及通透性較差，而經(jīng)GLP-1處理的T2DM+GLP-1組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性與通透性得到了顯著改善，接近于NC組。臨床學(xué)者認(rèn)為〔12〕，GLP-1對(duì)心血管具有保護(hù)作用，可改善內(nèi)皮功能、緩解缺血再灌注損傷。綜上，胰高血糖素樣肽-1可改善糖尿病患者胰島素敏感性，并對(duì)心肌微血管產(chǎn)生保護(hù)作用。

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〔2015-12-11修回〕

(編輯 袁左鳴)

趙 妮(1979-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事內(nèi)分泌代謝性疾病研究。

R587

A

1005-9202(2016)21-5267-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.21.023