廉志成, 劉 博, 劉太國, 高 利, 陳萬權

(中國農業(yè)科學院植物保護研究所,植物病蟲害生物學國家重點實驗室, 北京 100193)

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2010-2011年小麥條銹菌群體的溫度敏感性與毒性及遺傳多樣性的關系

廉志成, 劉 博*, 劉太國, 高 利, 陳萬權*

(中國農業(yè)科學院植物保護研究所,植物病蟲害生物學國家重點實驗室, 北京 100193)

為了明確小麥條銹菌毒性、遺傳多樣性以及溫度敏感性三者之間的關系,本研究利用21個已知抗條銹病基因近等基因品系對2010-2011年生長季采自6個省市78株已知溫度敏感性(ET50)的小麥條銹菌群體進行毒性鑒定,并利用AFLP技術對其進行遺傳多樣性分析。苗期毒性鑒定結果表明,不同省市小麥條銹菌群體的毒性基因多樣性存在一定差異,甘肅菌株群體毒性多樣性指數H值最高,為0.269 3,云南菌株群體最低,為0.150 4。遺傳多樣性結果顯示,6省市小麥條銹菌群體遺傳多樣性指數H值范圍在0.125 5～0.165 3之間,遺傳一致度GI為0.964 7～0.987 2,遺傳距離GD為0.012 9～0.036 0。三者的相關性分析表明,條銹菌群體毒性多樣性與平均ET50顯著負相關,與ET50變異系數正相關,而與遺傳多樣性沒有顯著的相關關系。

小麥條銹菌; 溫度敏感性; 毒性多樣性; 遺傳多樣性

小麥條銹病由條形柄銹菌小麥?；?PucciniastriiformisWestend. f.sp.triticiEriks.,Pst)引起,是小麥生產上危害最為嚴重的世界性病害之一,其發(fā)生范圍廣，流行成災頻率高,已成為影響小麥生產可持續(xù)性發(fā)展的限制因素[1-2]。小麥條銹病是一種典型的低溫病害,溫度是控制該病害發(fā)生、擴展和流行的主要非生物因素,條銹菌越夏期間(7月中下旬和8月上旬)旬平均溫度以不超過20℃為宜,超過23℃則完全不能越夏[3-4]。但是近年來的調查研究發(fā)現,在最熱旬旬均溫度超過23℃的年份,條銹菌也能夠越夏[5]。Milus和Mboup等在對美國和法國小麥條銹菌群體對溫度適應性的研究中發(fā)現,美國2000年后的新菌株和法國南部的菌株都對高溫具有更強的適應性,推測這些高溫耐受型菌株在小麥生長季節(jié)中持續(xù)侵染時間可能會更長,從而造成病害流行及更嚴重的產量損失[6-7]。本研究組張靜秋等[8]以病害抑制中溫度(ET50)為指標,對我國不同麥區(qū)、不同年代收集的小麥條銹菌群體的溫度敏感性進行了測定。研究發(fā)現不同地區(qū)、不同年代的小麥條銹菌株對溫度的耐受能力有較大差異,溫度低敏感型菌株對高溫表現出更強的適應性,具體表現為潛育期短、擴展速度快、產孢量高等方面。本研究將選取2010-2011年生長季溫度敏感性已經測定的78份條銹菌株進行毒性和遺傳多樣性分析,進一步研究我國小麥條銹菌群體的溫度敏感性與毒性、遺傳多樣性的關系,以期為全球氣候變暖背景下小麥條銹病的長期預測和可持續(xù)防治提供依據,也為進一步了解溫度因子對小麥條銹菌群體進化發(fā)展的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株

2010-2011年小麥生長季從甘肅、湖北、青海、四川、西藏、云南等6個省份采集78株小麥條銹菌菌株(表1),所有菌株經單孢堆分離純化、擴繁后由本實驗室保存。所有菌株的溫度敏感性均以病害抑制中溫度(ET50)為指標進行了測定[8]。

表1 供試小麥條銹菌菌株來源及病菌溫度抑制中值(ET50)信息

1.1.2 供試小麥材料

毒性鑒定選用的21個已知抗條銹病基因近等基因品系,均引自澳大利亞悉尼大學植物育種研究所,由中國農業(yè)科學院植物保護研究所麥類病害課題組繁殖保存,抗病基因名稱及其載體品系見表2。

1.2 菌株毒性鑒定

將鑒別寄主按順序點播于36 cm×25 cm的塑料盆中,每穴6～10粒,于可控常溫溫室長至幼苗第1片葉充分展開后接種條銹菌。采用無毒輕量礦物油噴濕法將小麥條銹菌新鮮夏孢子均勻接種于鑒別寄主幼苗上,接種后幼苗于(9±1)℃黑暗保濕24 h,取出后置于低溫溫室中(溫度13～16℃,濕度80%,光照強度10 000 lx,光照時間16 h/d)培育16 d,待對照品種葉片充分發(fā)病時開始調查,按0～9級標準[2]調查記載侵染型。

1.3 菌株遺傳多樣性分析

1.3.1 基因組DNA的提取

基因組DNA提取方法參照韓冰等[9]的CTAB/SDS法。

1.3.2 AFLP引物序列

本研究從12組篩選的引物中選取6組譜帶清晰、多態(tài)性及重現性好的選擇性引物來進行后期分析,分別為E12/M22、E12/M16、E22/M16、E20/M22、E22/M17和E20/M16(表3)。

68Ga-DOTA-TATE合成：用5.0 ml HCl(0.05 mol/L)淋洗68Ge/68Ga發(fā)生器，以5個1.5 ml EP管收集，選取68Ga濃度較高的第3管淋洗液用于標記；在EP管中加入47 μl HOAc-NaOAc緩沖液(1.25 mol/L)，混勻后(pH值3.5～4.5)，加入50 μl DOTA-TATE，置于100 ℃恒溫金屬浴加熱10 min。然后取出反應管室溫冷卻5 min，用薄層色譜分析法測定放化純。過無菌濾膜注入無菌密封瓶中，得到注射液。

1.3.3 AFLP分析

(1)酶切-連接 對所選樣品采用EcoRⅠ/MseⅠ雙酶切,酶切與連接反應同步進行。酶切與連接體系(20 μL)為:10×AFLP digest-ligation buffer 2 μL、AFLP digest-ligation enzyme mix 1.8 μL、EcoRI adaptor 1 μL(10 μmol/L)、MseI adaptor 1 μL(10 μmol/L)、模板DNA 5 μL。酶切-連接反應條件為25℃ 5 h,1%瓊脂糖電泳檢測。

(2)預擴增反應體系(20 μL)為:2×PCR mix 10 μL、E00 1 μL(20 μmol/L);M00 1 μL(20 μmol/L)、酶切-連接模板DNA 4 μL。PCR擴增程序為:94℃ 3 min;94℃ 30 s,50℃ 30 s,72℃ 1 min,30個循環(huán)。

(3)選擇性擴增反應體系(20 μL):2×PCR mix 10 μL、E primer 1 μL(20 μmol/L)、M primer 1 μL(20 μmol/L)、模板DNA 5 μL(預擴產物稀釋20倍)。PCR擴增程序為:95℃ 5 min; 95℃ 35 s,65℃ 35 s(每循環(huán)降低0.7℃),72℃ 1 min,12個循環(huán); 94℃ 30 s,56℃ 30 s,72℃ 1 min,23個循環(huán)。將甲酰胺與分子量內標按100∶1的體積比混勻后,取15 μL加入上樣板中,再加入1 μL稀釋10倍的PCR產物。然后使用3730XL測序儀進行毛細管電泳。

1.4 數據統計分析

毒性鑒定中,根據供試菌系在鑒別寄主上的反應,侵染型0～5(抗病,R)和6～9(感病,S)分別記作“0”和“1”,構建毒性“0-1”矩陣。AFLP分析中參照毛細管電泳圖譜,所有材料在相同遷移位置上(相同分子量片段)AFLP譜帶的有和無分別記作“1”和 “0”,構建遺傳多樣性“0-1”矩陣。

利用Popgene 1.32軟件對毒性和遺傳多樣性“0-1”矩陣分別進行分析,利用MEGA軟件構建UPGMA聚類圖。利用SAS 9.1.3軟件對小麥條銹菌群體的溫度敏感性與病菌群體遺傳多樣性、毒性多樣性和毒性基因數目進行相關性分析。

表3 AFLP引物序列

2 結果與分析

從Nei’s基因多樣性指數(H值)、Shannon指數(I值)及多態(tài)性位點數目(P)來看,甘肅群體毒性多樣性水平最高,云南群體最低。云南的平均毒性基因數目最高為15.1,西藏最低為11.6(表4)。UPGMA聚類分析表明(圖1),6省的條銹菌群體可分為3大組,甘肅、四川和青海為一組,云南與西藏為一組,湖北為一組。

表4 6省小麥條銹菌毒性多樣性和平均毒性基因數目1)

1)H: Nei’s基因多樣性指數;I: Shannon信息指數;P:多態(tài)位點百分率。

H=Nei’s gene diversity;I= Shannon’s information index;P=Percentage of polymorphic loci.

圖1 基于毒性特征的小麥條銹菌聚類圖Fig.1 Dendrogram of Puccinia striiformis based on virulent characters

2.2 小麥條銹菌群體的遺傳多樣性分析

在AFLP毛細管電泳中,篩選到的6對引物擴增出的總條帶數為824條,其中多態(tài)性條帶為645條,多態(tài)率為78.28%。由表5可知,6省的小麥條銹菌群體Nei’s基因多樣性指數H值范圍在0.125 5～0.165 3之間;Shannon指數在0.187 4～0.258 2之間,其中,青海群體的遺傳多樣性水平最低,四川群體的遺傳多樣性水平最高。由表6可知,6省(市)的小麥條銹菌群體遺傳一致度GI為0.964 7～0.987 2,遺傳距離GD為0.012 9～0.036 0,說明小麥條銹菌群體間的相似程度較高,遺傳差異較小,其中青海和甘肅群體之間的相似性(GI=0.987 2)最高,遺傳距離(GD=0.012 9)最小;云南和青海群體間的相似性(GI=0.964 7)最低,遺傳距離(GD=0.036 0)最大。

表5 不同省小麥條銹菌群體遺傳多樣性分析1)

1)Na:觀察等位基因數;Ne:有效等位基因數;H: Nei’s基因多樣性指數;I: Shannon信息指數;Np:多態(tài)性位點數;P:多態(tài)位點百分率。

Na: Observed number of alleles;Ne: Effective number of alleles;H: Nei’s gene diversity;I: Shannon’s information index;Np: Number of polymorphic loci;P: Percentage of polymorphic loci.

表6 遺傳多樣性中Nei’s無偏遺傳距離和遺傳一致度1)

1) 對角線上為遺傳一致度,對角線下為遺傳距離。

Genetic identities are above the diagonal, and genetic distances are below the diagonal.

對6個不同省78份條銹菌進行AFLP聚類分析,結果(圖2)表明,6個省的菌株可以分為4個群體。甘肅和青海群體、湖北和四川群體為一組,西藏和云南各為一組。

圖2 基于遺傳相似系數的小麥條銹菌AFLP聚類圖Fig.2 AFLP dendrogram of Puccinia striiformis based on similarity coefficients

2.3 小麥條銹菌群體對溫度敏感性、毒性和遺傳多樣性之間的相關性分析

利用SAS軟件對采自6省的小麥條銹菌群體對溫度的平均ET50、毒性多樣性、平均毒性基因數目及遺傳多樣性進行相關性分析(表7),結果表明小麥條銹菌群體平均ET50值與毒性多樣性存在顯著的負相關關系(r=-0.871 2,p=0.023 8)、ET50變異系數與毒性多樣性極顯著相關(r=0.928 9,p=0.007 4),而與平均毒性基因數目(r=-0.224 9,p=0.668 3)及遺傳多樣性(r=-0.329 6,p=0.523 5)之間不存在顯著的相關關系。小麥條銹菌毒性多樣性與遺傳多樣性(r=0.022 0,p=0.967 0)也均沒有顯著的相關關系。

3 討論

根據達爾文的進化論,物種要生存和繁衍,必須產生遺傳分化形成不同的適應性表型來適應不同的自然環(huán)境,否則就會被淘汰[10]。病原菌群體的發(fā)展進化與寄主和環(huán)境均有關,即病菌群體不但受到寄主品種的選擇產生適應性,同時非生物因子溫度也在病菌的適應性進化中起重要作用[11]。如今在全球變暖的環(huán)境形勢下,了解小麥條銹菌溫度適應性特點和規(guī)律,對于病害的防治和生態(tài)環(huán)境的保護都具有重大意義。

表7 小麥條銹菌溫度敏感性與毒性及遺傳多樣性的關系

本研究中選用的2010-2011年小麥條銹菌菌株,其標樣采集地區(qū)的年平均氣溫從高到低依次為長江中下游麥區(qū)(湖北)16.4℃、西南麥區(qū)(四川、云南、西藏)15.08℃、西北麥區(qū)(甘肅、青海)8.46℃,與各麥區(qū)小麥條銹菌群體平均ET50值排序基本一致,這表明自然條件下不同麥區(qū)小麥條銹菌群體對溫度的耐受能力有所不同,總體趨勢是緯度海拔越低,氣候越溫暖,病菌耐高溫能力越強。雖然不同麥區(qū)的初始菌源可能來自相同越夏區(qū),但通過溫暖地區(qū)高溫篩選或脅迫使得小麥條銹菌群體的耐高溫能力增強[8]。但由此帶來的代價則為該地區(qū)群體毒性多樣性的下降。研究中根據我們對溫度敏感性與毒性、遺傳多樣性的相關性分析的確發(fā)現,小麥條銹菌群體平均ET50與毒性多樣性呈顯著的負相關關系(r=-0.871 2,p=0.023 8),ET50變異系數與毒性多樣性極顯著相關(r=0.928 9,p=0.007 4),即對溫度耐受性越強的菌株群體其毒性多樣性越低,群體內菌株ET50離散程度越高其毒性多樣性越高。而溫度敏感性與遺傳多樣性沒有顯著的相關關系,這與史倩倩[12]對小麥白粉病溫度敏感性研究的結果基本一致。Mboup等[7]等對法國小麥條銹菌群體的研究結果表明,對高溫具有較強適應能力的南方菌株群體其攜帶的毒性基因數目要少于北方菌株,但是本研究發(fā)現菌株ET50與毒性基因數目沒有顯著的相關關系。本研究中,由于原始標樣采自2010-2011年,導致有些原始標樣喪失活性,從而使試驗菌株群體不夠大,在今后的研究中需要擴大樣本量,從而使數據更可靠。

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(責任編輯:田 喆)

Associations among temperature sensitivity, virulence and genetic diversity ofPucciniastriiformisf.sp.triticiduring 2010-2011

Lian Zhicheng, Liu Bo, Liu Taiguo, Gao Li, Chen Wanquan

(State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection,Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China)

To define the relationships among virulence, genetic diversity and temperature sensitivity ofPucciniastriiformisf.sp.triticiisolates, 78 isolates collected from 6 provinces during growing seasons in 2010-2011 with known ET50values were analyzed for virulence and genetic diversity by using 21 differential cultivars and AFLP technique, respectively. The result of virulence diversity at seedling stage indicated that the Nei’s gene diversity (H) of virulence in Gansu was the highest (0.269 3),and the lowest was in Yunnan (0.150 4). The genetic diversity result showed that the Nei’s gene diversity (H) was between 0.125 5 and 0.165 3, the genetic identity (GI) was between 0.964 7 and 0.987 2, and the genetic distance (GD) was between 0.012 9 and 0.036 0. The correlation analysis showed that virulence diversity was significantly and negatively correlated with the average value of ET50, and positively correlated with the coefficient of ET50variation, but not significantly correlated with genetic diversity.

Pucciniastriiformisf.sp.tritici; temperature sensitivity; virulence diversity; genetic diversity

2015-11-19

2016-02-25

國家“973”計劃(2013CB127704); 國家科技支撐計劃(2012BAD19B04); 國家轉基因生物新品種培育重大專項(2014ZX0801101B); 國家自然科學基金(31100110)；國家小麥產業(yè)技術體系崗位專家專項經費(CARS-03-04B); 旱區(qū)作物逆境生物學國家重點實驗室開放課題(CSBAA2016011)

S 435.121

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.06.010

* 通信作者 E-mail：bliu@ippcaas.cn；wqchen@ippcaas.cn