胡小梅, 徐 進, 毛連剛, 馮 潔, 曹坳程

(中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所, 植物病蟲害生物學國家重點實驗室, 北京 100193)

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7種殺菌劑對姜瘟病菌Z-AQ-2菌株的抑菌活性

胡小梅, 徐 進, 毛連剛, 馮 潔*, 曹坳程*

(中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所, 植物病蟲害生物學國家重點實驗室, 北京 100193)

青枯菌4號生理小種引起的姜瘟病是我國生姜生產(chǎn)上的巨大障礙。本研究以分離自5種不同寄主的8株青枯菌為研究對象,采用最小抑制濃度法(MIC)評價了它們的銅抗性水平,發(fā)現(xiàn)分離于山東安丘的4號小種Z-AQ-2菌株的銅抗性水平最高,為1.6 mmol/L;采用生長速率法測定了7種常用殺菌劑對Z-AQ-2菌株的室內(nèi)毒力,結果表明:3%中生菌素可濕性粉劑對姜瘟病菌的抑菌活性最高,其EC50為5.2 mg/L,其次為6%寡糖·鏈蛋白可濕性粉劑,EC50為21.2 mg/L,20%葉枯唑可濕性粉劑在3種不含銅的農(nóng)藥中EC50值最高,為58.7 mg/L,4種銅制劑抑菌效果相對較差,EC50為51.5～148.7 mg/L;進一步采用Colby法評價了葉枯唑與氫氧化銅、葉枯唑與中生菌素以及中生菌素與氨基寡糖素的混用效果,結果表明:三組藥劑的混用均可產(chǎn)生增效或加成效果。

青枯菌; 室內(nèi)毒力; Colby; 銅抗性

植物細菌性青枯病(bacterial wilt of plants)是由茄科雷爾氏菌(Ralstoniasolanacearum,簡稱青枯菌)引起的一種世界性重大病害。該病廣泛分布于熱帶、亞熱帶、溫帶甚至高緯度地區(qū),對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)構成了巨大威脅[1]。青枯菌菌系復雜多樣,依據(jù)其寄主范圍可劃分為5個不同的生理小種(race,r);根據(jù)其對3種雙糖(麥芽糖、乳糖、纖維二糖)和對3種己醇(甘露醇、山梨醇和甜醇)的氧化利用情況,可劃分為5個生化變種(biovar,bv)[2];根據(jù)內(nèi)源葡聚糖酶等核心基因的系統(tǒng)進化關系,可劃分為與地理分布密切相關的4個演化型[3]。由青枯菌4號小種引起的姜瘟病在山東、四川、重慶、貴州和廣西等地區(qū)的生姜主栽區(qū)普遍發(fā)生,常年造成的平均產(chǎn)量損失約20%～30%,重病田塊則可高達70%,甚至絕產(chǎn),成為我國生姜產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的制約瓶頸[4]。姜瘟病菌可于土壤和水體中長期存活,成為翌年的主要初侵染來源;病原菌通過生姜植株地下部根莖及根部自然空隙或傷口侵入,隨后進入維管束組織大量增殖,最終造成植株死亡。受侵染植株肉質根莖初呈水漬狀,黃褐色,內(nèi)部逐漸軟化腐爛,散發(fā)臭味,最后僅殘留外皮。由于姜瘟病菌寄主廣泛,且迄今為止生產(chǎn)上尚無抗(耐)病品種,因此該病的防治主要依賴于化學藥劑。目前國內(nèi)外廣泛應用于姜瘟病等細菌病害防治的化學農(nóng)藥主要為銅制劑。但相關研究顯示:由于長期過量使用銅制劑,已造成植物相關黃單胞菌(Xanthomonasspp.)和假單胞菌(Pseudomonasspp.)等屬的細菌出現(xiàn)了銅抗性菌株[5-6]。王英等發(fā)現(xiàn)番茄青枯病菌對氫氧化銅、喹啉銅等含銅藥劑的抗性水平已達到了高抗,對噻菌銅的抗性水平也為中抗[7]。

鑒于此,本研究于室內(nèi)離體條件下采用最小抑制濃度法,比較了分離自5個不同寄主的8株青枯菌對銅的抗性水平差異;采用生長速率法測定了7種常用殺菌劑對引起姜瘟病的青枯菌4號小種的抑菌效果,以期探明其抑菌活性;采用Colby法評價了葉枯唑和氫氧化銅、葉枯唑和中生菌素以及中生菌素和氨基寡糖素的混配效果,以期篩選獲得新型、高效、低毒的殺菌劑,為姜瘟病的科學防治提供更為有效、安全的藥劑使用參考。

1 材料和方法

1.1 供試殺菌劑

采用生產(chǎn)上常規(guī)應用的7種殺菌劑:20%葉枯唑可濕性粉劑(廣東省東莞市瑞德豐生物科技有限公司)、3%中生菌素可濕性粉劑(廣東省東莞市瑞德豐生物科技有限公司)、47%春雷·王銅可濕性粉劑(日本北興化學工業(yè)株式會社)、6%寡糖·鏈蛋白可濕性粉劑(中國農(nóng)科院植保所廊坊農(nóng)藥中試廠)、20%噻菌銅懸浮劑(浙江龍灣化工有限公司)、30%琥膠肥酸銅懸浮劑(中國農(nóng)科院植保所廊坊農(nóng)藥廠)、46%氫氧化銅水分散粒劑(美國杜邦公司)。

1.2 供試培養(yǎng)基及菌株

供試菌株及對照:于山東安丘和四川雅安姜瘟病重病田塊內(nèi),采集疑似病株的地上部假莖和地下部根莖材料,進行病原菌分離,作為試驗材料。為比較不同寄主分離的菌株間的銅抗性水平差異,以本實驗室分離保存的6株青枯菌菌株作為參照。各分離菌株和種以下分類歸屬等信息詳見表1。

供試培養(yǎng)基:青枯菌菌株常規(guī)培養(yǎng)采用普通NA培養(yǎng)基,病株樣品的青枯菌分離與鑒定使用TZC或SMSA培養(yǎng)基。發(fā)病后期腐爛程度高的樣品采用SMSA,反之則TZC培養(yǎng)基。(1)NA培養(yǎng)基:葡萄糖10 g、酵母浸膏粉0.5 g、多聚蛋白胨5 g、牛肉膏3 g,定容至1 000 mL,瓊脂18 g,pH=7,121℃滅菌20 min。(2)TZC培養(yǎng)基:NA培養(yǎng)基冷卻至50℃后,加紅四氮唑至終濃度50 mg/L。(3)SMSA培養(yǎng)基:酸水解酪蛋白1 g、細菌蛋白胨10 g、丙三醇5 mL、細菌瓊脂粉 15 g,定容至1 000 mL。121℃滅菌15 min。培養(yǎng)基冷卻至50℃后,分別加入結晶紫、硫酸多黏菌素、桿菌肽、氯霉素、青霉素和紅四氮唑至終濃度為5、100、25、5、0.5和50 mg/L。

表1 供試菌株

1.3 試驗方法

1.3.1 供試菌株的分離及PCR驗證

疑似罹病生姜根莖樣品經(jīng)自來水反復洗凈后,以70%的乙醇進行表面消毒。以滅菌解剖刀切取小塊病組織,放于滅菌水中靜置懸浮20～30 min,用接種環(huán)蘸取少量懸浮液于SMSA或TZC平板上畫線,將平板置于28℃培養(yǎng) 48～72 h,觀察分離結果。挑取典型的青枯菌野生菌落,采用青枯菌種通用特異性引物AU759f/AU760r(AU759f:gTCgCCgTCAACTCACTTTCC;AU760r:gTCgCCgTCAgCAATgCggAATCg)進行菌落PCR分子鑒定[8],鑒定陽性的菌落以接種環(huán)轉移至NA 培養(yǎng)基上,28℃培養(yǎng)48 h后保存于無菌水中備用[9]。

1.3.2 供試菌株銅抗性水平測定

采用最小抑制濃度法(minimum inhibition concentration,MIC)對供試菌株的銅耐受性水平進行評價。分別將NA平板上生長48 h的各供試菌株(表1)以滅菌水洗脫,采用比濁法[10]配制成濃度為3×108cfu/mL的菌懸液,各菌懸液取1 μL稀釋至3×105cfu/mL,分別涂布于硫酸銅終濃度為0、0.2、0.4、0.6、 0.8、1.0、1.2、1.4、1.6和1.8 mmol/L的NA平板上。30℃條件下,培養(yǎng)48～72 h后觀測菌落生長情況,以菌株能正常生長的最高濃度作為MIC值。各濃度處理重復3次。

1.3.3 供試藥劑對姜瘟病菌菌株Z-AQ-2的毒力測定

采用生長速率法測定供試殺菌劑對姜瘟病菌菌株Z-AQ-2的室內(nèi)離體抑菌活性。取10 μL濃度為3×105cfu/mL的Z-AQ-2菌懸液,加入到含有2 mL NB培養(yǎng)基的5 mL離心管中,隨后加入不同體積的供試殺菌劑母液,使之形成一定的濃度梯度。各處理重復3次,供試藥劑的濃度梯度見表2。

表2 供試殺菌劑的濃度梯度

參照張大明的方法進行抑菌率計算[11]。不含藥劑陽性對照組于180 r/min, 28℃條件下振蕩培養(yǎng)至菌液濃度A600為0.8～1.2時(即進入對數(shù)生長期),以只含藥劑的NB培養(yǎng)基進行校準,測量各處理的A600。計算各藥劑對Z-AQ-2的抑菌活性,公式如下:

抑制率(%)=(陽性對照A600-處理組A600)/陽性對照A600×100。

1.3.4 Colby法評價藥劑混用效果

取10 μL稀釋好的Z-AQ-2菌懸液加入到含有2 mL液體NB培養(yǎng)基的 5 mL離心管中,分別將20%葉枯唑可濕性粉劑和46%氫氧化銅水分散粒劑、20%葉枯唑可濕性粉劑和3%中生菌素可濕性粉劑以及3%中生菌素可濕性粉劑和6%寡糖·鏈蛋白可濕性粉劑按一定濃度比例加入到上述離心管中,各處理重復3次。以只含菌液不含藥劑的NB培養(yǎng)基為陽性對照,180 r/min、28℃振蕩培養(yǎng)至菌液濃度的A600為0.8～1.2時(即進入對數(shù)生長期),以不含菌液只含藥劑的NB培養(yǎng)基進行校準,測量各處理的A600,計算各藥劑濃度下的青枯菌存活率和理論存活率:

存活率(%)=處理組A600/陽性對照A600×100;

E0=X1·X2……Xn/100(n-1);

E0為混劑的理論存活率;n為混用殺菌劑的數(shù)量;X1表示施用第1種殺菌劑后青枯菌的存活率;X2表示施用第2種殺菌劑后青枯菌的存活率;Xn表示施用第n種殺菌劑后青枯菌的存活率。E是混劑使用后實際存活率,當E0-E>5%時,說明產(chǎn)生增效作用;當E0-E<-5%時,說明產(chǎn)生拮抗作用;當E0-E值介于±5%時,說明產(chǎn)生加成作用[12]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用DPS 9.50對各藥劑劑量的對數(shù)值和生長抑制率的幾率值進行回歸分析,計算各藥劑對青枯菌4號小種線性回歸方程的相關系數(shù)及95%置信區(qū)間。

2 結果與分析

2.1 姜瘟病菌分離鑒定結果

青枯菌在SMSA或TZC培養(yǎng)平板上生長48 h后,典型的野生型菌落形態(tài)為圓形或不規(guī)則,外緣為白色,中央為淡粉紅色(圖1)。本研究于2014年至2015年間于山東安丘和四川雅安兩地分離獲得了12個姜瘟病菌,從中選取了編號為Z-AQ-2(安丘)與Sichuan 2-2(雅安)的2個菌株為本試驗研究對象。采用青枯菌種特異性檢測引物AU759f/AU760r的鑒定結果顯示:各供試菌株均可擴增獲得片段大小約280 bp條帶(圖2)。

圖1 姜瘟病菌菌株的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of Ralstonia solanacearum on SMSA medium

圖2 引物AU759f/AU760r對供試菌株的 PCR擴增結果Fig.2 PCR amplification results of pathogenic bacterial strains using primers AU759f/AU760r

2.2 供試菌株銅抗性水平測定結果

采用MIC法對不同寄主上分離的青枯菌菌株進行銅抗性水平鑒定。結果顯示,從不同寄主上分離的菌株對硫酸銅的抗性水平差異明顯。其中,從馬鈴薯上分離的3號小種菌株PO41和POYN(5-4-1)在8株青枯菌菌株中對銅的抗性水平最低, 其MIC值均為0.6 mmol/L;從生姜上分離的4號小種菌株Z-AQ-2和Sichuan 2-2對銅的抗性水平最高,其MIC值分別為1.6 mmol/L和1.2 mmol/L,分別高于和等于報道的耐金屬貪銅菌CH34菌株的MIC值(1.2 mmol/L)[13];從煙草上分離的1號小種菌株Tb43和從番茄上分離的1號小種菌株Tm1的MIC值分別0.8 mmol/L、1.2 mmol/L;從桑樹上分離的5號小種菌株m11和m2的MIC值分別為0.6 mmol/L和1.0 mmol/L(圖3)。

2.3 殺菌劑對姜瘟病菌菌株Z-AQ-2的毒力測定結果

2.3.1 不含銅殺菌劑之間抑菌活性比較

3種不含銅殺菌劑中,中生菌素和氨基寡糖素均屬于抗生素類殺菌劑,葉枯唑屬噻唑類殺菌劑。其中,3%中生菌素可濕性粉劑對姜瘟病菌菌株Z-AQ-2的抑菌活性最強,其EC50為5.2 mg/L;6%寡糖·鏈蛋白可濕性粉劑次之,EC50為21.2 mg/L;20%葉枯唑可濕性粉劑抑菌活性相對較差,EC50為58.7 mg/L(表3)。

2.3.2 含銅殺菌劑之間抑菌活性比較

表3結果顯示:4種含銅殺菌劑中,無機銅對Z-AQ-2菌株的抑菌活性總體上優(yōu)于有機銅。各供試殺菌劑抑菌效果從高至低依次為:47%春雷·王銅可濕性粉劑,EC50為51.1 mg/L;46%氫氧化銅水分散粒劑,EC50為62.9 mg/L;30%琥膠肥酸銅懸浮劑,EC50為147.2 mg/L, 20%噻菌銅懸浮劑,EC50為148.7 mg/L。

圖3 供試菌株對銅離子的MIC值Fig.3 MIC value of the tested strains

2.3.3 含銅與不含銅的殺菌劑之間的抑菌活性比較

表3結果進一步揭示出供試抗生素類和噻唑類殺菌劑的抑菌效果明顯優(yōu)于含銅殺菌劑,且抗生素類殺菌劑的抑菌效果高于噻唑類殺菌劑。其中對青枯菌4號小種Z-AQ-2菌株抑菌效果最好的是3%中生菌素可濕性粉劑,它是一種已登記用于姜瘟病防治的殺菌劑;其次是6%寡糖·鏈蛋白可濕性粉劑,它雖沒有登記作為姜瘟病的防治藥劑,但已有報道其對青枯病有良好的防治效果[14]。

表3 7種殺菌劑對姜瘟病菌菌株Z-AQ-2的EC50測定結果

2.4 Colby法對葉枯唑和氫氧化銅、葉枯唑和中生菌素以及中生菌素和氨基寡糖素的混用效果評價

2.4.1 葉枯唑與中生菌素混用組合對姜瘟病菌菌株Z-AQ-2的抑菌效果

表4顯示:在處理劑量下20%葉枯唑可濕性粉劑對Z-AQ-2的抑制率約為20%～40%,3%中生菌素可濕性粉劑對Z-AQ-2的抑制率約為25%～75%,各濃度組合后對Z-AQ-2的抑制率約為40%～93%之間,參照Colby 法對復配結果進行簡單檢驗,結果表明:當葉枯唑和中生菌素混用時Eo-E介于±5%之間,2種殺菌劑的混用對Z-AQ-2的聯(lián)合作用類型屬于加成作用。

表4 葉枯唑和中生菌素混用組合對姜瘟病菌菌株Z-AQ-2的抑菌效果檢驗(Colby法)

2.4.2 葉枯唑與氫氧化銅混用組合對姜瘟病菌菌株Z-AQ-2的抑制效果

由表5可知,在處理劑量下20%葉枯唑可濕性粉劑對Z-AQ-2的抑制率約為20%～40%,46%氫氧化銅水分散粒劑對Z-AQ-2的抑制率約為50%～55%,各濃度組合后對Z-AQ-2的抑制率約在90%～97%之間。Colby法檢驗結果表明:當葉枯唑和中生菌素混用時Eo-E值大于5%,2種殺菌劑的混用對Z-AQ-2的聯(lián)合作用類型屬于增效作用。

2.4.3 氨基寡糖素與中生菌素混用組合對姜瘟病菌菌株Z-AQ-2的抑菌效果

表6中的結果顯示:在處理劑量下6%氨基寡糖素可濕性粉劑對Z-AQ-2的抑制率約為20%～30%,3%中生菌素可濕性粉劑對Z-AQ-2的抑制率約為15%～50%,各濃度組合后對Z-AQ-2的抑制率約在40%～70%之間,參照Colby 法對復配結果進行簡單檢驗,結果表明:當氨基寡糖素與中生菌素混用時Eo-E值大于5%,2種殺菌劑的混用對Z-AQ-2的聯(lián)合作用類型屬于增效作用。

表5 葉枯唑和氫氧化銅混用組合對姜瘟病菌菌株Z-AQ-2的抑菌效果檢驗(Colby法)

表6 氨基寡糖素和中生菌素混用組合對姜瘟病菌菌株Z-AQ-2的抑菌效果檢驗(Colby法)

3 結論和討論

銅制劑在植物病害防治中的應用已有超過百年的歷史,特別是植物細菌性病害,在缺乏經(jīng)濟有效替代產(chǎn)品的情況下,銅制劑至今仍是細菌病害防控的主要藥劑。但長期對銅制劑的過度依賴,銅抗性菌株已在包括西瓜嗜酸菌、丁香假單胞菌和野油菜黃單胞菌等多種植物病原細菌中發(fā)現(xiàn)。青枯菌菌系變異類型較多,且栽培寄主植物缺乏抗性品種。因此,我國青枯病的防治主要依賴于使用銅制劑和農(nóng)用鏈霉素進行灌根處理。特別是在姜瘟病的防治中,生姜生產(chǎn)企業(yè)和農(nóng)戶大多長期、單一、過量的使用噻菌銅、氫氧化銅等銅制劑。目前青枯菌對銅抗性的相關報道雖不多見,但番茄青枯病GMI1000菌株中攜帶了與丁香假單胞菌高度同源的銅抗性基因簇[15]。因此本研究首先比較了不同寄主來源的青枯菌菌株間的銅耐受性水平差異,結果表明:分離于安丘單季作生姜主栽區(qū)的姜瘟病菌株Z-AQ-2對銅的耐受程度最高,達到1.6 mmol/L, 分離自四川雅安的姜瘟病菌株Sichuan 2-2和分離自廣州番茄的菌株Tm1次之,均為 1.2 mmol/L。

殺菌劑的室內(nèi)離體抑菌效果通常以抑菌中濃度EC50作為衡量指標,測定方法通?？煞譃?類:1)基于測量抑菌圈直徑的碟片法或打孔法;2)基于測量細菌培養(yǎng)液A600值的生長速率法;3)基于計量菌落數(shù)的平板培養(yǎng)法。本研究前期使用打孔法的試驗結果顯示:部分供試殺菌劑僅可在遠高于田間推薦用量的條件下,產(chǎn)生抑菌效果,且加藥孔內(nèi)有明顯的藥劑殘留痕跡。因此推測有些殺菌劑由于劑型、水溶性及其有效成分在培養(yǎng)基凝膠結構中的擴散速度等原因,以該方法評價獲得的結果不能反映出其真實毒力效果。劉曉妹等在防治番茄青枯病的復配劑篩選研究中同樣觀察到以打孔法無法準確評價5種殺菌劑的毒力差異[16]。因此本研究在隨后的研究中采用了生長速率法評價供試殺菌劑毒力效果。

試驗中殺菌劑對姜瘟病菌株Z-AQ-2毒力測定結果顯示:4種含銅殺菌劑的EC50為51.1～148.7 mg/L(表3),均顯著高于中生菌素和氨基寡糖素,表明含銅藥劑對姜瘟病菌的離體生測效果不理想;其中,抗生素春雷霉素和銅的復配劑春雷·王銅是供試銅制劑中EC50最低的,也是唯一一個抑菌效果優(yōu)于葉枯唑的殺菌劑。國內(nèi)相關研究結果表明，抗生素與銅的復配劑不僅對離體青枯菌抑制效果優(yōu)于單劑,且對田間青枯病的防效也同樣高于單劑[17-18]。本研究對殺菌劑簡單復配的結果也發(fā)現(xiàn)當銅制劑與葉枯唑進行混用時能有效提高抑菌效率,這為減少銅制劑的使用,減緩病原菌抗藥性的發(fā)展以及提高農(nóng)藥的使用效率提供了一個良好發(fā)展的方向。

中生菌素和氨基寡糖素在本研究中表現(xiàn)出相當強的離體抑菌效果,EC50分別為5.2 mg/L和21.2 mg/L。作為我國農(nóng)藥毒性分級標準中的低毒抗生素類殺菌劑,中生菌素和氨基寡糖素不僅對病原微生物的增殖具有抑制作用,且能誘導寄主植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性[19-20]。大田和溫室試驗生測結果表明:中生菌素和氨基寡糖素對水稻白葉枯病、柑橘細菌性潰瘍病、番茄青枯病、西瓜枯萎病、棉花黃萎病、番茄晚疫病、煙草病毒病、黃瓜白粉病、生菜立枯病等均有良好的防效[21]。

本研究結果顯示殺菌作用機理不同的中生菌素和氨基寡糖素對姜瘟病菌的室內(nèi)毒力活性顯著高于傳統(tǒng)銅制劑,該結果為姜瘟病田間防治的藥劑輪換、殺菌劑復配提供了有價值的參考依據(jù),并有助于延緩姜瘟病菌銅抗性菌株的產(chǎn)生。

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(責任編輯:楊明麗)

Antibacterial activity of seven bactericides to Ralstonia solanacearum strain Z-AQ-2

Hu Xiaomei, Xu Jin, Mao Liangang, Feng Jie, Cao Aocheng

(Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Beijing 100193, China)

Bacterial wilt of edible ginger caused byRalstoniasolanacearumrace 4 is a severe threat to the production of ginger. EightR.solanacearumstrains isolated from 5 plant species were selected to investigate their copper resistance phenotype. The results showed that the strain Z-AQ-2 ofR.solanacearumrace 4 had the highest resistance to copper compounds, with the MIC value of 1.6 mmol/L.The study also examined the bacteriostatic activity of seven bactericides commonly used in the field. The results showed that 3% zhongshengmycin WP had the highest inhibition rates among the seven bactericides, with the EC50value of 5.2 mg/L, followed by 6% oligosaccharins WP and 20% bismerthiazol WP, with the EC50values of 21.2 mg/L and 58.7 mg/L, respectively. We evaluated the bacteriostatic activity of bismerthiazol plus copper hydroxide, bismerthiazol plus zhongshengmycin, and oligosaccharins plus zhongshengmycin by the method of Colby and the results showed that all the three mixtures had good synergism effect.

Ralstoniasolanacearum; toxicity; Colby; copper resistance

2015-12-25

2016-02-04

國家自然科學基金(31272008,31371908,31571975); 公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201303015); 國家科技支撐計劃(2015BAD08B03)

S 436.32

B

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.06.038

* 通信作者 E-mail: jfeng@ippcaas.cn;caoac@vip.sina.com