邵考珍 何淑瑩

紫背天葵的高效液相色譜法指紋圖譜分析

邵考珍 何淑瑩

目的 探討紫背天葵的高效液相色譜法（HPLC）指紋圖譜。方法 采用色譜柱Shim-pack VP-ODS（250 mm× 4.6 mm，5 μm）；以0.5%H3pO4（V/V）為流動相A，以50 %乙腈為流動相B（V/V），進(jìn)行梯度洗脫；流速為0.8 ml/min；柱溫30 ℃；檢測波長為280 nm；進(jìn)樣量10 μl；運行時間為80 min。理論板數(shù)按矢車菊素-3-O-葡萄糖苷計算，不得低于3000。結(jié)果 建立了紫背天葵的HPLC指紋圖譜。討論 采用HPLC構(gòu)建“紫背天葵”指紋圖譜，探討指紋圖譜的技術(shù)要點及檢測條件，以能反映該品種整體特征的HPLC指紋圖譜作為質(zhì)量評價方法，對現(xiàn)有質(zhì)量控制方法作出積極而又必要的補充和提高，為建立統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)奠定基礎(chǔ)，從而建立新的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

紫背天葵；高效液相色譜法；指紋圖譜

紫背天葵是秋海棠科秋海棠屬的多年生無莖草本植物，別名為紅天葵、紅葉、紅水葵、散血子等，分布于中國的廣東、福建、江西、海南、香港、湖南、廣西、浙江等地，生長于海拔700m至1120m的地區(qū)，一般生長于懸崖石縫中、山地山頂疏林下石上、山頂林下潮濕巖石上及山坡林下。其可做清涼飲料，具有清熱解毒、涼血活血及潤肺止咳的功效，主治暑熱高熱、肺熱咳嗽咯血、跌打扭傷、血瘀疼痛、瘡毒疥癬、水火燙傷等[1-3]。近年來，隨著研究的逐步開展，紫背天葵的新作用和用途不斷被發(fā)現(xiàn)?，F(xiàn)代研究表明，紫背天葵主要含有大量花色苷、黃酮苷、氨基酸、活性多糖化合物、生物堿和微量元素等有效活性成分，以矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、矢車菊-3-O-蕓香糖苷等花色苷為主要活性化學(xué)成分[4-8]。目前，相關(guān)研究報道除少量藥理研究外，主要集中于不同成分的提取及穩(wěn)定性研究上，而對質(zhì)量控制和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究極其罕見[9]，對高效液相色譜法（HPLC）指紋圖譜的研究則未見報道。由于市面上紫背天葵的質(zhì)量良莠不齊，不同產(chǎn)地的紫背天葵療效差距較大，本研究擬采用HPLC構(gòu)建紫背天葵的指紋圖譜，以便建立能反映該品種整體特征的質(zhì)量評價方法，從而保證中藥質(zhì)量穩(wěn)定、保證臨床療效和使用安全，同時更有利于開發(fā)新的臨床應(yīng)用，促進(jìn)資源有效的規(guī)范化和規(guī)?；_發(fā)利用。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 Agilent 1200高效液相色譜儀，包括四元

泵、脫氣機、二極管陣列檢測器、柱溫箱；Chemstation工作站；HN-1006型超聲波清洗機（廣州市華南超聲設(shè)備有限公司）。

1.2 藥品與試劑 矢車菊素-3-O-葡萄糖苷對照品（Hyphytochem公司，批號：20160201，純度：≥98%）；甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑為分析純，水為高純水。廣東、廣西、湖南、福建等不同產(chǎn)地的紫背天葵經(jīng)廣州市皮膚病防治所副主任中藥師龍惠鑒定，均為秋海棠科秋海棠屬干燥全草。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備 取紫背天葵藥材粉碎并過40目篩。精密稱取粉末1 g，置于具塞錐形瓶中，精密加甲醇25 ml，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min。取出，冷卻至室溫，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減少重量。搖勻，濾紙濾過，再以0.45 μm濾膜濾至進(jìn)樣瓶，即為供試品溶液。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取矢車菊素-3-O-葡萄糖苷對照品適量，加甲醇制成0.1 mg/ml溶液，避光保存，作為對照品溶液。

2.3 色譜條件 色譜柱：Shim-pack VP-ODS（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；以0.5% H3pO4（V/V）為流動相A，50%乙腈為流動相B（V/V），按表1程序進(jìn)行梯度洗脫；流速：0.8 ml/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：280 nm；進(jìn)樣量：10 μl；運行時間：80 min。理論板數(shù)按矢車菊素-3-O-葡萄糖苷計算，不低于3000。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序表

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗 取同一批紫背天葵供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。以矢車菊素-3-O-葡萄糖苷為參照峰，計算主要色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。結(jié)果顯示，各色譜峰的相對保留時間的RSD%≤0.1%，相對峰面積的RSD%＜1%。另以第1次測定的色譜圖為參照，使用相似度計算軟件計算相似度，相似度平均值為0.999。試驗結(jié)果表明，該方法的精密度良好（表2）。

表2 精密度試驗結(jié)果(相對峰面積)

2.4.2 穩(wěn)定性試驗 取同一份紫背天葵供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、18、24 h進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。以矢車菊素-3-O-葡萄糖苷為參照峰，計算主要色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD。結(jié)果顯示，各色譜峰的相對保留時間的RSD%＜1%，相對峰面積的RSD%＜3%。另以第1次測定的色譜圖為參照，使用相似度計算軟件計算相似度，相似度平均值為0.910。表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好（表3）。

2.4.3 重復(fù)性試驗 取同一批供試品6份分別進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。以矢車菊素-3-O-葡萄糖苷為參照峰，計算主要色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD。結(jié)果顯示，各色譜峰的相對保留時間的RSD%＜1%，相對峰面積的RSD%＜3%。另以第1份測定的色譜圖為參照，使用相似度計算軟件計算相似度，相似度平均值為0.900。結(jié)果見表4。

表3 穩(wěn)定性試驗結(jié)果(相對峰面積)

表4 重復(fù)性試驗結(jié)果(相對峰面積)

2.5 指紋圖譜及解析

2.5.1 共有峰標(biāo)記 通過對10批紫背天葵進(jìn)行了指紋圖譜的分析，以矢車菊素-3-O-葡萄糖苷為參考峰，標(biāo)定了25個共有峰。分別為1號（5.230 min）、2號（7.750 min）、3號（8.078 min）、4號（10.143 min）、5號（11.204 min）、6號（12.717 min）、7號（14.934 min）、8號（16.201 min）、9號（16.603 min）、10號（16.944 min）、11號（18.091 min）、12號（18.660 min）、13號（19.315 min）、14號（19.671 min）、15號（22.826 min）、16號（26.049 min）、17號（39.656 min）、18號（39.853 min）、19號（42.168 min）、20號（42.451 min）、21號（43.811 min）、22號（45.055 min）、23號（46.220 min）、24號（47.421 min）、25號（50.276 min）。見圖2。

2.5.2 相似度計算 本研究采用中國藥典委員會推薦的中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004年A版），對10批不同產(chǎn)地的紫背天葵樣品HPLC圖譜進(jìn)行評價，通過與系統(tǒng)生成的對照圖譜進(jìn)行比較，得到各種來源的供試品相似度在0.309～0.968。結(jié)果見表5及圖1～3。

表510 批不同產(chǎn)地的紫背天葵樣品相似度

3 討論

3.1 供試品制備方法的考察 根據(jù)文獻(xiàn)資料，曾試驗以體積分?jǐn)?shù)分別為50%、60%、70%、80%、90%、

100%的甲醇為溶劑。從HPLC圖譜看，50%甲醇HPLC圖譜雜質(zhì)最多、基線不平，其他濃度依次改善，100%甲醇最佳。采用超聲30 min的方法進(jìn)行提取，操作簡單、圖譜特征穩(wěn)定。

圖1 矢車菊素-3-O-葡萄糖苷對照品HPLC色譜圖

圖2 紫背天葵樣品的HPLC指紋圖譜

圖310 批不同產(chǎn)地的紫背天葵HPLC色譜圖

3.2 色譜條件的優(yōu)化 曾試驗過的流動相系統(tǒng)有以下兩種：①乙腈-（0.1%～0.5%）磷酸溶液；②（0.1%～0.5%）磷酸溶液-50%乙腈，經(jīng)過試驗發(fā)現(xiàn)：0.5%磷酸溶液-50%乙腈按表1的程序進(jìn)行梯度洗脫，所得色譜峰的數(shù)量、分離度、分布均勻程度最高。以每分鐘0.8 ml的流速至80 min時色譜峰已完全洗脫。

3.3 小結(jié) 采用HPLC構(gòu)建“紫背天葵”指紋圖譜，以能反映該品種整體特征的HPLC指紋圖譜作為質(zhì)量評價方法，對現(xiàn)有質(zhì)量控制方法作出積極而又必要的補充和提高，為建立統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)奠定基礎(chǔ)，從

而可以建立新的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，更進(jìn)一步加強對紫背天葵的質(zhì)量控制，保證臨床用藥的安全有效，開發(fā)新的臨床應(yīng)用，促進(jìn)資源有效的規(guī)范化和規(guī)?；_發(fā)。

[1] 中華人民共和國國家藥典委員會.中國藥典[M].北京∶中國醫(yī)藥科技出版社,2010.

[2] 中華人民共和國國家醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會.中華本草[M].上海∶上?？萍汲霭嫔?2000∶493-495.

[3] 中國中藥編輯委員會.中國本草[M].上海∶上?？茖W(xué)技術(shù)出版社, 2000∶495.

[4] 段志芳,章煒中,黃麗華.紫背天葵多糖提取與含量測定[J].中成藥,2007,29(2)∶274-276.

[5] 許旋,盧忠,羅一帆.對不同等級紫背天葵微量元素含量的測定[J].廣東微量元素科學(xué),2000,7(4)∶55-57.

[6] 劉巍然,周法興.紫背天葵水提液析出物化學(xué)成分研究[J].中國藥學(xué)雜志,1991,26(8)∶467-468.

[7] 李紅纓,楊海貴,植中強.紫背天葵紅色素理化性質(zhì)的研究[J].肇慶學(xué)院學(xué)報,2002,23(2)∶76-79.

[8] 崔蕊靜,申淑琦,郭朔.復(fù)合酶協(xié)同微波處理提取紫背天葵葉片總黃酮工藝[J].中國食品學(xué)報,2014,14(2)∶72-77.

[9] 譚雄斯,王景.紫背天葵研究進(jìn)展[J].中國民族民間醫(yī)藥,2012, 21(14)∶40-41.

Analysis of high performance liquid chromatography Semiaquilegia fingerprint

Shao Kaozhen He Shuying

Objective To study high performance liquid chromatography of Begonia fimbristipula (HPLC) fingerprint. Methods Uses the chromatographic column Shim-pack VP-ODS(250 mm×4.6 mm,5 μm);H3pO4at 0.5%(V/V)as mobile phase A,with 50% acetonitrile as mobile phase B(V/V),with gradient elution;The flow rate of 0.8 ml/min;column temperature 30 ℃;detection wavelength of 280 nm;ample quantity 10 μl;the running time of 80 min.Theoretical plate number according to the knapweed-3-O-glycosidase calculation,is not less than 3000.Result The HPLC fingerprint of Begonia fimbristipulata Hance is established.Conclusion The significance of establish the Begonia fimbristipulata Hance HPLC fingerprint:use the High performance liquid chromatography (HPLC)to construct "Begonia fimbristipulata Hance"fingerprint,discusses the technical key points of fingerprints and testing conditions,to reflect the overall characteristics of the HPLC fingerprint of breed as quality evaluation method,respond positively to the existing quality control method and the necessary supplement and improve,in order to establish the quality standard of unified foundation,so as to set a new standard of quality.

Begonia fimbristipulata Hance;HPLC;Fingerprint

R927.11

A 【DOI】10.12010/j.issn.1673-5846.2016.11.003

佛山市南海區(qū)第七人民醫(yī)院，廣東 528247

邵考珍（1975-），主管中藥師。研究方向：中藥HPLC指紋圖譜