張 莉 朱瑋亞

（昆明醫(yī)科大學(xué)海源學(xué)院機(jī)能學(xué)實(shí)驗(yàn)室，昆明650106）

響應(yīng)面法優(yōu)選黃芩芍藥湯提取工藝

張 莉 朱瑋亞*

（昆明醫(yī)科大學(xué)海源學(xué)院機(jī)能學(xué)實(shí)驗(yàn)室，昆明650106）

目的優(yōu)選黃芩芍藥湯藥提取工藝。方法以提取次數(shù)、提取時(shí)間、加水量為自變量，以黃芩苷、芍藥苷含量綜合評(píng)分為響應(yīng)值，采用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)選提取工藝參數(shù)。結(jié)果最佳工藝條件為10倍量50%乙醇混合提取2次，每次1.0 h。結(jié)論優(yōu)選的提取工藝穩(wěn)定、可行。

藥對(duì)；黃芩；白芍；混合提取工藝；響應(yīng)面法

黃芩芍藥湯源自《傷寒論》，處方由黃芩、白芍、甘草、大棗組成。方中黃芩苦寒，清熱止利；芍藥味酸，斂陰和營(yíng)止痛；甘草、大棗和中緩急。諸藥合用，共奏清熱止利，和中止痛之功。黃芩、白芍為處方中的主藥，黃芩和白芍單獨(dú)提取工藝的研究多見(jiàn)于文獻(xiàn)[1-4]，而黃芩與白芍混合提取工藝的研究報(bào)道較少。

目前響應(yīng)面法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于中藥提取工藝研究[5-8]，該方法通過(guò)對(duì)響應(yīng)值和響應(yīng)因素之間進(jìn)行非線性的多元多次回歸；通過(guò)擬合方程進(jìn)行優(yōu)化，并且可以對(duì)模型的可靠程度進(jìn)行檢測(cè)，更加適合中藥制劑生產(chǎn)當(dāng)中多指標(biāo)、復(fù)雜成分提取工藝的優(yōu)選。本研究擬使用響應(yīng)面法優(yōu)選黃芩芍藥湯的提取工藝，為經(jīng)方黃芩芍藥湯的開發(fā)打下基礎(chǔ)。

1 儀器和試藥

1.1 儀器LC-2010A高效液相色譜儀（CLASS-VP數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，二極管陣列檢測(cè)器，BS 210S電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）；METTLERAE240型十萬(wàn)分之一電子天平（瑞士）；DHG-9076A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；KQ-500DV型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DZKW-4電子恒溫不銹鋼水浴鍋（上海東星建材試驗(yàn)設(shè)備有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵（鞏義市英峪予華儀器廠）；SZ-93自動(dòng)雙重純水蒸餾器（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 試劑芍藥苷對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)110736-201035）；黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)110715-200212）；甲醇(色譜純，天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司，批號(hào)110901)；磷酸二氫鉀（分析純，廣州化學(xué)試劑廠，批號(hào)21100621）。

1.3 飲片白芍、黃芩、大棗、甘草飲片均購(gòu)自昆明菊花園中藥材專業(yè)市場(chǎng)。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 色譜條件AgilentTC-C18(2)(4.6×250 mm)；以甲醇∶水∶醋酸（35∶64∶1）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)：244 nm；柱溫：30℃；流速為1 mL·min-1。理論塔板數(shù)以黃芩苷、芍藥苷計(jì)均大于2000。

2.2 混合對(duì)照品溶液制備精密稱取黃芩苷對(duì)照品3.46 mg、芍藥苷3.02 mg分別置于25 mL容量瓶中，用色譜甲醇定容至刻度，搖勻后取等體積混合（黃芩苷0.0692 mg·mL-1、芍藥苷0.0604 mg·mL-1）。

2.3 供試品溶液制備稱取黃芩、白芍、甘草、大棗粗粉各3 g，按照正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的條件進(jìn)行提取，每次提取后離心（4000 r·min-1，5 min）取上清液定容至250 mL容量瓶中，再精密量取1 mL定容至50 mL容量瓶中，色譜甲醇定容至刻度，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備取混合對(duì)照品溶液分別進(jìn)樣1 μL，3 μL，5 μL，7 μL，9 μL，測(cè)定峰面積值，并以進(jìn)樣量(x)對(duì)峰面積值(y)回歸，結(jié)果表明在芍藥苷

在0.0604~0.5436 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=802469.4x+1014.8，r=1.0；黃芩苷在0.0692~ 0.6228 μg線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=1437518x+ 16081.9，r=0.9999。

2.4.2 精密度試驗(yàn)取混合對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次，每次5 μL，計(jì)算峰面積積分值，黃芩苷RSD為2.79%；芍藥苷RSD為2.02%，結(jié)果表明精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)取樣品1份，精密稱定，按照供試品溶液的制備方法制備，分別放置0 h，2 h，4 h，6 h，8 h后進(jìn)樣，進(jìn)樣量為10 μL，積分色譜峰峰面積，計(jì)算黃芩苷、芍藥苷含量變化情況，黃芩苷RSD為2.45%，芍藥苷RSD為2.56%，結(jié)果表明樣品在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn)取同一批樣品5份，按照供試品溶液的制備方法制備，分別進(jìn)樣10 μL，積分色譜峰峰面積，計(jì)算得黃芩苷平均含量為15.80%，RSD為2.96%；芍藥苷平均含量為3.05%，RSD為2.24%，表明重復(fù)性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn)精密稱定已知黃芩苷、芍藥苷含量的樣品粉末6份，每份各0.12 g，每?jī)煞莘謩e加入黃芩苷對(duì)照品溶液（12.70 mg.mL-1）1.2 mL，1.5 mL，1.8 mL，芍藥苷對(duì)照品溶液（1.21 mg.mL-1）2.4 mL，3.0 mL，3.6 mL，10倍量水提取兩次，每次1.5 h，提取后離心（4000 r·min-1，5 min）取上清液定容至250 mL容量瓶中，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，分別進(jìn)樣10 μL，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 黃芩苷、芍藥苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.5 提取工藝優(yōu)選在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以醇濃度、溶劑用量、提取時(shí)間為自變量，以黃芩苷、芍藥苷含量綜合評(píng)分為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)三因素三水平中心復(fù)合實(shí)驗(yàn)，因素水平表見(jiàn)表2。按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案混合提取黃芩白芍湯，按2.3項(xiàng)下制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定黃芩苷、芍藥苷含量，實(shí)驗(yàn)安排及結(jié)果見(jiàn)表3；采用Design Expert 8.06軟件對(duì)所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 提取工藝中心復(fù)合實(shí)驗(yàn)因素水平

2.5.2 正交試驗(yàn)結(jié)果取9份樣品，按照正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表中的方法水浴回流提取，以黃芩苷、芍藥苷含量權(quán)重系數(shù)分別為0.5計(jì)算綜合評(píng)分為響應(yīng)值為指標(biāo)，分析乙醇濃度、乙醇用量、提取時(shí)間、提取次數(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案及分析結(jié)果(%)

表4 回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)

2.2.2 建立模型方程及響應(yīng)面分析Design Expert 8.06軟件擬合得黃芩苷和芍藥苷的綜合評(píng)分對(duì)加水量、提取時(shí)間、提取次數(shù)的二次多項(xiàng)回歸方程為：Y=89.44+ 1.46A-2.68B+11.79C-0.96AB-0.77AC-2.28BC+0.70A2-3.38B2-5.75C2。

由表3可知模型回歸P值＜0.0001，說(shuō)明模型回歸顯著可靠；失擬誤差P值為23.42＞0.59，說(shuō)明失擬度不明顯；相關(guān)系數(shù)R2=0.9758，調(diào)整值為0.9446，說(shuō)明該方程擬合度較高，該模型可以預(yù)測(cè)黃芩湯藥湯混合提取工藝過(guò)程。根據(jù)二次多項(xiàng)式方程，分別繪制各指標(biāo)與響應(yīng)值交互項(xiàng)的響應(yīng)曲面圖，用來(lái)確定各因素對(duì)黃芩湯藥湯提取工藝綜合評(píng)分的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1～圖3。

圖1 加水量、提取對(duì)黃芩白芍湯藥對(duì)提取綜合評(píng)分交互影響的三維響應(yīng)面圖

圖2 加水量、提取次數(shù)對(duì)黃芩白芍湯藥對(duì)提取綜合評(píng)分交互影響的三維響應(yīng)面圖

圖3 提取時(shí)間、提取次數(shù)對(duì)黃芩白芍湯藥對(duì)提取綜合評(píng)分交互影響的三維響應(yīng)面圖

從圖4～6的等高線形狀可看出，提取時(shí)間、浸泡時(shí)間、加水量相互之間的交互作用不顯著；根據(jù)等高線密度變化提取次數(shù)對(duì)黃芩湯提取綜合評(píng)分影響提取時(shí)間、加水量大，對(duì)黃芩芍藥湯提取綜合評(píng)分具有顯著影響（P＜0.01）。

2.2.3 提取條件優(yōu)化根據(jù)Design Expert 8.06軟件分析黃芩芍藥湯藥對(duì)提取綜合評(píng)分最佳提取工藝條件為：加水量11.94倍，提取時(shí)間1.03，提取次數(shù)2.99次，黃芩芍藥湯的理論提取綜合評(píng)分為98.943。結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)確定優(yōu)化提取工藝為12倍加水量提取三次，每次1 h。

2.4 驗(yàn)證性試驗(yàn)取3批樣品，按照優(yōu)選的提取工藝進(jìn)行提取，計(jì)算平均黃芩芍藥湯提取綜合評(píng)分為98.236 ml，RSD值為1.32%，與預(yù)測(cè)值偏差較小，說(shuō)明優(yōu)選的提取工藝穩(wěn)定可靠。

3 討論

有文獻(xiàn)報(bào)道[9]芍藥苷在高溫煎煮過(guò)程當(dāng)中所含的苯甲酸酯鍵，受熱易分解或受其它成分干擾，含量會(huì)下降。本實(shí)驗(yàn)過(guò)程發(fā)現(xiàn)，煎煮時(shí)間增長(zhǎng)，反而不利于芍藥苷的提取，可能正是芍藥苷分解引起的。運(yùn)用HPLC同時(shí)測(cè)定黃芩、白芍中黃芩苷、芍藥苷含量，測(cè)定方法的方法學(xué)考察結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確、可靠，可以作為黃芩苷、芍藥苷含量同時(shí)測(cè)定的方法。中藥提取工藝研究中許多為多種中藥飲片一起提取，采用多指標(biāo)評(píng)價(jià)，所優(yōu)選的提取工藝可以節(jié)約成本、提高效率。本研究對(duì)黃芩芍藥湯的提取工藝進(jìn)行研究，為經(jīng)發(fā)的開發(fā)打下基礎(chǔ)。

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Extraction Technology of Huangqin Shaoyao Decoction by Using Box-Behnken Response Surface Method

ZHANG Li,ZHU Weiya*
(Haiyuan College,Kunming Medical University,Kunming 650106,China)

Objective To optimize extraction technology of Huangqin Shaoyao decoction.Methods The contents of baicalin,paeoniflorin as indicators,we used orthogonal methods to investigate the influence of extraction times,extraction time,the amount of solvent, ethanol concentration on the Scutellaria baicalensiss,Radix Paeoniae Alba extraction technology.Results The optimum conditions were 10 times the amount of 50%ethanol extraction two times,with 1.0 h in each time.Conclusion The optimized process condition was scientific,stable and feasible.

couplet medicines;Scutellaria baicalensiss;Radix Paeoniae Alba;hybrid extraction technology;response surface method

10.3969/j.issn.1672-2779.2016.21.058

1672-2779（2016）-21-0132-03

：李海燕本文校對(duì)：冀新威

2016-06-27）

*通訊作者：86640282@qq.com