安夢婷， 吾拉木·馬木提,， 馬海梅,， 張峰波， 王紅英， 趙 慧， 丁劍冰

(新疆醫(yī)科大學1基礎(chǔ)醫(yī)學院， 烏魯木齊 830011; 2省部共建國家重點實驗室培育基地—新疆重大疾病醫(yī)學重點實驗室;

?

·基礎(chǔ)醫(yī)學研究·

細粒棘球蚴AgB1、AgB2、AgB4抗原表位的特性分析

安夢婷1， 吾拉木·馬木提1,2， 馬海梅1,2， 張峰波2,3， 王紅英2， 趙 慧2,3， 丁劍冰2

(新疆醫(yī)科大學1基礎(chǔ)醫(yī)學院， 烏魯木齊 830011;2省部共建國家重點實驗室培育基地—新疆重大疾病醫(yī)學重點實驗室;

3第一附屬醫(yī)院檢驗科, 烏魯木齊 830054)

目的 分析新疆細粒棘球蚴AgB1、AgB2、AgB4蛋白的氨基酸序列，了解其蛋白二級結(jié)構(gòu)特點，預(yù)測抗原表位，為包蟲病的進一步免疫學診斷和研究提供理論支持。方法 利用生物信息分析軟件DNAstar分析3種抗原的蛋白二級結(jié)構(gòu)特點，運用在線軟件IEDB對3種抗原各參數(shù)進行綜合分析并預(yù)測其抗原表位。結(jié)果 EgAgB1、EgAgB2和EgAgB4分別是由78、90、91個氨基酸殘基組成的不同多肽。其蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中均有α-螺旋、β-折疊、轉(zhuǎn)角區(qū)域和卷曲區(qū)域。綜合分析各參數(shù)推測EgAgB1具有2個抗原表位，分別是14～23位氨基酸殘基(DDGLTSTSRS)、37～42位氨基酸殘基(RDPLGQ)。推測EgAgB2的2個抗原表位分別為41～49位氨基酸殘基(DFFRNDPLG)、83～90位氨基酸殘基(EEKDDDSk)。EgAgB4可能含有的2個抗原表位分別是43～50位氨基酸殘基(RSDPLGQR)、84～89位氨基酸殘基(EEEDDS)。結(jié)論 采用生物信息技術(shù)對新疆細粒棘球蚴AgB1、AgB2、AgB4進行B細胞表位特點的研究和分析，對更準確診斷包蟲病具有重要意義。

細粒棘球蚴; AgB; 生物信息技術(shù)； B細胞表位

細粒棘球絳蟲(Echinococcus granulosus Batsch 1786)是屬帶科、棘球?qū)?。成蟲主要寄生于犬科食肉動物，而幼蟲(棘球蚴)主要寄生于人和多種食草類家畜等動物，能夠引起一種嚴重的人獸共患病[1-2]，稱棘球蚴病或包蟲病(echinococcosis， hydatid disease, hydatidosis)。人類囊型包蟲病已成為至關(guān)重要的公共健康問題[3-5]。囊型包蟲病通常起病隱匿，幾年內(nèi)可以毫無癥狀。另外，目前還未出現(xiàn)有效預(yù)防該病的疫苗[6]。傳統(tǒng)方法治療囊型包蟲病局限于手術(shù)切除囊腫，然而這種方法對于多器官囊腫或者腦組織脊髓等風險較大的部位是不切實際的[7]。

我國是棘球蚴病流行最嚴重的國家之一，主要存在于我國西部和北部廣大農(nóng)牧區(qū)，包括新疆、寧夏、青海、四川、甘肅、西藏和內(nèi)蒙7個省區(qū)。據(jù)幾個重點流行省區(qū)的不完全統(tǒng)計，全國受棘球蚴病威脅的人口總數(shù)約5 000萬，患病人數(shù)為50～60萬，而人群中最易受到感染的是學齡前兒童[8]。主要中間宿主是綿羊，其感染率為3.3%～90%，而家犬的感染率為7%～71%[8]。

EgAgB抗原存在于細粒棘球蚴囊液中，具有高度的抗原性和免疫原性[9]，因此被廣泛研究。研究顯示，EgAgB是由多態(tài)多基因家族編碼，由EgAgB1～EgAgB5 共5個亞基構(gòu)成[10]。有研究通過調(diào)查不同地區(qū)細粒棘球蚴的特點，提出EgAgB至少有10種獨特的基因，其中有3～4種不同的基因與EgAgB3和EgAgb4有關(guān)[11]。AgB 是一個組成復雜的抗原蛋白家族，如果使用單一來源或者單一組分抗原對疾病進行診斷，其敏感性和特異性都不穩(wěn)定，甚至差異也較大[12]。EgAgB 在寄生蟲中的作用機制還不明確，其可能在細粒棘球蚴脂質(zhì)新陳代謝中起到一定作用。但是其在免疫調(diào)節(jié)活動中特別是固有免疫起到重要作用[13]。因此，本研究旨在通過研究EgAgB1、EgAgB2和EgAgB4抗原表位，為包蟲病的免疫學診斷提供更進一步的理論支持。

1 材料與方法

1.1 EgAgB1、EgAgB2及EgAgB4抗原氨基酸序列 根據(jù)NCBI GenBank EgAgB1 的AAV52691、EgAgB2的ACC85503.1、EgAgB3的AAS88254.1進行抗原分析及表位預(yù)測。

1.2 EgAgB1、EgAgB2及EgAgB4抗原的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測對比分析 運用DNAstar軟件包在計算機上進行蛋白質(zhì)分析，將從GenBank中已經(jīng)獲得的EgAgB1、EgAgB2及EgAgB4氨基酸序列導入Protean軟件，對其蛋白的二級結(jié)構(gòu)和抗原表位進行分析預(yù)測，通過Garnier-Robson方法和Chou-Fasman方法分別分析EgAgB1、EgAgB2及EgAgB4抗原的α-螺旋，β-折疊，轉(zhuǎn)角區(qū)域和卷曲區(qū)域。

1.3 EgAgB1、EgAgB2及EgAgB4抗原B細胞表位分析預(yù)測 使用IEDB(Immune Epitope Data. base, http://tools. Immuneepitope. Org/main/html/tcell_tools. Html)在線分析軟件，將從GenBank中已經(jīng)獲得的EgAgB1、EgAgB2及EgAgB4氨基酸序列輸入IEDB軟件中，并分別運用Emini方法預(yù)測抗原表面可及性，Karplus-Schulz方法預(yù)測其骨架柔韌性，并綜合分析親水性，抗原性及線性表位等多種參數(shù)對其進行B細胞表位的分析預(yù)測，并預(yù)測其可能的B細胞表位區(qū)域。

2 結(jié)果

2.1 EgAgB1、EgAgB2及EgAgB4抗原Blast分析結(jié)果 測序后發(fā)現(xiàn)，EgAgB1、EgAgB2和EgAgB4分別是由78、90、91個氨基酸殘基組成的多肽。

2.2 EgAgB1、EgAgB2及EgAgB4抗原二級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析 運用DNAstar軟件，通過Garnier-Robson方法和Chou-Fasman綜合方法分析EgAgB1、EgAgB2及EgAgB4抗原二級結(jié)構(gòu)區(qū)域見圖1和表1。

表1 EgAgB1、EgAgB2、EgAgB4抗原二級結(jié)構(gòu)區(qū)域

圖1 EgAgB1、EgAgB2和EgAgB4抗原的二級結(jié)構(gòu)

2.3 轉(zhuǎn)角區(qū)域的分析比較 經(jīng)IEDB軟件分析轉(zhuǎn)角區(qū)域(圖2)，分別列出EgAgB1、EgAgB2和EgAgB4轉(zhuǎn)角區(qū)域指數(shù)較高的20個區(qū)段(表2)，比較三者轉(zhuǎn)角區(qū)域出現(xiàn)位置，發(fā)現(xiàn) EgAgB2和EgAgB4 轉(zhuǎn)角區(qū)域區(qū)段有較多相似性，而EgAgB1轉(zhuǎn)角區(qū)域主要出現(xiàn)在12～24、35～44、67～72區(qū)段附近。

表2 EgAgB1、EgAgB2和EgAgB4轉(zhuǎn)角區(qū)域比較

2.4 表面可及性分析比較 分析比較EgAgB1、EgAgB2和EgAgB4表面可及性較高的前20個區(qū)段(表3)，并結(jié)合圖3，EgAgB2和EgAgB4表面可及性較高區(qū)段較為相似，EgAgB2表面可及性指數(shù)較高可能出現(xiàn)在83～88、20～25和33～38區(qū)段附近。EgAgBg4主要是82～87、21～26和32～37區(qū)段。 EgAgB1表面可及性較高區(qū)域主要集中在59～63、18～23、32～37區(qū)段附近。

表3 EgAgB1、EgAgB2和EgAgB4表面可及性區(qū)段比較

2.5 骨架柔韌性區(qū)段分析比較 分別獲得EgAgB1、EgAgB2和EgAgB4骨架柔韌性指數(shù)較高的前20個區(qū)段(表4)，結(jié)合圖4，比較發(fā)現(xiàn)EgAgB1骨架柔韌性指數(shù)較高區(qū)段主要出現(xiàn)在17～23、38～44和11～17區(qū)段附近。EgAgB2主要在83～89、20～26和44～50區(qū)段附近。EgAgB4的骨架柔韌性指數(shù)較高主要位于82～88、43～49和20～26區(qū)段附近。

表4 EgAgB1、EgAgB2和EgAgB4柔韌性區(qū)段比較

2.6 抗原區(qū)段的比較分析 分析比較EgAgB1、EgAgB2和EgAgB4抗原性較高的前20個區(qū)段(表5)，結(jié)合圖5，提示EgAgB1抗原性較高的區(qū)段主要集中在4～10、42～48和54～60區(qū)段。EgAgB2抗原性較高主要集中在12～18、62～68和73～79區(qū)段附近。EgAgB4抗原性較高區(qū)段在12～18和6～12附近。

2.7 親水性區(qū)段比較 分析EgAgB1、EgAgB2和EgAgB4親水性指數(shù)較高的前20個區(qū)段(表6)，結(jié)合圖6，提示EgAgB1親水性較高的區(qū)段主要集中在10～16、36～42和18～24附近。EgAgB2親水性較高主要在83～89、19～25和44～50區(qū)段附近。EgAgB5的親水性較高區(qū)段位于83～89、19～25和43～49附近。

表5 EgAgB1、EgAgB2和EgAgB4抗原區(qū)段比較

表6 EgAgB1、EgAgB2和EgAgB4親水性區(qū)段比較

a: EgAgB1 b: EgAgB2 C: EgAgB4

圖2 轉(zhuǎn)角區(qū)域指數(shù)分析

2.8 B細胞抗原表位預(yù)測 綜合分析EgAgB1、EgAgB2及EgAgB4的轉(zhuǎn)角區(qū)域指數(shù)、表面可及性、骨架柔韌性指數(shù)、抗原性指數(shù)和親水性指數(shù)，并結(jié)合DNAstar Protean軟件對其蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的分析，分別預(yù)測其可能的B細胞表位區(qū)域，綜合分析各參數(shù)推測EgAgB1具有2個抗原表位，分別為14～23(DDGLTSTSRS)、37～42(RDPLGQ)。推測EgAgB2的2個抗原表位分別為41～49(DFFRNDPLG)、83～90(EEKDDDSk)。EgAgB4可能含有的2個抗原表位分別為43～50(RSDPLGQR)、84～89(EEEDDS)。

a: EgAgB1 b: EgAgB2 C: EgAgB4

圖3 表面可及性指數(shù)分析

a: EgAgB1 b: EgAgB2 C: EgAgB4

圖4 骨架柔韌性指數(shù)分析

a: EgAgB1 b: EgAgB2 C: EgAgB4

圖5 抗原指數(shù)分析

a: EgAgB1 b: EgAgB2 C: EgAgB4

圖6 新水性指數(shù)分析

3 討論

有證據(jù)顯示，EgAgB在同一蟲體生命周期的不同發(fā)育階段，不同組織基因表達水平也都明顯不同。EgAgB1～EgAgB4主要在幼蟲階段表達，而EgAgB5表達于成蟲階段。并且，在幼蟲階段EgAgB1、EgAgB2、EgAgB4高表達于生發(fā)層，在其他發(fā)育階段幾乎不表達[11]。而EgAgB3在蟲體所有階段均有表達，并且表達水平在發(fā)育階段呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢。比較EgAgB不同亞基的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)EgAgB1、EgAgB3、EgAgB5的氨基酸序列相似性較高[11]。Obal等[14]的研究顯示，在提純的EgAgB抗原中，EgAgB1的含量是最高的，而EgAgB4的含量較少,提示EgAgB2不是唯一含量最高的脂蛋白。Monteiro等[15]通過提取來自人和牛體內(nèi)的寄生蟲樣本研究EgAgB抗原。結(jié)果也顯示EgAgB1、EgAgB2、EgAgB3、EgAgB4在各樣本中均有表達。張海濤等[16]研究發(fā)現(xiàn)EgAgB1在細粒棘球蚴的生發(fā)層大量表達。Jiang等[17]對EgAgB抗原的5個亞單位的血清反應(yīng)性進行了分析，認為EgAgB1、 EgAgB2和EgAgB4是識別血清抗體的主要反應(yīng)性亞單位。

運用生物信息學技術(shù)方法對蛋白質(zhì)相關(guān)信息進行分析處理比較，并且預(yù)測其抗原表位，已經(jīng)成為免疫學研究的重要手段之一。本研究采用DNAstar 軟件和IEDB在線軟件對EgAgB1、EgAgB2及EgAgB4蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)及B細胞表位特點進行了分析和預(yù)測。本研究發(fā)現(xiàn)，在蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的分析中，EgAgB1、EgAgB2及EgAgB4抗原的α-螺旋的比例均較高，而EgAgB2和EgAgB4抗原的轉(zhuǎn)角區(qū)域較EgAgB1比例稍高，提示EgAgB2和EgAgB4形成抗原表位的可能性會稍大一點。運用IEDB軟件對蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)角區(qū)域指數(shù)、表面可及性、骨架柔韌性指數(shù)、抗原性指數(shù)和親水性指數(shù)進行分析，并分別選出20個指數(shù)較高的區(qū)段。親水性指數(shù)越高暴露于表面的幾率越大，成為抗原表位的可能性越大。表面可及性越大，蛋白質(zhì)抗原中氨基酸殘基被溶劑分子接觸的可能性就越大。而蛋白質(zhì)骨架柔韌性越高，發(fā)生扭曲折疊的幾率就越大?？乖院玫碾亩?，可能作為抗原表位。綜合分析各參數(shù)推測EgAgB1具有2個抗原表位：14～23(DDGLTSTSRS)和37～42(RDPLGQ)。推測EgAgB2的2個抗原表位分別為41～49氨基酸殘基(DFFRNDPLG)，83～90氨基酸殘基(EEKDDDSk)。EgAgB4可能含有的2個抗原表位分別為43～50氨基酸殘基(RSDPLGQR)、84～89氨基酸殘基(EEEDDS)。從該結(jié)論中可以看出EgAgB2和EgAgB4的預(yù)測表位位置極為相近，與EgAgB1幾乎不存在相似關(guān)系。計算出EgAgB2和EgAgB4相對應(yīng)的氨基酸序列的相似度，得出2個抗原表位的相似度分別為57%和67%。有相關(guān)研究也表明EgAgB2和EgAgB4的氨基酸序列具有70%同源性[18]，猜測EgAgB2和EgAgB4可能部分共同的抗原表位。

總之，通過對EgAgB1、EgAgB2及EgAgB4蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)及B細胞表位特點的分析和預(yù)測，根據(jù)蛋白質(zhì)和RNA數(shù)據(jù)，推測EgAgB1、EgAgB2和EgAgB4在宿主體內(nèi)細粒棘球蚴慢性感染中可能具有特殊且重要的作用,為進一步診斷包蟲病提供理論依據(jù)。

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(本文編輯 楊晨晨)

Analysis of epitopes of AgB1, AgB2 and AgB4 epitopes of Echinococcus granulosus

AN Mengting1, Wulamu Mamuti1,2, MA Haimei1,2, ZhANG Fengbo2,3, WANG Hongying2, ZHAO Hui2,3, DING Jianbing2

(1DepartmentofImmunology,BasicMedicalCollege，Urumqi830011，2StateKeyLaboratoryIncubationBaseofXinjiangMajorDiseasesResearch,3DepartmentofClinicalLaboratoryoftheFirstAffiliatedHospital,Urumqi830054,China)

Objective To analyze EgAgB1, EgAgB2 and EgAgB4 amino acid sequence of the recombinant protein to understand their protein secondary structure prediction epitope to provide theoretical support for further immunological diagnosis and research on hydatid disease. Methods Bioinformatics analysis software DNAstar was used to analyze the protein secondary structure features of three antigens, and the online software IEDB was applied for analyze each of the three antigens parameters and predict their epitopes. Results EgAgB1, EgAgB2 and EgAgB4 are polypeptide consisting of 78, 90 and 91 amino acid residues respectively, all which possess α-helix, β-folded corner area and curling area in Protein secondary structure. Comprehensive analysis presumed EgAgB1 parameter contains two epitopes: amino acid fragment of 14-23 (DDGLTSTSRS) and 37-42 (RDPLGQ), EgAgB2 contains two epitopes: amino acid fragment of 41-49 (DFFRNDPLG) and 83-90 (EEKDDDSk), and EgAgB4 contains two epitopes: amino acid fragment of 43～50 (RSDPLGQR) and 84～89 (EEEDDS). Conclusion It is meaningful for more accurate diagnosis of hydatid disease that B cell epitopes feasures of EgAgB1, EgAgB2 and EgAgB4 were analyzed.

Echinococcus granulosus; AgB; bioinformatics; B cell epitope

國家自然科學基金(81160202，81460307，81660343); 新疆維吾爾自治區(qū)包蟲病重點實驗室基金項目(XJDX0202-2010-04)

安夢婷(1992-)，女，在讀碩士，研究方向：寄生蟲免疫。

丁劍冰，女，博士，教授，博士生導師，研究方向: 感染免疫，E-mail：djbing002@sina.com。

R392.1

A

1009-5551(2016)12-1541-07

10.3969/j.issn.1009-5551.2016.12.015

2016-09-28]