單增天，田岳鳳*，李雷勇，吳愛花，王軍

（1.山西中醫(yī)學(xué)院針灸推拿學(xué)院，山西太原030619；2.山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，山西太原030001）

·針灸推拿·

不同灸法對(duì)免疫抑制兔脾臟指數(shù)及細(xì)胞因子的影響

單增天1，田岳鳳1*，李雷勇2，吳愛花1，王軍1

（1.山西中醫(yī)學(xué)院針灸推拿學(xué)院，山西太原030619；2.山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，山西太原030001）

目的觀察不同灸法對(duì)環(huán)磷酰胺所致免疫抑制兔脾臟指數(shù)及細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2及IL-4的影響。方法將大耳白兔50只隨機(jī)分為空白組、模型組、隔藥餅灸組、艾灸組和假藥餅灸組5組。除空白組外，其余4組均腹腔注射環(huán)磷酰胺60 mg/kg，造成免疫抑制模型。3個(gè)治療組分別給予隔藥餅灸、艾灸、假藥餅灸治療，隔日灸，共灸10次。治療結(jié)束次日動(dòng)物麻醉，取動(dòng)物脾臟計(jì)算其脾臟指數(shù)，采用ELISA法測(cè)定勻漿上清液中IFN-γ、IL-2、IL-4含量。結(jié)果環(huán)磷酰胺造模后，脾臟指數(shù)與空白組比較顯著升高，差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），3個(gè)治療組脾臟指數(shù)與模型組比較差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），與空白組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與空白組比較，艾灸組IFN-γ、IL-4明顯降低，模型組、假藥餅組IL-4明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較，艾灸組IFN-γ明顯降低，隔藥餅灸組IL-4顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論不同灸法對(duì)免疫抑制兔脾臟指數(shù)均有調(diào)節(jié)作用；隔藥餅灸可使因環(huán)磷酰胺所致下降的IL-4顯著提升。

環(huán)磷酰胺；隔藥餅灸；艾灸；脾臟指數(shù)；細(xì)胞因子

艾灸防病治病在我國(guó)已有數(shù)千年歷史，現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)艾灸有提高機(jī)體免疫功能的作用，可改善機(jī)體的免疫抑制狀態(tài)。隔藥餅灸是將藥物、艾灸、穴位三者有機(jī)結(jié)合作用于機(jī)體，本文從這一角度研究隔藥餅灸對(duì)免疫抑制兔機(jī)體脾臟指數(shù)及細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4的影響，并與艾灸組及假藥餅組相比較,為艾灸提高機(jī)體免疫力提供明確的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)促進(jìn)臨床艾灸的發(fā)展和進(jìn)步。

1　材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

大耳白兔50只，北京昌揚(yáng)西山養(yǎng)殖場(chǎng)提供（動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（京）2011-0010），體質(zhì)量（2.5± 0.3）kg，雌雄不限。飼養(yǎng)溫度：20～25℃，濕度：50%～70%。

1.2主要藥物、試劑和儀器

清艾條：江蘇盱眙華佗中藥廠（批號(hào)：Z32020153）；注射用環(huán)磷酰胺（CTX）：200 mg/瓶，山西普德藥業(yè)股份有限公司（批號(hào):H14023686）；0.9%NaCl注射液500 mL：石家莊四藥有限公司；酶聯(lián)免疫試劑盒：上海酶聯(lián)生物科技有限公司；勻漿機(jī)：美國(guó)PRO科學(xué)股份有限公司；離心機(jī)：長(zhǎng)沙高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

2　方法

2.1實(shí)驗(yàn)方法

2.1.1動(dòng)物造模將50只大耳白兔隨機(jī)分為5組，每組10只，分別為空白組、模型組、隔藥餅灸組、艾灸組和假藥餅灸組。動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，模型組、隔藥餅灸組、艾灸組和假藥餅灸組均腹腔注射環(huán)磷酰胺60 mg/kg（環(huán)磷酰胺用0.9%NaCl注射液稀釋），連續(xù)7 d，每天上午造模，造成免疫抑制模型，空白組注射等量0.9%NaCl注射液。

2.1.2穴位選擇神闕、關(guān)元、足三里（雙）、脾俞（雙）、腎俞（雙）。穴位定位參照林文注主編《實(shí)驗(yàn)針

灸學(xué)》［1］常用動(dòng)物穴位定位法及擬人比照法。

2.1.3藥物制作按六味地黃丸組方劑量將熟地黃、山茱萸、山藥、澤瀉、牡丹皮、茯苓粉碎，過120目篩備用，用75%酒精將藥物粉末調(diào)勻用模具制作藥餅，直徑1 cm、厚0.3 cm；假藥餅原料采用面粉，制作方法與藥餅相同。

2.1.4施灸方法施灸前將動(dòng)物穴位處皮毛剪去，將其固定于兔臺(tái)。將清艾條折斷，取出艾絨，制成大小相等，底徑0.8 cm、高0.5 cm的圓錐形艾柱，置于藥餅和假藥餅上，以線香點(diǎn)燃，燃盡更換，每穴連灸3壯，隔日灸，共灸10次；將3壯艾柱量的艾絨制作成小艾條，置于自制艾灸架在穴位施灸。隔日灸，共灸10次。

2.2樣品采集及處理

治療結(jié)束次日，耳緣靜脈麻醉，解剖取出脾臟，稱取脾臟質(zhì)量。取中段脾臟0.5 g左右放入試管，剪碎，按照每克組織加入9 mL PBS溶解，放入勻漿機(jī)中勻漿，離心20 min，2 500 r/min，收集上清液備用。

2.3指標(biāo)觀察

脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量（g）/兔子體質(zhì)量（kg）×10。

采用ELISA法檢測(cè)脾臟勻漿上清液中IFN-γ、IL-2、IL-4的含量。

2.4數(shù)據(jù)處理

全部數(shù)據(jù)由統(tǒng)計(jì)人員采用SAS8.2統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行專業(yè)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)“±s”表示，采用單因素方差分析（one way-ANOVA）并進(jìn)行組間比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3　結(jié)果

3.1不同灸法對(duì)脾臟指數(shù)的影響

與空白組比較，模型組脾臟指數(shù)顯著升高，差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），隔藥餅組、艾灸組和假藥餅組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與模型組比較，空白組、隔藥餅組、艾灸組和假藥餅組差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.01）。說明不同灸法對(duì)脾臟指數(shù)的改變均有調(diào)節(jié)作用。見表1。

表1　不同灸法對(duì)免疫抑制兔脾臟指數(shù)的影響（±s,mg/g）

表1　不同灸法對(duì)免疫抑制兔脾臟指數(shù)的影響（±s,mg/g）

注：與空白組比較◆◆P﹤0.01；與模型組比較**P﹤0.01。

組別空白組模型組隔藥餅組艾灸組假藥餅組F值P值n 10 10 10 10 10脾臟指數(shù)4.13±1.10** 5.60±1.50◆◆3.79±1.04** 3.74±1.06** 3.59±1.04** 5.03﹤0.01

3.2不同灸法對(duì)細(xì)胞因子的影響

與空白組比較，艾灸組IFN-γ、IL-4明顯降低，模型組、假藥餅組IL-4明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；IL-2差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。與模型組比較，隔藥餅灸組IL-4顯著升高，艾灸組IFN-γ降低明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。表明隔藥餅灸對(duì)免疫因子IL-4的良性調(diào)整作用。見表2。

表2　不同灸法對(duì)免疫抑制兔IFN-γ、IL-2、IL-4的影響（±s,mg/L）

表2　不同灸法對(duì)免疫抑制兔IFN-γ、IL-2、IL-4的影響（±s,mg/L）

注：與空白組比較◆P﹤0.05；與模型組比較*P﹤0.05。

組別空白組模型組隔藥餅組艾灸組假藥餅組F值P值n 10 10 10 10 10 IFN-γ 1 092.95±231.61* 874.20±79.32 986.75±134.11 800.45±303.81◆* 990.50±161.61 3.28﹤0.05 IL-2 5.93±1.12 4.93±0.70 5.22±0.63 5.30±1.39 5.66±0.74 1.65﹥0.05 IL-4 121.61±18.88* 105.21±14.30◆120.95±11.91* 103.16±13.67◆105.66±17.65◆3.48﹤0.05

4　討論

脾臟是機(jī)體最大的免疫器官，占全身淋巴組織總量的25%，含有大量的B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，是免疫細(xì)胞居住和產(chǎn)生應(yīng)答的重要產(chǎn)所。脾臟還具有合成和分泌細(xì)胞因子、補(bǔ)體等作用，因此脾臟指數(shù)的高低能夠較為客觀地反應(yīng)機(jī)體的免疫能力。細(xì)胞因子主要由免疫細(xì)胞合成、分泌的一類具有廣泛生物學(xué)活性的小分子蛋白質(zhì)。白細(xì)胞介素、干擾素是重要的細(xì)胞因子，主要參與機(jī)體免疫應(yīng)答、免疫細(xì)胞分化發(fā)育等。INF-γ即Ⅱ型干擾素，主要由活化的T細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生，具有廣泛的生物學(xué)活性。IFN-γ具有激活巨噬細(xì)胞并促進(jìn)其功能和激活中性粒細(xì)胞功能和NK細(xì)胞殺傷力等作用。IL-2主要由CD4+和CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生，NK細(xì)胞和轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞亦可產(chǎn)生。IL-2具有多種生物學(xué)作用，最早被稱為T細(xì)胞生長(zhǎng)因子，是引起T細(xì)胞增殖的主要細(xì)胞因子；IL-2還可刺激NK細(xì)胞的生長(zhǎng)和增強(qiáng)他們的殺傷能力，并激發(fā)B細(xì)胞生長(zhǎng)及產(chǎn)生抗體；IL-2在體內(nèi)是參與免疫應(yīng)答的重要細(xì)胞因子，并參與炎癥反應(yīng)。IL-4主要由Th2細(xì)胞產(chǎn)生，可刺激活化B細(xì)胞和T細(xì)胞增殖、CD4+T細(xì)胞分化成II型輔助T細(xì)胞，它也在調(diào)節(jié)體液免疫和適應(yīng)性免疫中起關(guān)鍵作用，誘導(dǎo)B細(xì)胞抗體類別轉(zhuǎn)換向IgE，上調(diào)第二型主要組織兼容性復(fù)合體的產(chǎn)生。在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)方面，INF-γ、IL-2、IL-4起著重要的生物學(xué)作用。

有實(shí)驗(yàn)研究表明，環(huán)磷酰胺能夠造成脾臟和胸腺明顯萎縮，進(jìn)而降低脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)，還可以降低IL-2、IL-4、TNF-α和INF-γ等細(xì)胞因子，使機(jī)體體液免疫和細(xì)胞免疫功能下降[2]。但也有實(shí)驗(yàn)研究表明，環(huán)磷酰胺可使脾臟指數(shù)顯著升高，并抑制正常小鼠DTH程度、NK細(xì)胞活性及細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ分泌水平[3]。環(huán)磷酰胺的免疫抑制作用，隨著時(shí)間的推移，其免疫抑制作用慢慢消失，脾臟指數(shù)出現(xiàn)代償性增高[4-5]。本實(shí)驗(yàn)研究中，環(huán)磷酰胺造模結(jié)束后，脾臟代償性增大，模型組脾臟指數(shù)明顯高于空白組，隔藥餅組、艾灸組和假藥餅組脾臟指數(shù)降低明顯，接近空白組，表明三種治療方法均可拮抗環(huán)磷酰胺免疫抑制作用，減少環(huán)磷酰胺的毒性作用，使脾臟指數(shù)在較短的時(shí)間內(nèi)恢復(fù)到正常水平。

神闕穴可溫通陽(yáng)氣、回陽(yáng)救逆，關(guān)元穴為元陰元陽(yáng)之氣閉藏之門戶，灸關(guān)元可壯元陽(yáng)、補(bǔ)腎精、益骨髓；足陽(yáng)明胃經(jīng)之合穴為足三里，根據(jù)《內(nèi)經(jīng)》“合治內(nèi)腑”的理論，凡六腑之病皆可用之，具有調(diào)理脾胃、補(bǔ)中益氣、通經(jīng)活絡(luò)、扶正祛邪的作用；脾俞、腎俞為均為背俞穴，是脾臟和腎臟氣血匯聚之地，長(zhǎng)灸之可健脾益氣、滋陰補(bǔ)腎。實(shí)驗(yàn)研究表明，艾灸腎俞、足三里等穴可以提高環(huán)磷酰胺導(dǎo)致的小鼠免疫功能損傷和脾臟指數(shù)降低，對(duì)小鼠脾臟起到修復(fù)和保護(hù)作用[6]。艾灸肝俞、脾俞、腎俞能增強(qiáng)脾淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化能力、增加血清IL-2和TNF-α含量，改善機(jī)體免疫功能[7]。實(shí)驗(yàn)觀察表明，灸腎俞穴能提高正常及免疫功能低下小鼠胸腺、脾臟指數(shù)及IL-1、IL-2的含量，增強(qiáng)和調(diào)節(jié)免疫功能的作用[8]。逆針灸關(guān)元可調(diào)節(jié)脾臟組織細(xì)胞HSP 70及其基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)血清免疫因子IL-2、TNF-α的含量，對(duì)調(diào)整更年期免疫功能紊亂具有一定作用[9]。

六味地黃丸為滋補(bǔ)腎陰的經(jīng)典名方，能促進(jìn)胸腺細(xì)胞增殖及抑制脾細(xì)胞凋亡，提高機(jī)體的免疫功能[10]。六味地黃湯能多途徑增強(qiáng)氫化可的松所致免疫功能低下小鼠免疫功能[11]，對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠脾細(xì)胞IFN-γ、IL-4和IL-10mRNA的表達(dá)具有明顯促進(jìn)作用，對(duì)IL-2mRNA的表達(dá)具有顯著抑制作用，對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠脾臟表達(dá)的細(xì)胞因子水平有調(diào)節(jié)作用，發(fā)揮糾正機(jī)體平衡紊亂的作用[12]，并可抑制燙傷后大鼠腹腔巨噬細(xì)胞TN F分泌和降低血清IL-6水平，對(duì)燙傷引起的大鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬活性、脾臟淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化增殖、分泌IL-2、NK細(xì)胞活性抑制有不同程度的拮抗作用，從而調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能[13]。

隔藥餅灸是臨床常用灸法之一，是將中藥與艾灸有機(jī)結(jié)合的一種方法，具有艾灸、藥物、腧穴三重效應(yīng)，通過艾灸的溫?zé)嶙饔么龠M(jìn)皮膚對(duì)滋陰補(bǔ)腎藥物的吸收，經(jīng)經(jīng)絡(luò)傳輸從而發(fā)揮藥物歸經(jīng)之效能。我們十余年的臨床研究結(jié)果充分表明隔藥餅灸對(duì)機(jī)體免疫功能的良好調(diào)節(jié)作用[14-16]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，造模后IFN-γ含量低于空白組，IL-4含量明顯低于空白組（P＜0.05），表明動(dòng)物免疫功能受到抑制。隔藥餅灸神闕、關(guān)元、足三里（雙）、脾俞（雙）、腎俞（雙）后，免疫抑制兔脾臟組織中IFN-γ、IL-4含量明顯回升，與空白組比較差異不明顯，免疫抑制兔脾臟指數(shù)恢復(fù)到接近正常水平，表明隔藥餅灸可調(diào)節(jié)IFN-γ、IL-4含量，提高免疫抑制兔的免疫功能。艾灸組和假藥餅灸組IL-4含量與模型組比較無(wú)明顯差異，與空白組差異顯著，說明艾灸組、假藥餅灸治療效果不佳。然而不同灸法對(duì)IL-2含量無(wú)明顯影響，同時(shí)，艾灸組IFN-γ含量明顯低于模型組，出現(xiàn)這一結(jié)果是否與艾灸量有關(guān)？或是樣本含量不夠大？值得我們?cè)谙乱徊降难芯恐猩钊胩接憽?/p>

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（本文編輯 匡靜之）

Influence of Different Moxibustion on Spleen Index and Cytokines in Immunosuppressive Model Rabbits

SHAN Zengtian1,TIAN Yuefeng1*,LI Leiyong2,WU Aihua1,WANG Jun1
(1.Acupuncture and Massage College of Shanxi University of Traditional Chinese Medicine,Shanxi,Taiyuan 0306191,China; 2.The Second Hospital of Shanxi Medical University,Shanxi,Taiyuan 030001,China)

Objective To observe the inhibitory effect of differentmoxibustion methods on rabbit spleen index,the contents of IFN-γ,IL-2 and IL-4 in cyclophosphamide induced immunosuppression model rabbits.Methods The 50 rabbits were randomly divided into five groups,namely black group,model group,herb-cake-separated moxibustion group,moxibustion group,sham-cakeseparated moxibustion group.In addition to the black group,the other four groups were injected with cyclophosphamide 60 mg/kg to make immunosuppressive model.Three treatment groups were respectively given herb-cake-separated moxibustion,moxibustion, sham-cake-separated moxibustion treatment every other day,for 10 times.The next day after finished moxibustion,the animals were anesthetized,the spleen index was detected,the IFN-γ,IL-2,IL-4 in supernatant of spleen homogenate were determined by ELISA.Results Compared with the black group,the spleen index of model group was significantly higher, it was statistically significant(P＜0.01).The spleen index in the three treatment group was statistically significant comparing with the model group(P＜0.01),while the diffrence between the treatment groups and blank group was not statistically significant(P＞0.05).Compared with the blank group,the IFN-γand IL-4 in the moxibustion group were lower significantly, the IL-4 in model group and sham-cake-separated group was reduced,the differences were statistically significant(P＜0.05).Compared with the model group,the content of IFN-γwas decreased in moxibustion group,and the content of IL-4 increased in herb-cake-separated moxibustion group was increased,the differences were statistically significant(P＜0.05).Conclusion Different moxibustion shows a regulating effect on spleen index in immunosuppressive rabbits.The herb-cakeseparated moxibustion could significantly increase the decline content of IL-4 induced by cyclophosphamide.

cyclophosphamide;herb-cake-separated moxibustion;moxibustion;spleen index;cytokines

R245.8

A

10.3969/j.issn.1674-070X.2016.11.022

2016-06-17

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81373742）。

單增天，男，在讀碩士研究生，研究方向：艾灸防治疾病。

*田岳鳳，女，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail:tyfsx@163.com。